本發(fā)明涉及大麗輪枝菌突變體菌株及其應(yīng)用，特別涉及敲除VdKu80基因的大麗輪枝菌突變體菌株，還涉及以所述大麗輪枝菌突變體菌株為受體菌株進(jìn)行基因定點(diǎn)敲除的應(yīng)用，屬于真菌分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是一種重要的植物病原真菌，屬于子囊菌門、糞殼菌科、輪枝菌屬。它在全世界范圍內(nèi)有200種以上的寄主，包括喬木、灌木、經(jīng)濟(jì)作物和觀賞性花卉等。由其引起的病害會(huì)導(dǎo)致植物枯萎死亡，因此造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。另外，大麗輪枝菌也是導(dǎo)致北京香山黃櫨枯萎病的病原真菌，每年造成大量的黃櫨枯萎死亡，嚴(yán)重的影響了香山紅葉的生態(tài)價(jià)值和景觀價(jià)值。對(duì)于由大麗輪枝菌引起的枯萎病，目前主要防治措施包括a.物理方法：加強(qiáng)營(yíng)林措施、施肥灌溉增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)、及時(shí)清理病害木殘?bào)w防止發(fā)生再次侵染；b.化學(xué)方法：使用各種農(nóng)藥灌根、直接注射至受害植物以及使用化學(xué)農(nóng)藥熏蒸處理土壤；c.生物方法：篩選對(duì)大麗輪枝菌具有拮抗作用的真菌(木霉)和細(xì)菌(枯草芽孢桿菌)、選育抗病植物。但是目前使用的這些方法防治效果并不理想。導(dǎo)致其難以防治主要有兩個(gè)原因：1、大麗輪枝菌主要危害寄主的維管束，一般的化學(xué)農(nóng)藥以及拮抗菌無(wú)法發(fā)揮功能，因此效果大打折扣；2、大麗輪枝菌在其病害循環(huán)的后期會(huì)形成黑色素化的休眠結(jié)構(gòu)“微菌核”，該結(jié)構(gòu)由膨脹分隔的菌絲聚集而成，對(duì)于不良的外界環(huán)境具有極強(qiáng)的抗逆性，并且能夠在土壤內(nèi)存活數(shù)年以上，一旦遇到合適的寄主，微菌核就會(huì)萌發(fā)形成菌絲，作為初侵染源，繼續(xù)對(duì)植物進(jìn)行危害。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始大量研究大麗輪枝菌致病的分子機(jī)制以及大麗輪枝菌微菌核形成的分子機(jī)制，從而為大麗輪枝菌的防治提供理論依據(jù)。這方面的工作在農(nóng)業(yè)有害病原真菌稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中取到了較大進(jìn)展，大量參與附著胞形成及侵染過(guò)程的相關(guān)基因功能被研究，明確了它們?cè)诘疚辆秩炯爸虏〉倪^(guò)程中發(fā)揮的功能并解析了它們之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為稻瘟菌的防治提供了巨大的價(jià)值。因此，通過(guò)基因功能研究揭示大麗輪枝菌致病分子機(jī)制和微菌核形成分子機(jī)制，對(duì)于病害的防治意義重大。

對(duì)于大麗輪枝菌的基因功能研究，近十年來(lái)取得到了巨大的進(jìn)展，尤其是在大麗輪枝菌全基因序列公布之后。大麗輪枝菌共有10535個(gè)編碼基因，而且隨著研究的進(jìn)一步深入，為了更好的解析大麗輪枝菌的致病及微菌核形成的分子機(jī)制，開(kāi)展高通量的基因功能研究是十分必要的。但是目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究功能的基因數(shù)量還非常有限，造成這一現(xiàn)象的一個(gè)重要原因是其同源重組率低，導(dǎo)致基因敲除效率不高。雖然近年來(lái)，研究者通過(guò)改變載體構(gòu)建方法從double joint PCR到Split-marker、改變轉(zhuǎn)化方法從PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等都有效的提高了基因敲除效率，但是目前基因敲除效率依然是限制大麗輪枝菌基因功能研究的主要因素之一。因此，提高大麗輪枝菌基因敲除效率對(duì)加快大麗輪枝菌基因功能研究的進(jìn)程具有重要的意義。

在真核生物中，細(xì)胞會(huì)通過(guò)同源重組(homologous recombination)和非同源末端連接(non-homologous end joining)等方式修復(fù)受到破壞的雙鏈DNA，通常非同源末端連接方式是真核生物中主要的修復(fù)方式，它能抑制外源DNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組事件，因此該方式能有效的降低同源重組率，從而導(dǎo)致基因敲除效率降低。參與非同源末端連接修復(fù)方式的基因主要包括Ku70、Ku80、XRCC4、DNAPKcs和LIG4等，其中Ku70和Ku80組成的Ku異質(zhì)二聚體負(fù)責(zé)識(shí)別受損的雙鏈DNA，因此它們?cè)诜峭茨┒诉B接修復(fù)途徑中發(fā)揮著重要的作用。大量的研究表明敲除Ku70或Ku80基因能夠大大的提高真菌的基因敲除率，這一現(xiàn)象在米曲霉(Aspergillus oryzae)、稻瘟菌(M.oryzae)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、粗糙脈胞菌(Neurospora crassa)、黃青霉(Penicillium chrysogenum)等很多真菌中得到了驗(yàn)證。已有研究顯示，敲除大麗輪枝菌Ku70基因也能夠顯著提高基因敲除率，從原有的0.5％提高到了20％以上，因此這一機(jī)制在大麗輪枝菌中也同樣適用。但是對(duì)于敲除Ku80基因能否顯著提高其基因敲除率并沒(méi)有研究。

