一種向日葵黃萎病的兩種輪枝病菌的多重dpo-pcr檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種向日葵黃萎病的兩種輪枝病菌的多重 DPO-PCR檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 向日葵黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Vertieillium dahliae Kleb.)和黑白輪枝 菌（Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)引起，雖然有報道稱從向日葵黃萎病 株上分離的大部分是大麗輪枝菌，但仍有報道證明黑白輪枝菌也是引起向日葵黃萎病的一 種重要病原菌。大麗輪枝菌和黑白輪枝菌均為我國進境檢疫性有害生物，親緣關系非常近， 兩種菌的ITS序列同源性高達99. 40 %。因此對分離自向日葵黃萎病株的兩種真菌類別進 行鑒定顯得非常重要，而傳統(tǒng)形態(tài)學方法鑒定這兩種菌周期長、時效性差。利用血清學和分 子生物學技術鑒定這兩種菌的方法已有建立，包括PCR、RFLP、RAPD等。但這些方法有些需 要酶切，檢測過程復雜；有些特異性不強或對依賴較昂貴的儀器設備，都難以在實驗室之間 推廣。因此，建立一種特異性強、且能同時快速區(qū)分這兩種菌的檢測方法顯得非常重要。
[0003] DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技術的主要原理為其引物包含兩個各 自獨立的特異性引物區(qū)域，5'端序列由18-25個堿基組成并與靶基因序列配對，3'端序 列由6-12個堿基用來引導PCR反應的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃 嘌呤（In 〇Sine，I)進行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時寡聚次黃 嘌呤形成類似泡狀的結構，從而使5'和3'區(qū)域形兩個獨立功能的雙特異性引物結構，并 且研宄表明5'和3'引物區(qū)域中任何有3個及以上堿基的錯配，PCR反應將不能進行，而 且由于其特殊的結構，引物自身以及引物之間很少形成二級結構且對退火溫度不敏感。該 技術的優(yōu)點主要在于它對退火溫度、鎂離子濃度等影響普通多重PCR的關鍵因素不敏感， 適用范圍廣，而且該技術特異性強，擴增效率高，為多重PCR技術的應用提供了新的前景。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是如何檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝 菌還是大麗輪枝菌的引物組。
[0006] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的引物組 由引物1、引物2、引物3和引物4組成：
[0007] 所述引物1為SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA分子；
[0008] 所述引物2為SEQ ID No. 2所示的單鏈DNA分子；
[0009] 所述引物3為SEQ ID No. 3所示的單鏈DNA分子；
[0010] 所述引物4為SEQ ID No. 4所示的單鏈DNA分子。
[0011] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝 菌還是大麗輪枝菌的PCR試劑。
[0012] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的PCR試 劑包括上述引物組。
[0013] 上述PCR試劑，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR試劑 中的終濃度均為〇· 4 μ mol/L〇
[0014] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝 菌還是大麗輪枝菌的試劑盒。
[0015] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌的試劑盒 包括上述引物組或上述PCR試劑。
[0016] 上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪 枝菌還是大麗輪枝菌中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在區(qū)分或輔助區(qū)分黑白輪枝菌和大麗 輪枝菌中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 為解決上述技術問題，本發(fā)明最后還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是黑白 輪枝菌還是大麗輪枝菌的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是黑白輪枝菌還是大麗輪枝菌包括如下 步驟：
[0020] (1)用上述引物組對待測菌株進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；
[0021] (2)檢測所述PCR擴增產(chǎn)物的大?。?br>[0022] 若所述PCR擴增產(chǎn)物含有大小為151bp的片段，則待測菌株為或候選為黑白輪枝 菌；
[0023] 若所述PCR擴增產(chǎn)物含有大小為225bp的片段，則待測菌株為或候選為大麗輪枝 菌。
