本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)。具體是一種高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
番茄灰霉病是蔬菜番茄上的重要病害，可給番茄生產(chǎn)造成重大損失。該病害由灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染造成。分生孢子是灰霉病菌的無性繁殖體，在番茄灰霉病的病害循環(huán)和病害流行中發(fā)揮重大作用。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分生孢子也是番茄灰霉病研究不可缺少的材料。有關(guān)孢子的形成發(fā)育生理、對(duì)不良環(huán)境的生存適應(yīng)性或抵抗性，孢子與寄主的識(shí)別互作反應(yīng)等研究，都需要使用孢子形態(tài)的材料；新型防治藥物研發(fā)方面的有關(guān)研究，如藥劑對(duì)孢子的致毒效應(yīng)等，也需要孢子；分子生物學(xué)領(lǐng)域的有關(guān)研究，如致病相關(guān)基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是番茄灰霉病日常研究的重要的菌體形態(tài)。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子要達(dá)到?jīng)]有雜菌污染的狀態(tài)。
在實(shí)驗(yàn)室工作中，由于番茄灰霉病菌在常規(guī)培養(yǎng)基上容易形成分生孢子，因而該病菌分生孢子的常規(guī)培養(yǎng)獲取方法是，利用普通培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)器具，在培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)制備該分生孢子。
一般實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)皿由皿底和皿蓋組成，限于當(dāng)前培養(yǎng)皿的制作工藝技術(shù)，皿底與皿蓋間很難達(dá)到均勻貼合的程度，大多數(shù)培養(yǎng)皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養(yǎng)皿內(nèi)外的空氣流動(dòng)可暢通無阻。因此，利用普通培養(yǎng)皿培養(yǎng)制備的分生孢子容易受外界污染空氣的干擾，容易得到帶有雜菌污染狀態(tài)的孢子成品。尤其是一般的植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養(yǎng)箱，該類培養(yǎng)箱通常為了實(shí)現(xiàn)工作室內(nèi)快速恒溫及溫度均勻分布狀態(tài)，往往將工作室設(shè)計(jì)為循環(huán)空氣的模式；利用這類培養(yǎng)箱實(shí)施的產(chǎn)孢培養(yǎng)，培養(yǎng)皿周圍空氣處于常流動(dòng)狀態(tài)，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料污染的機(jī)率相當(dāng)高，通常培養(yǎng)7天可造成50％以上的培養(yǎng)平板被雜菌污染，即使一些培養(yǎng)平板上看不到明顯的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染情況仍然存在。因此，利用培養(yǎng)皿培養(yǎng)制備番茄灰霉病菌分生孢子，在技術(shù)上很難排除污染的可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)方法的步驟如下：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.瓶式培養(yǎng)基的制備：用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.番茄灰霉病菌的移植：用移植工具將實(shí)驗(yàn)室常備的番茄灰霉病菌菌絲體，移植入步驟2制備的瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產(chǎn)孢：將步驟3操作完備后的瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為23℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；通常培養(yǎng)7天后，瓶式培養(yǎng)基面上已形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。
5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得的菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的番茄灰霉病菌分生孢子液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
1)三角瓶配上常規(guī)瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護(hù)三角瓶?jī)?nèi)不受雜菌污染，獲得高質(zhì)量的孢子成品。
2)三角瓶?jī)?nèi)收集孢子比培養(yǎng)皿內(nèi)收集孢子的操作更為方便。
3)三角瓶的保護(hù)可使得產(chǎn)孢菌落能隨意放置一段時(shí)間而不受污染，并保持產(chǎn)孢狀態(tài)，便于與需要孢子的工作程序銜接。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是三角瓶與瓊脂類培養(yǎng)基的結(jié)合與應(yīng)用。
三角瓶雖然屬植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的日常器具，但其常規(guī)用途主要是裝盛培養(yǎng)基滅菌；也常見用于裝盛液體培養(yǎng)基、或植物組織類培養(yǎng)基(如籽粒、秸桿等)進(jìn)行病原菌培養(yǎng)。
瓊脂類培養(yǎng)基的應(yīng)用，現(xiàn)有的技術(shù)規(guī)范都是使用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，將瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)基平板，并在該培養(yǎng)平板上培養(yǎng)病原菌。