故本發(fā)明旨在獲得具有高效基因敲除效率的大麗輪枝菌菌株。本發(fā)明通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，成功敲除大麗輪枝菌VdKu80基因。結(jié)果表明△VdKu80突變體菌株其基因敲除率較野生型菌株得到了顯著的提高，并且大麗輪枝菌△VdKu80突變體菌株在菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、脅迫響應(yīng)、微菌核形成以及致病性方面與野生型菌株無(wú)顯著差異。因此本發(fā)明獲得的大麗輪枝菌△VdKu80突變體菌株可以用于后續(xù)的基因功能研究。該突變體菌株的使用將大大提高大麗輪枝菌基因功能研究效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有大麗輪枝菌存在基因同源重組率低，基因敲除率低的技術(shù)問(wèn)題，提供一株大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)XS11的VdKu80基因敲除突變體菌株、其構(gòu)建方法以及應(yīng)用。本發(fā)明方法構(gòu)建的VdKu80基因敲除突變體菌株在敲除VdKu80基因后，其基因敲除效率顯著提高，而且敲除VdKu80基因并不影響突變體菌株的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、脅迫響應(yīng)、微菌核形成和致病性。因此，敲除VdKu80基因的大麗輪枝菌突變體菌株能夠作為受體菌株對(duì)大麗輪枝菌其他基因進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一株大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)XS11的VdKu80基因敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80，其微生物保藏號(hào)為CGMCC No.12873。

其中，所述VdKu80基因被潮霉素抗性基因所替代。

本發(fā)明另一方面提供一種大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的VdKu80基因敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80的構(gòu)建方法，包括如下步驟：1)利用Split-marker方法構(gòu)建大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體；2)利用PEG介導(dǎo)的方法，將VdKu80基因敲除載體導(dǎo)入野生型大麗輪枝菌的原生質(zhì)體內(nèi)，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除的轉(zhuǎn)化子；3)利用PCR方法對(duì)大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。

其中，步驟1)中所述大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1A)以大麗輪枝菌基因組DNA為模板，分別以Ku80-5F/Ku80-5R、Ku80-3F/Ku80-3R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因上游片段VdKu80 5F、下游片段VdKu80 3F；

1B)以質(zhì)粒gGFP為模板，以Hyg-For/Hyg-Rev為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得潮霉素抗性基因片段Hygromycin片段；

1C)將VdKu80 5F、VdKu80 3F片段、Hygromycin片段分別與pMD^TM19-T Vector質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得VdKu80 5F重組質(zhì)粒、VdKu80 3F重組質(zhì)粒和Hygromycin重組質(zhì)粒；

1D)以VdKu80 5F重組質(zhì)粒為模板，以Ku80-5F/Ku80-5RO為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VdKu80 5FO片段；以VdKu80 3F重組質(zhì)粒為模版，以Ku80-3FO/Ku80-3R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VdKu80 3FO片段；以Hygromycin重組質(zhì)粒為模版，以M13F/M13R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到HygromycinO片段；

1E)以VdKu80 5FO片段和HygromycinO片段為模板，以Ku80-5F/HY-R為引物，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體1:VdKu80 5F+2/3Hyg片段；以VdKu80 3FO片段和HygromycinO片段為模板，以YG-F/Ku80-3R為引物，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，獲得大麗輪枝菌Ku80基因敲除載體2:2/3Hyg+VdKu80 3F片段。

特別是，步驟1D)中VdKu80 5FO片段在3’端含有一段與M13F相同的DNA序列；VdKu80 3FO片段在5’端含有一段與M13R相同的DNA序列；HygromycinO片段的5’和3’分別含有M13F和M13R的DNA序列。

其中，步驟2)中所述野生型大麗輪枝菌菌株為大麗輪枝菌XS11菌株。

特別是，步驟2)中所述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化包括如下步驟：

2A)將野生型大麗輪枝菌分生孢子置于液體YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大麗輪枝菌新鮮菌絲。

2B)利用Lyzing和Driselase酶，對(duì)大麗輪枝菌新鮮菌絲進(jìn)行酶解，獲得原生質(zhì)體；

2C)將大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體VdKu80 5F+2/3Hyg片段和2/3Hyg+VdKu80 3F片段與大麗輪枝菌原生質(zhì)體混合后，在一定濃度的PEG條件下導(dǎo)入大麗輪枝菌原生質(zhì)體內(nèi)，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除的轉(zhuǎn)化子。

其中，步驟3)中所述PCR擴(kuò)增方法篩選大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子包括如下步驟：

3A)使用CTAB法提取大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子的DNA；

3B)以步驟3A)提取的DNA為模板，以Ku80-IF/Ku80-IR為引物，對(duì)所有轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3C)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中未能擴(kuò)增出Ku80基因片段(102bp大小)條帶的轉(zhuǎn)化子篩選為大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體。

特別是，還包括步驟4)，采用Southern blot方法對(duì)大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析、鑒定。

其中，所述大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子的分析、鑒定包括如下步驟：

4A)制備探針

以VdKu80 3F重組質(zhì)粒為模板，以Ku80-3F/Ku80-P1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得探針片段；接著使用DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)試劑盒中的DIG-High Prime并按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)探針片段進(jìn)行標(biāo)記，制得地高辛標(biāo)記探針；

4B)雜交處理

使用CTAB法提取大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子的DNA；接著用KpnI限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切處理；然后將酶切后的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至N⁺的硝酸纖維素膜上；再利用地高辛(DIG)標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。

