本發(fā)明屬于生物材料的組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
微載體培養(yǎng)技術(shù)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，容易放大，條件可控。微載體將細(xì)胞固定在載體上生長，能最大限度地?cái)U(kuò)大比表面積，與其他方法相比，它的比表面積更大。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。
自1962年Capstile成功地大規(guī)模懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，以及1967年Van Wezel首次成功應(yīng)用微載體培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞以來，至今國際市場上出售的微載體商品類型已達(dá)十幾種以上，其中常用的商品化微載體有三種：Cytodexl、2、3，Cytopore和Cytoline，目前最常使用的是Cytodexl、2、3型微載體。
早期微載體多采用合成聚合物，如聚羥乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、葡聚糖等。合成聚合物制備的微載體重復(fù)性和力學(xué)性能可以達(dá)到較高水平，但缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，影響細(xì)胞在其表面粘附、生長。天然聚合物及其衍生物因其取材方便、生物相容性好且價(jià)格低廉，有望取代傳統(tǒng)微載體制備材料。例如明膠、膠原、纖維素、甲殼素及其衍生物以及海藻酸鈉等。膠原是一類可引導(dǎo)組織再生的生物材料，低抗原性、可參與組織愈合過程。Hillegas等(US 4994388)在聚苯乙烯微球表面包覆一層膠原后表現(xiàn)出很好的效果。殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰后的產(chǎn)物，其分子鏈之間可以形成許多氫鍵，分子中β-(1，4)糖苷鍵為其提供剛性和穩(wěn)定性；氨基提供弱正電性；乙酰基提供疏水性；羥基具有良好的親水性，但又不溶解于水。用殼聚糖制備的細(xì)胞培養(yǎng)微載體已有報(bào)道(Tigli RS et al.，2009)。藻酸鹽是帶有二價(jià)陰離子的天然線性多糖，是由α-L-古洛糖醛酸和β-D甘露糖醛酸殘基組成的共聚物。研究表明，培養(yǎng)在海藻酸鹽載體上的軟骨細(xì)胞可以合成與軟骨材料相似的胞外基質(zhì)(Hauselmann HJ，1996)。除單種材料制備微載體外，還有兩種及以上混合材料制備的微載體，如殼聚糖和明膠混合微載體(CN1321175C)，殼聚糖和多聚磷酸鈉多孔微載體(CN101844059A)。天然聚合物材料在組織工程化微顆粒方面也有應(yīng)用(CN101195044A)。將兩種或兩種以上材料混合制備微載體，可以克服單一材料的缺點(diǎn)，將幾種材料的優(yōu)勢互補(bǔ)，并且能產(chǎn)生出新的功能，是將來微載體材料領(lǐng)域研究的方向之一。
微載體的制備方法主要有相分離法、乳化-溶劑揮發(fā)法、冷凍法和噴霧法。其中，乳化-溶劑揮發(fā)法應(yīng)用最為廣泛，其法是將所用材料溶解在一種溶劑中，然后注入攪拌中的反相溶劑里乳化成所用材料的乳液，通過揮發(fā)掉原溶劑形成微載體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是：提供一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體,該微載體具有無毒性、無抗原性、細(xì)胞貼壁好、可降解等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是：提供一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的制備方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體，包含質(zhì)量百分比含量為聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～45％，絲素蛋白1～3％，微量元素0～2％的原料；由絲素蛋白涂布到聚苯乙烯、微量元素與聚乳酸混合成的聚苯乙烯-聚乳酸微粒表面制成。
優(yōu)選的，所述的微載體包含質(zhì)量百分比含量為聚苯乙烯55％，聚乳酸42％，絲素蛋白2.0％，微量元素1.0％的原料。
優(yōu)選的，所述的絲素蛋白也可以由膠原來代替。
優(yōu)選的，所述的微量元素包含有甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯和過硫酸鉀。
一種細(xì)胞培養(yǎng)用微載體的制備方法，包括以下步驟：
a.微量元素的配制：在40℃水中按照質(zhì)量配比為100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，攪拌升溫至75℃，然后加入質(zhì)量百分比為0.7％的過硫酸鉀，反應(yīng)8小時(shí)后停止反應(yīng)，經(jīng)破乳過濾洗滌干燥后備用；
b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制備：將質(zhì)量百分比為聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～44％，微量元素0～2％；在分散機(jī)中混合，經(jīng)噴霧干燥成微粒；
c.絲素蛋白溶液的制備：將生蠶絲在碳酸鈉溶液中煮沸，用去離子水清洗以去除絲膠蛋白，烘干，獲絲素蛋白；將絲素蛋白溶解在氯化鈣、水、乙醇摩爾比為1:8:2的溶液中用去離子水透析，過濾，制備出絲素蛋白的水溶液；將絲素蛋白水溶液攪拌濃縮，獲得絲素蛋白溶液；