[0024] 上述方法中，所述PCR擴增的模板為待測菌株的基因組DNA ;所述待測菌株來源于 向日葵、苜蓿、棉花、前子、番茄、辣椒或馬鈴薯。
[0025] 上述方法中，所述PCR擴增為多重DP0-PCR。
[0026] 上述方法中，所述PCR擴增的退火溫度為45-65°C。
[0027] 上述方法中，所述PCR擴增的退火溫度為60°C。
[0028] 上述方法在檢測或輔助檢測黃萎病的病菌中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0029] 上述應用中，所述病菌為黑白輪枝菌和大麗輪枝菌。
[0030] 上述應用中，所述病菌來源于向日葵、苜蓿、棉花、茄子、番茄、辣椒或馬鈴薯。
[0031] 本發(fā)明選擇引起向日葵黃萎病的兩種輪枝菌一一黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的 β-tubulin基因為靶基因，設計特異性DPO引物，并基于該引物建立了黑白輪枝菌和大麗 輪枝菌的多重DPO-PCR檢測方法，可對向日葵黃萎病病原分離株進行定性檢測。通過試驗 證明：本發(fā)明的特異性DPO引物特異性好，靈敏度高，而且對退火溫度不敏感，適用范圍廣， 并基于該特異性DPO引物發(fā)明了一種可以準確、簡便和快速鑒別檢測黑白輪枝菌和大麗輪 枝菌的多重DPO-PCR方法，對進出口相關貨物及產(chǎn)品檢驗檢疫、病害防治預測具有指導意 義。
【附圖說明】
[0032] 圖1為多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結果。其中，1 :大麗輪枝菌、黑白輪枝 菌；2 :黑白輪枝菌；3 :大麗輪枝菌；4 :陰性對照。
[0033] 圖2為特異性實驗的電泳檢測結果。其中，1 :大麗輪枝菌、黑白輪枝菌；2 :黑白 輪枝菌；3 :大麗輪枝菌；4 :向日葵白銹病菌；5 :向日葵黑莖病菌；6 :向日葵莖潰瘍病菌；7 : 向日葵霜霉病菌；8 :向日葵菌核病菌；9 :向日葵褐斑病菌；10 :向日葵銹病菌；11 :向日葵 炭腐病菌；12:陰性對照。
[0034] 圖3為退火溫度敏感實驗的電泳檢測結果。其中，1-5 :退火溫度分別為45°C、 50°C、55°C、60°C和 65°C。
[0035] 圖4為靈敏度實驗的電泳檢測結果。其中，1-6 :2種病原菌DNA模板量依次為 50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng、0. 005ng 和 0· 0005ng。
【具體實施方式】
[0036] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 下述實施例中的黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold) 在文獻"檢疫性輪枝菌及其近似種的檢測"中公開過，公眾可從伊犁出入境檢驗檢疫局獲 得。
[0039] 下述實施例中的大_輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.)在文獻"檢疫性輪枝 菌及其近似種的檢測"中公開過，公眾可從伊犁出入境檢驗檢疫局獲得。
[0040] 實施例1、一種檢測黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的方法
[0041] 一、多重DPO-PCR引物的設計
[0042] 以黑白輪枝菌（伊犁出入境檢驗檢疫局）和大麗輪枝菌（伊犁出入境檢驗檢 疫局）的β-tubulin基因為靶基因，設計了如下檢測黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的多重 DPO-PCR檢測引物組（I為次黃嘌呤）：
[0043] 上游引物 Va-DPO-F :CCCTAACGGGTCGTTTCTTTTCTGIIIIICGGGTACT (序列 1);
[0044] 下游引物 Va-DPO-R :GCAAATGCTGCTGAGAGATATCCAIIIIICCGTTTTA(序列 2);
[0045] 上游引物 Vd-DPO-F :GAATCACGTTGTCCCGACCTCIIIIICGATCACG(序列 3);
[0046] 下游引物 Vd-DPO-R :GCAGCACCGATCTGGTTACCCTGIIIITCCAGTGAT (序列 4);
[0047] 其中，Va-DPO-F和Va-DPO-R為檢測黑白輪枝菌的引物，產(chǎn)物大小為151bp ; Vb-DPO-F和Vb-DPO-R為檢測大麗輪枝菌的引物，產(chǎn)物大小為225bp。
[0048] 二、檢測黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的方法
[0049] UDNA 的提取
[0050] 參照DNA提取試劑盒操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號為DP305-02,天根生 物科技有限公司）分別提取黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的基因組DNA。
[0051] 2、多重 DPO-PCR 擴增
[0052] 采用 Va-DP〇-F、Va-DP〇-R、Vd-DP〇-F、Vd-DPO-R 共 4 條多重 DPO-PCR 引物，分別以 如下四組的基因組DNA為模板進行多重DPO-PCR擴增，分別得到多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物：
[0053] 組1 :以黑白輪枝菌和大麗輪枝菌的基因組DNA(黑白輪枝菌和大麗輪枝菌各 1 μ U為模板；
[0054] 組2 :以黑白輪枝菌的基因組DNA為模板；
[0055] 組3