特別是，還包括對(duì)雜交后的硝酸纖維素膜按照DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)試劑盒的要求進(jìn)行洗膜，顯色。

本發(fā)明又一方面提供一種大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9作為受體菌株在提高基因敲除效率中的用途。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，成功敲除大麗輪枝菌VdKu80基因，獲得敲除Ku80基因的突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9，該突變體菌株的基因敲除率較野生型菌株得到了顯著的提高，基因敲除率提高20％以上；而且本發(fā)明的大麗輪枝菌△VdKu80突變體菌株在菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、脅迫響應(yīng)、微菌核形成以及致病性方面與野生型菌株無(wú)顯著差異。因此本發(fā)明獲得的大麗輪枝菌△VdKu80突變體菌株可以用于后續(xù)的基因功能研究，并且能大大提高大麗輪枝菌基因功能研究效率。

附圖說(shuō)明

圖1A是VdKu80基因上游、下游片段的電泳檢測(cè)圖；

圖1B是VdKu80基因上游、下游片段分別融合2/3Hygromycin片段的電泳檢測(cè)圖；

圖2A是利用Ku80-IF/Ku80-IR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證VdKu80基因敲除突變體的電泳檢測(cè)圖；

圖2B是利用Southern blot鑒定VdKu80基因敲除突變體的檢測(cè)圖；其中：

WT表示大麗輪枝菌野生型；△VdKu80_1、△VdKu80_4、△VdKu80_6、△VdKu80_9表示成功敲除了VdKu80基因的敲除突變體；VdKu80_5表示構(gòu)建的VdKu80敲除片段異位整合到基因組上其他位置上了。用于Southern blot分析的野生型和突變體基因組均使用KpnI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。

圖3A是大麗輪枝菌野生型菌株和△VdKu80突變體菌株在培養(yǎng)基PDA、CM、CM+100μg/ml Cong Red、CM+1M NaCl上生長(zhǎng)的菌落直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

圖3B是大麗輪枝菌野生型菌株和△VdKu80突變體菌株在培養(yǎng)基PDA、CM、CM+100μg/ml Cong Red、CM+1M NaCl上生長(zhǎng)菌落形態(tài)圖；

圖3C是大麗輪枝菌野生型菌株和△VdKu80突變體菌株在培養(yǎng)基PDA上生長(zhǎng)10天后的產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

圖4是大麗輪枝菌野生型菌株和△VdKu80突變體菌株在BM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，微菌核形成的顯微鏡觀察；

圖5是大麗輪枝菌野生型菌株和△VdKu80突變體菌株對(duì)煙草幼苗致病性測(cè)定，其中：CK蒸餾水對(duì)照組，將煙草幼苗的根部浸泡在含10⁶孢子/ml的野生型菌株和△VdKu80突變體菌株的孢子懸浮液中10分鐘，對(duì)照使用蒸餾水。圖片拍攝于接種后25天。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

下述實(shí)施例中的方法，無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。PCR反應(yīng)中所用的DNA聚合酶、dNTP，提取基因組的試劑盒和PCR產(chǎn)物純化的試劑盒等分子生物學(xué)常規(guī)試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司和天根生化科技(北京)有限公司，相應(yīng)的分子生物學(xué)操作按照商品試劑說(shuō)明書和《分子克隆》(第三版)進(jìn)行。

本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)除另外定義之外，所使用的技術(shù)及術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所了解的具有相同含義。

實(shí)施例1材料、試劑、培養(yǎng)基配制

1、野生型菌株和質(zhì)粒

大麗輪枝菌XS11作為本發(fā)明使用的野生型菌株，采集自香山地區(qū)枯萎的黃櫨病部組織。

質(zhì)粒gGFP，用于擴(kuò)增潮霉素基因片段，購(gòu)自于美國(guó)堪薩斯州的真菌遺傳儲(chǔ)存中心(Fungal Genetics Stock Center)。

質(zhì)粒pSilent-Dual1，用于擴(kuò)增遺傳霉素基因片段，購(gòu)自于美國(guó)堪薩斯州的真菌遺傳儲(chǔ)存中心(Fungal Genetics Stock Center)。

質(zhì)粒pMD^TM19-T Vector，用于基因克隆，購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司。

2、培養(yǎng)基

2-1)PDA固體培養(yǎng)基

200g土豆，20g D-glucose(D-葡萄糖)，15g瓊脂粉，無(wú)菌水定容至1L，置于121℃，滅菌30min。

2-2)CM固體培養(yǎng)基

50ml 20×nitrate salts，1ml 1000x Trace，10g D-glucose，2g peptone(細(xì)菌蛋白胨),1g yeast extract(酵母浸膏),1g casamino acids(酸水解酪素),1ml vitamin solution,用NaOH調(diào)pH至6.5，無(wú)菌水定容至1L，瓊脂粉15g/L，置于121℃，滅菌30min。

2-3)脅迫培養(yǎng)基1(含有100μg/ml Cong Red(剛果紅)的CM固體培養(yǎng)基)：

使用前每1L CM固體培養(yǎng)基中加入Cong Red 10mg(即Cong Red的濃度為100μg/ml)。

2-4)脅迫培養(yǎng)基2(含1M的NaCl的CM固體培養(yǎng)基)

使用前每1L CM固體培養(yǎng)基中加入58.5g的NaCl(即NaCl的濃度為1M)。

2-5)微菌核生長(zhǎng)培養(yǎng)基(BM固體培養(yǎng)基)