d.微載體的生成：按質(zhì)量配比將聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在酸性的含絲素蛋白溶液(0.01～0.1N乙酸)中，并將溶液蒸發(fā)至干；然后將干燥的絲素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在含有蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(戊二醛)的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，將絲素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微載體；然后將固定有絲素蛋白的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗數(shù)次以除去未反應(yīng)的戊二醛，最后將珠干燥、消毒并包裝。
優(yōu)選的，所述的步驟b中分散機(jī)為高速分散機(jī)，分散時(shí)間為10分鐘。
優(yōu)選的，所述的步驟b中噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180～200℃，出口溫度為60～90℃。
優(yōu)選的，所述的步驟d中交聯(lián)劑選為戊二醛。
優(yōu)選的，所述的步驟d中所述微載體是以鈷60γ射線輻照消毒。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
1.克服了單純的聚苯乙烯微載體的缺點(diǎn)，具有無毒性、無抗原性、細(xì)胞貼壁好、可降解等優(yōu)點(diǎn)。
2.因?yàn)榻z素蛋白具備良好的生物相容性和降解緩慢的特性，以及在濕態(tài)下有著優(yōu)良的力學(xué)性能，既可支持大量細(xì)胞生長，又能長期維持細(xì)胞活性和功能，在動(dòng)物細(xì)胞長時(shí)間高密度培養(yǎng)中有獨(dú)特的作用，將絲素蛋白在微載體表面形成一層致密的殼層，加入一定濃度的戊二醛使其表面交聯(lián)，可以用于所有貼壁細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
3.本發(fā)明微載體尺寸均一、粒徑可控，能夠滿足分離純化、細(xì)胞培養(yǎng)微載體和診斷制劑等多方面的需求；
4.本發(fā)明的各微載體之間沒有合并現(xiàn)象，在保存過程中也不會(huì)出現(xiàn)并聚現(xiàn)象。
5.該生產(chǎn)過程簡單，生產(chǎn)工藝容易實(shí)現(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例一：
a.微量元素的配制：在40℃水中按照質(zhì)量配比為100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，攪拌升溫至75℃，然后加入質(zhì)量配比為0.7％的過硫酸鉀，反應(yīng)8小時(shí)后停止反應(yīng)，經(jīng)破乳過濾洗滌干燥后備用；
b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制備：將質(zhì)量配比為聚苯乙烯50％，聚乳酸45％和步驟a得到的微量元素2.0％；在高速分散機(jī)中混合10分鐘，經(jīng)噴霧干燥成微粒；噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180～200℃，出口溫度為60～90℃；
c.絲素蛋白溶液的制備：將75g生蠶絲在4L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸1小時(shí)，然后用大量去離子水清洗以去除絲膠蛋白，60～70℃下烘干，獲絲素蛋白。將適量絲素蛋白在80±2℃下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液中，在室溫條件下去離子水透析3d，去除溶液中的鹽和乙醇，過濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲素蛋白的水溶液；將絲素蛋白水溶液在50±2℃、50～60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s，獲得濃度約7～10w/v％的絲素蛋白溶液；
d.微載體的生成：將11.3公斤聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在5升7.0w/v％酸性的含絲素蛋白溶液中，并將溶液蒸發(fā)至干；然后將干燥的絲素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在含有蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如戊二醛)的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，將絲素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微載體；通過該技術(shù)，絲素蛋白涂層因此交聯(lián)，從而使得后續(xù)使用而不會(huì)再溶解或變得無活性；然后將固定有絲素蛋白的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗數(shù)次以除去未反應(yīng)的戊二醛，最后將珠干燥、經(jīng)鈷60γ射線輻照消毒并包裝。
實(shí)施例二：
a.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制備：將質(zhì)量配比為聚苯乙烯59％，聚乳酸40％在高速分散機(jī)中混合10分鐘，經(jīng)噴霧干燥成微粒；噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180～200℃，出口溫度為60～90℃；
b.絲素蛋白溶液的制備：將75g生蠶絲在4L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸1小時(shí)，然后用大量去離子水清洗以去除絲膠蛋白，60～70℃下烘干，獲絲素蛋白。將適量絲素蛋白在80±2℃下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液中，在室溫條件下去離子水透析3d，去除溶液中的鹽和乙醇，過濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲素蛋白的水溶液；將絲素蛋白水溶液在50±2℃、50～60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s，獲得濃度約7～10w/v％的絲素蛋白溶液；