番茄灰霉病菌分生孢子在瓊脂培養(yǎng)基上的制備培養(yǎng)，均為應(yīng)用常規(guī)的技術(shù)規(guī)范，即利用培養(yǎng)皿結(jié)合瓊脂類培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行制備培養(yǎng)；至今還未見有利用三角瓶作培養(yǎng)器具，在瓊脂類培養(yǎng)基上進(jìn)行番茄灰霉病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)的孢子制備技術(shù)?？赡茉蚴菍?duì)培養(yǎng)皿的長期依賴及習(xí)慣沿用，以及通常認(rèn)為病原菌產(chǎn)孢需要通氣性良好的環(huán)境條件，而培養(yǎng)皿恰好能滿足良好的通氣性。
普通三角瓶套上瓶塞后，雖然形成通氣性較差的封閉環(huán)境，但發(fā)明人反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病菌能在該較為封閉的環(huán)境內(nèi)的瓊脂培養(yǎng)基上形成分生孢子；而三角瓶的應(yīng)用，則正好解決應(yīng)用培養(yǎng)皿容易導(dǎo)致污染的重大技術(shù)問題。
番茄灰霉病菌可在許多瓊脂類培養(yǎng)基上生長并形成分生孢子，本發(fā)明所述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，其組分為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；按常規(guī)方法煮配。培養(yǎng)基煮配完畢后，可直接分裝到三角瓶中；由于三角瓶底部多屬曲面狀態(tài)，培養(yǎng)基量過少，會(huì)造成瓶底局部無培養(yǎng)基或培養(yǎng)基過薄，培養(yǎng)基過多則容易造成浪費(fèi)；通常每瓶(250mL規(guī)格)裝入20～30mL培養(yǎng)基為宜，其它規(guī)格的三角瓶酌情增減液量。
套好瓶塞后，常規(guī)高壓高溫滅菌，滅菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷卻后形成三角瓶裝盛的瓶式培養(yǎng)基。
瓶式培養(yǎng)基也可以用另一種方法分裝，先用較大的三角瓶按常規(guī)方式裝入液量較多的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；再如同倒培養(yǎng)皿平板一樣，使用前加熱熔化后，分裝到滅菌的空白三角瓶?jī)?nèi)。
可用常規(guī)菌落上的菌絲體作移植用的母體菌絲體，按常規(guī)方式移植。
產(chǎn)孢培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)施，溫度控制在番茄灰霉病菌生長的適宜溫度，本發(fā)明培養(yǎng)溫度采用23℃；培養(yǎng)過程對(duì)光照條件和濕度條件無特別需求。
通常產(chǎn)孢制備培養(yǎng)7天后，三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基面上已形成濃密的氣生菌絲和大量分生孢子。
在收集制備培養(yǎng)獲得的新一代分生孢子操作中，可采用光滑的T形玻棒刷洗菌落，使孢子釋放到洗孢液中。
實(shí)施例1
應(yīng)用本發(fā)明高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)番茄灰霉病菌菌株Bc-1的分生孢子，按如下步驟實(shí)施操作：
1.采用250mL三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.瓶式培養(yǎng)基的制備：用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，每瓶30mL；常規(guī)高壓高溫滅菌后成為瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.番茄灰霉病菌的移植：用移植針將實(shí)驗(yàn)室常備的番茄灰霉病菌菌株Bc-1菌絲體，移植入步驟2制備的瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產(chǎn)孢：將步驟3操作完備后的瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為23℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)7天后，瓶式培養(yǎng)基面上形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。
5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得的菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的番茄灰霉病菌分生孢子液。
用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為4.54×106個(gè)/mL的分生孢子液。
實(shí)施例2
應(yīng)用本發(fā)明高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)番茄灰霉病菌菌株Bc-2的分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟5操作實(shí)施，不同的只是步驟3的菌株是Bc-2；
結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為1.55×106個(gè)/mL的分生孢子液。
實(shí)施例3
應(yīng)用本發(fā)明高效防止污染的番茄灰霉病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)番茄灰霉病菌菌株Bc-3的分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟5操作實(shí)施，只是步驟3的菌株是Bc-3；
結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為1.37×106個(gè)/mL的分生孢子液。