10g D-glucose,0.2g sodium nitrate,0.52g KCl,0.52g MgSO₄·7H₂O,1.52g KH₂PO₄,3μM thiamine HCl,0.1μM biotin,15g瓊脂粉，無(wú)菌水定容至1L，置于121℃，滅菌30min。

2-6)Hygromycin抗性PDA固體培養(yǎng)基

使用前每1L PDA固體培養(yǎng)基中加入25mg潮霉素。

2-7)YEPD培養(yǎng)基，用于大麗輪枝菌菌絲培養(yǎng)

實(shí)施例2構(gòu)建基因敲除載體

采用Split-marker方法對(duì)大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體進(jìn)行構(gòu)建。

1、擴(kuò)增大麗輪枝菌VdKu80基因(VdKu80基因)上、下游片段

1A、根據(jù)大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)野生株XS11基因組VdKu80編碼基因的序列，設(shè)計(jì)2對(duì)PCR擴(kuò)增特異性引物(引物名稱、序列如表1所示)；其中：Ku80-5F/Ku80-5R為VdKu80基因上游片段引物；Ku80-3F/Ku80-3R為VdKu80基因下游片段引物；

1B、以大麗輪枝菌基因組(完整的基因序列參見(jiàn)http://genome.jgi.doe.gov/Verda1/Verda1.home.html)為模板，分別以Ku80-5F/Ku80-5R；Ku80-3F/Ku80-3R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1.7kb的VdKu80基因上游片段(VdKu80 5F，SEQ ID NO.36)；1.6kb的VdKu80基因下游片段(VdKu80 3F，SEQ ID NO.37)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1A所示。

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，以雙蒸水為陰性對(duì)照。

2、擴(kuò)增潮霉素抗性基因片段(Hygromycin片段)

以質(zhì)粒gGFP為模板，以Hyg-For/Hyg-Rev為引物(引物名稱、序列如表1所示)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1.5kb的Hygromycin片段(即潮霉素抗性基因片段)，包括啟動(dòng)子、開(kāi)放式閱讀框和終止子，委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，SEQ ID NO.38。

3、制備重組質(zhì)粒

3A、將VdKu80 5F、VdKu80 3F片段和Hygromycin片段分別與pMD^TM19-T Vector質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)(按照pMD^TM19-T Vector clone kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)，其中反應(yīng)體系和條件如下：

目標(biāo)片段 2μl

pMD^TM19-T Vector 0.5μl

Solution I 2.5μl

37℃連接3h

3B、使用DH5α大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并分別使用M13F/M13R引物對(duì)菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選、將能夠分別擴(kuò)增出VdKu80 5F、VdKu80 3F和Hygromycin片段目的條帶的菌落進(jìn)行搖菌，并利用天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得VdKu80 5F重組質(zhì)粒、VdKu80 3F重組質(zhì)粒、Hygromycin重組質(zhì)粒。

4、含有重疊列片段的PCR擴(kuò)增

以VdKu80 5F重組質(zhì)粒為模版，以Ku80-5F/Ku80-5RO為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VdKu80 5F重疊擴(kuò)增片段(即VdKu80 5FO片段)；以VdKu80 3F重組質(zhì)粒為模版，以Ku80-3FO/Ku80-3R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VdKu80 3F重疊擴(kuò)增片段(即VdKu80 3FO片段)；以Hygromycin重組質(zhì)粒為模版，以M13F/M13R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到Hygromycin重疊擴(kuò)增片段(即HygromycinO片段)；其中VdKu80 5FO片段在3’端含有一段與M13F相同的DNA序列；VdKu80 3FO片段在5’端含有一段與M13R相同的DNA序列；HygromycinO片段的5’和3’分別含有M13F和M13R的DNA序列；引物序列如表1所示。

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，以雙蒸水為陰性對(duì)照。

5、融合PCR

以VdKu80 5FO片段和HygromycinO片段為模板，以Ku80-5F/HY-R為引物(見(jiàn)表1)，利用融合PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得VdKu80基因敲除載體片段1(即VdKu80 5F+2/3Hyg片段)；以VdKu80 3FO片段和HygromycinO片段為模板，以YG-F/Ku80-3R為引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即通過(guò)融合PCR的方法擴(kuò)增獲得VdKu80基因敲除載體片段2(即2/3Hyg+VdKu80 3F片段)；融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的VdKu80敲除載體片段1、2的大小分別為2.7kb、2.5kb。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1B。

融合PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃45s，72℃3min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，以雙蒸水為陰性對(duì)照。

實(shí)施例3PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

將VdKu80敲除載體VdKu80 5F+2/3Hyg和2/3Hyg+VdKu80 3F兩個(gè)片段使用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大麗輪枝菌野生型原生質(zhì)體內(nèi)。具體轉(zhuǎn)化方法參考(Goswami,RS.Targeted gene replacement in fungi using a split-marker approach.Methods Mol Biol,2011,835:255-269)的方法進(jìn)行，具體操作如下：

1、將適量的野生型大麗輪枝菌菌株XS11的分生孢子置于液體的YEPD培養(yǎng)基中，于25℃，150rpm搖培一定時(shí)間獲得新鮮的大麗輪枝菌菌絲

2、利用適量比例的Lyzing和Driselase酶，對(duì)大麗輪枝菌新鮮菌絲進(jìn)行酶解，獲得足量的原生質(zhì)體。

3、將構(gòu)建好的基因敲除載體VdKu80 5F+2/3Hyg和2/3Hyg+VdKu80 3F片段與大麗輪枝菌原生質(zhì)體充分混合后，在一定濃度的PEG條件下導(dǎo)入大麗輪枝菌原生質(zhì)體內(nèi)。