c.微載體的生成：將34.65公斤聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在50升0.7w/v％酸性的含絲素蛋白溶液中，并將溶液蒸發(fā)至干；然后將干燥的絲素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在含有蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如戊二醛)的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，將絲素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微載體；通過該技術(shù)，絲素蛋白涂層因此交聯(lián)，從而使得后續(xù)使用而不會(huì)再溶解或變得無活性；然后將固定有絲素蛋白的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗數(shù)次以除去未反應(yīng)的戊二醛，最后將珠干燥、經(jīng)鈷60γ射線輻照消毒并包裝。
實(shí)施例三：
a.微量元素的配制：在40℃水中按照質(zhì)量配比為100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，攪拌升溫至75℃，然后加入質(zhì)量百分比為0.7％的過硫酸鉀，反應(yīng)8小時(shí)后停止反應(yīng)，經(jīng)破乳過濾洗滌干燥后備用；
b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制備：將質(zhì)量百分比為聚苯乙烯55％，聚乳酸42％和步驟a得到的微量元素1.0％；在高速分散機(jī)中混合10分鐘，經(jīng)噴霧干燥成微粒；噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180～200℃，出口溫度為60～90℃；
c.絲素蛋白溶液的制備：將75g生蠶絲在4L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸1小時(shí)，然后用大量去離子水清洗以去除絲膠蛋白，60～70℃下烘干，獲絲素蛋白。將適量絲素蛋白在80±2℃下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液中，在室溫條件下去離子水透析3d，去除溶液中的鹽和乙醇，過濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲素蛋白的水溶液；將絲素蛋白水溶液在50±2℃、50～60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s，獲得濃度約7～10w/v％的絲素蛋白溶液；
d.微載體的生成：將28.0公斤聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在50升0.7w/v％酸性的含絲素蛋白溶液中，并將溶液蒸發(fā)至干；然后將干燥的絲素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在含有蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如戊二醛)的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，將絲素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微載體；通過該技術(shù)，絲素蛋白涂層因此交聯(lián)，從而使得后續(xù)使用而不會(huì)再溶解或變得無活性；然后將固定有絲素蛋白的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗數(shù)次以除去未反應(yīng)的戊二醛，最后將珠干燥、經(jīng)鈷60γ射線輻照消毒并包裝。
實(shí)施例四：
a.微量元素的配制：在40℃水中按照質(zhì)量配比為100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，攪拌升溫至75℃，然后加入質(zhì)量百分比為0.7％的過硫酸鉀，反應(yīng)8小時(shí)后停止反應(yīng)，經(jīng)破乳過濾洗滌干燥后備用；
b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制備：將質(zhì)量百分比為聚苯乙烯55％，聚乳酸42％和步驟a得到的微量元素1.0％；在高速分散機(jī)中混合10分鐘，經(jīng)噴霧干燥成微粒；噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180～200℃，出口溫度為60～90℃；
c.微載體的生成：將28.0公斤聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在50升0.7w/v％酸性的膠原溶液(0.01～0.1N乙酸)中，并將溶液蒸發(fā)至干；然后將干燥的絲素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒懸浮在含有蛋白質(zhì)交聯(lián)劑(如戊二醛)的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，將膠原包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微載體；通過該技術(shù)，膠原涂層因此交聯(lián)，從而使得后續(xù)使用而不會(huì)再溶解或變得無活性；然后將固定有膠原的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗數(shù)次以除去未反應(yīng)的戊二醛，最后將珠干燥、經(jīng)鈷60γ射線輻照消毒并包裝。
由上述實(shí)施例制造出的微載體具有廣泛但可控制的尺寸分布，這種微載體通?？梢援a(chǎn)生大約10～500μm的尺寸，一般控制在100～200μm之間；微載體的密度：一般為1.03～1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。具有無毒性、無抗原性、細(xì)胞貼壁好、可降解等優(yōu)點(diǎn)。
應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。