4、原生質(zhì)體再生培養(yǎng)

將一定量的TB3液體培養(yǎng)基加入步驟3中的大麗輪枝菌原生質(zhì)體懸浮液中，于25℃，90rpm進(jìn)行原生質(zhì)體再生培養(yǎng)，促進(jìn)原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生，將細(xì)胞壁再生后的菌體置于含25μg/ml潮霉素的TB3固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，共獲得13個(gè)VdKu80基因敲除的候選轉(zhuǎn)化子。

實(shí)施例4基因敲除突變體篩選、鑒定

1、VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子單胞純化

將VdKu80基因敲除轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基(即Hygromycin抗性PDA固體培養(yǎng)基，其中潮霉素濃度為25μg/mL)上，于室溫下黑暗培養(yǎng)7天后用蒸餾水沖洗菌落，收集轉(zhuǎn)化子的分生孢子，并用10倍梯度稀釋法稀釋孢子懸液；

將少量的稀釋后的孢子懸浮液涂布到新的含Hygromycin的PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中潮霉素濃度為25μg/mL，室溫下黑暗培養(yǎng)2-3天，待菌落可見(jiàn)，挑取單個(gè)菌落于無(wú)Hygromycin抗性的PDA平板(即不含潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，室溫下黑暗培養(yǎng)5-7天，用1ml蒸餾水沖洗菌落，收集單胞轉(zhuǎn)化子的分生孢子，并用15％甘油進(jìn)行保存，置于-80℃待用。經(jīng)初步篩選，挑取5個(gè)單胞轉(zhuǎn)化子(分別為VdKu80-1、VdKu80-4、VdKu80-5、VdKu80-6、VdKu80-9)作為VdKu80基因敲除的待選轉(zhuǎn)化子用于進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

2、突變體的初步篩選

使用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨，cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide)的方法分別提取每個(gè)單胞轉(zhuǎn)化子、野生型菌株(WT)的基因組DNA，使用引物Ku80-IF/Ku80-IR(序列見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2A，野生型菌株和轉(zhuǎn)化子VdKu80-5能夠擴(kuò)增出目的條帶(即102bp的VdKu80基因片段)，而轉(zhuǎn)化子VdKu80-1、VdKu80-4、VdKu80-6、VdKu80-9未擴(kuò)增出目的條帶。

轉(zhuǎn)化子中VdKu80基因被敲除，則PCR擴(kuò)增為陰性結(jié)果，即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不能擴(kuò)增出102bp大小的目的條帶(即VdKu80基因片段)，如果仍能擴(kuò)增出與野生型條帶大小(102bp)一樣的的產(chǎn)物，則說(shuō)明VdKu80基因未被敲除。

圖2A的檢測(cè)結(jié)果顯示：大麗輪枝菌野生型菌株(WT)具有明顯的102bp大小的目的條帶；轉(zhuǎn)化子VdKu80-5的電泳圖中具有與野生型一樣大小的條帶；而轉(zhuǎn)化子VdKu80-1、VdKu80-4、VdKu80-6、VdKu80-9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中未能擴(kuò)增出102bp大小的條帶，因此初步篩選出轉(zhuǎn)化子VdKu80-1、VdKu80-4、VdKu80-6、VdKu80-9為VdKu80基因敲除突變體命名為△VdKu80-1、△VdKu80-4、△VdKu80-6、△VdKu80-9。

3、Southern blot分析、鑒定

使用DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)試劑盒，并嚴(yán)格按照其說(shuō)明進(jìn)行操作，對(duì)VdKu80敲除突變體進(jìn)行Southern blot分析、鑒定，具體如下：

3A、以VdKu80 3F重組質(zhì)粒為模板，以Ku80-3F/Ku80-P1為引物(見(jiàn)表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以DIG-High Prime(DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)試劑盒)進(jìn)行標(biāo)記，獲得DIG(地高辛)標(biāo)記探針；

3B、將大麗輪枝菌野生型菌株、單胞轉(zhuǎn)化子的基因組DNA各約30μg，分別用限制性內(nèi)切酶KpnI酶(約300U)進(jìn)行酶切處理；將酶切后的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后轉(zhuǎn)移至N⁺的硝酸纖維素膜上；再利用地高辛(DIG)標(biāo)記探針進(jìn)行雜交；然后按照DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)試劑盒中的說(shuō)明對(duì)雜交后的硝酸纖維素膜進(jìn)行洗膜、顯色、拍照，結(jié)果如圖2B所示。

在Southern blot分析、鑒定試驗(yàn)中，野生型經(jīng)過(guò)Southern blot分析雜出一條5.2kb的條帶(含有Ku80基因片段)；成功敲除VdKu80基因的突變體未檢測(cè)到該條帶，而是雜出一條3.5kb的條帶(含有潮霉素基因片段)；異位突變體雜出了2條條帶，一條與野生型雜出的條帶大小一致，另一條與VdKu80敲除突變體雜出的條帶大小一致。

由圖2A、2B的檢測(cè)結(jié)果可知本發(fā)明成功獲得4株單拷貝敲除VdKu80基因的大麗輪枝菌突變體菌株，潮霉素抗性基因成功整合并替代了VdKu80基因，命名為VdXS11-△VdKu80-1、VdXS11-△VdKu80-4、VdXS11-△VdKu80-6、VdXS11-△VdKu80-9。本發(fā)明將大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC No.12873，保藏于中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2016年8月17日。

實(shí)施例5基因敲除突變體表型特征分析

1、VdKu80敲除突變體生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)、分生孢子產(chǎn)量測(cè)定。

1A、生長(zhǎng)速率測(cè)定：

將新鮮生長(zhǎng)的大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體和野生型大麗輪枝菌菌株的菌絲塊(直徑0.5cm)分別接種于PDA、CM固體平板培養(yǎng)基中央，室溫條件下培養(yǎng)10天后，分別測(cè)量菌落直徑，測(cè)定結(jié)果如圖3A，作為衡量其生長(zhǎng)速率的標(biāo)準(zhǔn)。

測(cè)定結(jié)果表明：大麗輪枝菌野生型菌株與敲除VdKu80基因的突變體菌株在PDA或者CM固體培養(yǎng)基上菌落直徑無(wú)顯著差異。表明敲除VdKu80基因不影響真菌的生長(zhǎng)。

1B、菌落形態(tài)觀察：

將新鮮生長(zhǎng)的大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體和野生型大麗輪枝菌菌株的菌絲塊(直徑0.5cm)分別接種于PDA、CM固體平板培養(yǎng)基中央，室溫條件下培養(yǎng)，直接拍照觀察菌落形態(tài)，觀察結(jié)果如圖3B。

VdKu80敲除突變體菌株和野生型菌株不論在PDA培養(yǎng)基上還是在CM培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)均無(wú)顯著差異。表明敲除VdKu80基因不影響真菌的菌落形態(tài)。

1C、分生孢子產(chǎn)量測(cè)定：

將新鮮生長(zhǎng)的大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體和野生型大麗輪枝菌菌株的菌絲塊(直徑0.5cm)分別接種于PDA固體平板培養(yǎng)基中央，室溫條件下培養(yǎng)10天，然后用2ml蒸餾水沖洗菌落，獲得分生孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)分生孢子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3C。

由圖3C可知：本發(fā)明的VdKu80敲除突變體菌株和野生型菌株在分生孢子產(chǎn)量方面無(wú)顯著不同，均產(chǎn)生大量分生孢子，室溫條件下培養(yǎng)10天后的分生孢子產(chǎn)量為2.4-2.6×10⁸個(gè)/ml，表明敲除大麗輪枝菌的VdKu80基因，并不影響菌株的生長(zhǎng)、菌落形態(tài)和分生孢子產(chǎn)量。

2、脅迫響應(yīng)

將新鮮生長(zhǎng)的大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體和野生型大麗輪枝菌菌株的菌絲塊(直徑0.5cm)分別接種至含有100μg/ml Cong Red(剛果紅)、1M/L的NaCl的CM固體平板培養(yǎng)基的中央，室溫條件下生長(zhǎng)10天，測(cè)量大麗輪枝菌野生型和VdKu80敲除突變體菌株的菌落直徑，測(cè)定結(jié)果如圖3A所示；觀察菌落形態(tài)，觀察結(jié)果如圖3B所示。

測(cè)定結(jié)果表明：野生型菌株和VdKu80基因敲除突變體菌株在脅迫培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)較無(wú)脅迫的CM固體培養(yǎng)基，生長(zhǎng)受到了顯著的抑制。尤其是在含1M/L NaCl的CM固體培養(yǎng)基。但是不論是在含100μg/mlCong Red的CM固體培養(yǎng)基還是在含1M/L NaCl的CM固體培養(yǎng)基，野生型菌株和VdKu80基因敲除突變體菌株菌落直徑和菌落形態(tài)均無(wú)顯著差異。表明，VdKu80敲除突變體菌株和野生型菌株對(duì)細(xì)胞壁脅迫劑和滲透壓力的抗性一致，敲除VdKu80基因并影響大麗輪枝菌對(duì)外界壓力的響應(yīng)。

3、微菌核形成觀察

將1×10⁶個(gè)孢子/ml的VdKu80敲除突變體和野生型菌株的孢子液均勻的涂布在BM固體培養(yǎng)基上，室溫條件下生長(zhǎng)5天后，用顯微鏡觀察微菌核形成情況，顯微鏡觀察結(jié)果如圖4。

VdKu80基因敲除突變體菌株能夠形成與野生型菌株類似的黑色素化的微菌核，形成的微菌核無(wú)顯著差異，敲除VdKu80基因并不影響大麗輪枝菌微菌核的形成。

4、致病性實(shí)驗(yàn)

將煙草幼苗的根分別浸泡在分生孢子為1×10⁶個(gè)/ml的VdKu80敲除突變體、野生型菌株的孢子懸浮液中10min，然后將煙草重新種植到土壤內(nèi)，至于溫室內(nèi)生長(zhǎng)20-30天后觀察煙草幼苗的生長(zhǎng)狀況以及枯萎病癥；對(duì)照組(CK)除了采用蒸餾水浸泡煙草幼苗根之外，其余與分生孢子懸浮液浸泡相同。觀察結(jié)果如圖5所示。

經(jīng)大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株與野生型菌株浸泡后的煙草幼苗生長(zhǎng)狀況差，出現(xiàn)了明顯的枯萎病癥狀包括葉片黃萎、脫落；與對(duì)照組煙草幼苗相比，接種了麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株與野生型菌株的煙草幼苗生長(zhǎng)受到顯著的抑制；而且接種大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株的煙草幼苗與接種大麗輪枝菌野生型菌株的煙草幼苗表型無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)表明，敲除大麗輪枝菌VdKu80基因并不影響大麗輪枝菌的致病性。

綜上所述，本發(fā)明獲得的大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株在形態(tài)上與野生型菌株無(wú)顯著差異，同時(shí)在大麗輪枝菌中敲除VdKu80并不影響菌株的生長(zhǎng)、分生孢子的產(chǎn)量、脅迫響應(yīng)能力、微菌核形成和致病性。本發(fā)明獲得的VdKu80敲除突變體菌株與野生型菌株在各方面表型上均無(wú)顯著差異，因此本發(fā)明獲得的VdKu80敲除突變體菌株可以作為后續(xù)基因功能研究的受體菌株，用于基因敲除。

由于VdKu80基因敲除突變體菌株中含有潮霉素抗性篩選基因，因此本實(shí)例中使用的是遺傳霉素(Geneticin，G418)抗性基因替換VDAG_00736基因、VDAG_07169基因。

試驗(yàn)例1以VdKu80敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9作為受體菌株進(jìn)行VDAG_00736基因敲除效率評(píng)估

采用Split-marker方法對(duì)大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9的VDAG_00736基因敲除載體進(jìn)行構(gòu)建。

1.1構(gòu)建VDAG_00736基因敲除載體

按照實(shí)施例2構(gòu)建VdKu80基因敲除載體的方法，構(gòu)建了VDAG_00736融合遺傳霉素抗性的敲除片段VDAG_00736-5F+2/3G418和2/3G418+VDAG_00736-3F。

以大麗輪枝菌基因組DNA(完整的基因序列參見(jiàn)http://genome.jgi.doe.gov/Verda1/Verda1.home.html)為模板，分別以根據(jù)大麗輪枝菌VDAG_00736基因的上、下游DNA序列所設(shè)計(jì)2對(duì)PCR擴(kuò)增特異性引物VDAG_00736-5F/VDAG_00736-5R；VDAG_00736-3F/VDAG_00736-3R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大麗輪枝菌VDAG_00736基因上游片段VDAG_00736 5F和VDAG_00736基因下游片段VDAG_00736 3F；

以質(zhì)粒pSilent-Dual1為模板，以根據(jù)質(zhì)粒pSilent-Dual1的DNA序列而設(shè)計(jì)1對(duì)遺傳霉素抗性基因PCR擴(kuò)增的特異性引物Geneticin-For/Geneticin-Rev為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Geneticin片段(即遺傳霉素抗性基因片段)，包括啟動(dòng)子、開(kāi)放式閱讀框和終止子；

將VDAG_00736 5F、VDAG_00736 3F、Geneticin片段分別與pMD^TM19-T Vector質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，使用DH5α大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并分別使用M13F/M13R引物對(duì)菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選、利用天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒VDAG_00736 5F、VDAG_00736 3F、Geneticin；

以VDAG_00736 5F重組質(zhì)粒為模版，以VDAG_00736-5F/VDAG_00736-5O為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VDAG_00736 5FO片段，該片段在3’端含有一段與M13F引物相同的DNA序列；以VDAG_00736 3F重組質(zhì)粒為模版，以VDAG_00736-3O/VDAG_00736-3R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到VDAG_00736 3FO片段，該片段在5’端含有一段與M13R引物相同的DNA序列；以Geneticin重組質(zhì)粒為模版，以M13F/M13R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到5’和3’分別含有M13F和M13R引物序列的GeneticinO片段；

以VDAG_00736 5FO片段和GeneticinO片段為模板，以VDAG_00736-5F/GE-R為引物，利用融合PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得VDAG_00736基因敲除載體片段A(即VDAG_00736-5F+2/3G418片段)；以VDAG_00736 3FO片段和GeneticinO片段為模板，以EN-F/VDAG_00736-3R為引物，通過(guò)融合PCR的方法擴(kuò)增獲得VDAG_00736基因敲除載體片段B(即2/3G418+VDAG_00736-3F片段)；

1.2PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

使用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建的VDAG_00736敲除片段VDAG_00736-5F+2/3G418，2/3G418+VDAG_00736-3F導(dǎo)入本發(fā)明方法制備的VdXS11-△VdKu80-9敲除突變體菌株的原生質(zhì)體內(nèi)，獲得VDAG_00736基因敲除的待選轉(zhuǎn)化子，具體轉(zhuǎn)化方法參考(Goswami,R S.Targeted gene replacement in fungi using a split-marker approach.Methods Mol Biol,2011,835:255-269)的方法進(jìn)行。

1.3VDAG_00736基因敲除突變體篩選和統(tǒng)計(jì)

將步驟2中獲得的獲得VDAG_00736基因敲除的待選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有50μg/ml Geneticin的PDA抗性平板培養(yǎng)基中，于室溫條件下黑暗培養(yǎng)7天，用1ml蒸餾水沖洗菌落，收集分生孢子；接著將少量分生孢子懸浮液均勻的涂布到含有50μg/ml Geneticin的PDA抗性平板培養(yǎng)基上進(jìn)行單胞純化，挑取單胞轉(zhuǎn)化子；然后將純化后的轉(zhuǎn)化子保存并采用CTAB法提取基因組DNA；再接著以提取的轉(zhuǎn)化子的DNA為模板，以VDAG_00736-IF/VDAG_00736-IR為引物篩選VDAG_00736基因敲除突變體，并統(tǒng)計(jì)敲除突變體的比例(敲除突變體占所有篩選轉(zhuǎn)化子的比例)，本試驗(yàn)例中所使用的引物如表1所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2。

試驗(yàn)例2以VdKu80敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9作為受體菌株進(jìn)行VDAG_07169基因敲除效率評(píng)估

采用Split-marker方法對(duì)大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株VdXS11-△VdKu80-9的VDAG_07169基因敲除載體進(jìn)行構(gòu)建。

1、構(gòu)建VDAG_07169單基因敲除載體

按照實(shí)施例2構(gòu)建VdKu80基因敲除載體的方法，構(gòu)建了VDAG_07169融合遺傳霉素抗性的敲除片段VDAG_07169-5F+2/3G418和2/3G418+VDAG_07169-3F。

以大麗輪枝菌基因組DNA(完整的基因序列參見(jiàn)http://genome.jgi.doe.gov/Verda1/Verda1.home.html)為模板，分別以根據(jù)大麗輪枝菌VDAG_07169基因的上、下游DNA序列所設(shè)計(jì)2對(duì)PCR擴(kuò)增特異性引物VDAG_07169-5F/VDAG_07169-5R、VDAG_07169-3F/VDAG_07169-3R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大麗輪枝菌VDAG_07169基因上游片段VDAG_07169 5F和VDAG_07169基因下游片段VDAG_07169 3F；

將VDAG_07169 5F和VDAG_07169 3F片段分別與pMD^TM19-T Vector質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，使用DH5α大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并分別使用M13F/M13R引物對(duì)菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選、利用天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得VDAG_07169 5F重組質(zhì)粒和VDAG_07169 3F重組質(zhì)粒；

以VDAG_07169 5F重組質(zhì)粒為模版，以VDAG_07169-5F/VDAG_07169-5O為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得VDAG_07169 5FO片段，該片段在3’端含有一段與M13F引物相同的DNA序列；以VDAG_07169 3F重組質(zhì)粒為模版，以VDAG_07169-3O/VDAG_07169-3R為引物，進(jìn)行PCR得VDAG_07169 3FO片段，該片段在5’端含有一段與M13R引物相同的DNA序列；

以VDAG_07169 5FO片段和試驗(yàn)例1中獲得的GeneticinO片段為模板，以VDAG_07169-5F/GE-R為引物，利用融合PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得VDAG_07169基因敲除載體片段A(即VDAG_07169-5F+2/3G418片段)；以VDAG_07169 3FO片段和試驗(yàn)例1中獲得的GeneticinO片段為模板，以EN-F/VDAG_07169-3R為引物，通過(guò)融合PCR的方法擴(kuò)增獲得VDAG_7169基因敲除載體片段B(即2/3G418+VDAG_07169-3F片段)；

2、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

使用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建的VDAG_07169敲除片段VDAG_07169-5F+2/3G418，2/3G418+VDAG_07169-3F導(dǎo)入本發(fā)明方法制備的VdXS11-△VdKu80-9敲除突變體菌株的原生質(zhì)體內(nèi)，獲得VDAG_07169基因敲除的待選轉(zhuǎn)化子，具體轉(zhuǎn)化方法參考(Goswami,R S.Targeted gene replacement in fungi using a split-marker approach.Methods Mol Biol,2011,835:255-269)的方法進(jìn)行。

3、VDAG_07169敲除突變體篩選和統(tǒng)計(jì)

將步驟2中獲得的VDAG_07169基因敲除的待選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有50μg/ml Geneticin的PDA抗性平板培養(yǎng)基中，于室溫條件下黑暗培養(yǎng)7天，用1ml蒸餾水沖洗菌落，收集分生孢子；接著將少量分生孢子懸浮液均勻的涂布到含有50μg/ml Geneticin的PDA抗性平板培養(yǎng)基上進(jìn)行單胞純化，挑取單胞轉(zhuǎn)化子；然后將純化后的轉(zhuǎn)化子分生孢子進(jìn)行甘油保存并采用CTAB法提取基因組DNA；再接著以提取的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，以VDAG_07169-IF/VDAG_07169-IR為引物篩選VDAG_07169基因敲除突變體，并統(tǒng)計(jì)敲除突變體的比例(敲除突變體占所有篩選轉(zhuǎn)化子的比例)，本試驗(yàn)例中所使用的引物如表1所示；統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2野生型菌株和△VdKu80突變體菌株基因敲除率的對(duì)比

為了驗(yàn)證VdXS11-△VdKu80-9敲除突變體菌株確實(shí)具有顯著提高基因敲除效率的特性，本發(fā)明選取了兩個(gè)基因VDAG_00736和VDAG_07169作為敲除對(duì)象。本發(fā)明成功構(gòu)建了VDAG_00736和VDAG_07169融合Geneticin的敲除片段，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化成功獲得了與用野生型大麗輪枝菌菌株轉(zhuǎn)化相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化子數(shù)量。

分別使用VDAG_00736和VDAG_07169基因特異性引物，篩選使用野生型菌株和使用VdXS11-△VdKu80-9敲除突變體菌株獲得的具有遺傳霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明使用野生型菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子，均沒(méi)有篩選得到VDAG_00736和VDAG_07169敲除突變體，敲除效率接近為0。而使用VdXS11-△VdKu80-9敲除突變體菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，其基因敲除率大約為20％-25％，其中VDAG_00736的敲除效率為25％，VDAG_07169的敲除效率為21.4％(表2)。

研究表明，本發(fā)明獲得的大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株能夠顯著提高基因敲除率，同時(shí)敲除VdKu80對(duì)于大麗輪枝菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、微菌核形成、致病性等表型無(wú)顯著影響。因此本發(fā)明獲得的大麗輪枝菌VdKu80敲除突變體菌株對(duì)于后續(xù)的基因功能研究具有巨大的實(shí)用價(jià)值。