基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物微分子提取【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法，本發(fā)明利用多年生人參的根細(xì)胞培養(yǎng)，利用酶技術(shù)縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)人參皂甙及多糖的方法。本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)法來培養(yǎng)和生產(chǎn)人參植物細(xì)胞，進(jìn)而提取人參皂甙和多糖，種子細(xì)胞收集時(shí)加入纖維素酶，能提高種子細(xì)胞收集率5%-10%，種子細(xì)胞培養(yǎng)中，加入生長素、果膠酶能誘使組織細(xì)胞加快生長繁殖，縮短培養(yǎng)周期，約能夠減少1/4—1/6時(shí)間，有效降低了培養(yǎng)過程的感染率，提高產(chǎn)品收率。本發(fā)明工藝簡單、穩(wěn)定，并利用了酶技術(shù)縮短了細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高收率，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物微分子提取【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]人參皂甙是人參的主要成分，可延緩神經(jīng)細(xì)胞衰老并降低老年發(fā)生的記憶損傷，具有穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)和促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的作用，可以提高記憶力。人參皂甙及單體、多糖廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化工等很多領(lǐng)域，隨著社會高速發(fā)展，其用量越來越大，價(jià)格成本越來越高，但傳統(tǒng)人參皂甙及多糖的提取方法是用人參的根、莖、葉、須根等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)越來越不能滿足市場的需求。
[0003]隨著生物技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培樣繁殖提取植物的次代謝產(chǎn)物，不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)人參皂甙及單體、多糖的技術(shù)，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在工業(yè)化生產(chǎn)推廣過程中也存在很多難題問題，如工藝復(fù)雜、條件苛刻、易污染、收率低等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了克服上述技術(shù)缺點(diǎn)提供基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法。
[0005]本發(fā)明解決技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為:基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法，，是一種利用多年生人參的根細(xì)胞培養(yǎng)，利用酶技術(shù)縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)人參皂甙及多糖的方法。具體步驟在下面進(jìn)行闡述。
[0006](1)種子細(xì)胞采集:
[0007]①取新鮮的多年生人參的根清洗消毒，將洗凈的人參塊根用10-20%次氯酸鈉溶液浸泡10-30分鐘，用無菌水清洗塊根至次氯酸鈉無殘留；
[0008]②將清潔后的塊根放入打衆(zhòng)機(jī)加入MS (Murashige-Skoog)培養(yǎng)基,每1.5g加入10ml，打漿；
[0009]③將打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3-5小時(shí)，用50_80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機(jī)分離，去雜質(zhì)及上清液收集種子細(xì)胞；
[0010](2)種子細(xì)胞培養(yǎng):
[0011]①將收集到的種子細(xì)胞接種到含改良MS培養(yǎng)基的種子罐(瓶)中，接種量為10-20(鮮種量)/L，調(diào) pH5-6，溫度 20-25°C ；
[0012]②搖床或震蕩種子罐培養(yǎng)20-30小時(shí)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量20000-40000個(gè)/ml，即可擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0013](3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng):
[0014]①將培養(yǎng)好的種子細(xì)胞接種于有機(jī)械攪拌的生物反應(yīng)器內(nèi)，懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基用改良的MS培養(yǎng)基，接種量為15-25g (鮮種)/L，攪拌速率90-120r/min，pH5_6，通入過濾空氣，速率 0.01-0.05m3/s ；
[0015]②加入生長素2，4_D (2，4-dichlorophenoxy、2, 4_ 二氯苯氧乙酸)0.5-lmg/L,果膠酶50-80mg/L，暗培養(yǎng)20-25天，細(xì)胞計(jì)數(shù)35000-50000/ml即停止培養(yǎng)；
[0016](4)采用離心或其他方法收集人參植物細(xì)胞，即可用常規(guī)方法提取人參皂甙及多糖。
[0017]本發(fā)明中，在種子細(xì)胞收集時(shí)加入纖維素酶，能提高種子細(xì)胞收集率5%_10%，在種子細(xì)胞培養(yǎng)中，加入生長素、果膠酶能誘使組織細(xì)胞加快生長繁殖，縮短培養(yǎng)周期，約能夠減少1/4一 1/6時(shí)間。
[0018]本發(fā)明所具有的有益效果是:本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)法來培養(yǎng)和生產(chǎn)人參植物細(xì)胞，進(jìn)而提取人參皂甙和多糖，種子細(xì)胞收集時(shí)加入纖維素酶，能提高種子細(xì)胞收集率5%-10%，種子細(xì)胞培養(yǎng)中，加入生長素、果膠酶能誘使組織細(xì)胞加快生長繁殖，縮短培養(yǎng)周期，有效降低了培養(yǎng)過程的感染率，提高產(chǎn)品收率。本發(fā)明工藝簡單、穩(wěn)定，并利用了酶技術(shù)縮短了細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高收率，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0019]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
[0020]1、細(xì)胞培養(yǎng)階段:
[0021](1)種子細(xì)胞采集:
[0022]①取新鮮的多年生人參的根清洗消毒，將洗凈的人參塊根用10%次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘，用無菌水清洗塊根至次氯酸鈉無殘留；
[0023]②將清潔后的塊根放入打漿機(jī)加入MS培養(yǎng)基，每1.5g加入10ml，打漿；
[0024]③將打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3小時(shí)，用50微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機(jī)分離，去雜質(zhì)及上清液收集種子細(xì)胞；
[0025](2)種子細(xì)胞培養(yǎng):
[0026]①將收集到的種子細(xì)胞接種到含改良MS培養(yǎng)基的種子罐(瓶)中，接種量為20g/L，調(diào) pH6，溫度 25。。；
[0027]②搖床或震蕩種子罐培養(yǎng)24小時(shí)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量20000-40000個(gè)/ml，即可擴(kuò)大培養(yǎng);
[0028](3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng):
[0029]①將培養(yǎng)好的種子細(xì)胞接種于有機(jī)械攪拌的生物反應(yīng)器內(nèi)，懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基用改良的MS培養(yǎng)基，接種量為20g/L，攪拌速率120r/min，pH6，通入過濾空氣，速率0.03m3/s ；
[0030]②加入生長素2，4-Dlmg/L,果膠酶80mg/L，暗培養(yǎng)20天，細(xì)胞計(jì)數(shù)35000-50000/ml即停止培養(yǎng)；
[0031]2、提取階段:
[0032]稱取本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)出得人參細(xì)胞組織，40目磨碎過篩，取15克，加甲醇300ml于索氏提取器加熱回流8小時(shí)換取溶劑一次，共提3次，合并提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓蒸去甲醇至淺黃色浸膏狀。浸膏殘留物加50ml水溶解，溶解液移入分液漏斗，每次用30ml乙醚脫脂，共8次，棄醚底。水層用50ml飽和水正丁醇萃取8次，合并正丁醇提取液，減壓回收正丁醇至干，得淺黃色粉末為粗人參總皂甙，重0.632g，產(chǎn)率4.2%。
[0033]去上述提取的粗皂甙分別加1?2ml甲醇溶解，將甲醇溶液緩慢逐漸滴入20ml丙酮溶液，劇烈攪拌，皂甙以白色絮狀沉淀析出，離心，80°C鼓風(fēng)干燥，后置于干燥器內(nèi)干燥2天稱重，得精制人參總皂甙0.594g。
[0034]3、鑒定階段:
[0035]①顏色反應(yīng):取總皂甙樣本少去，加冰醋酸1ml溶解，緩緩加入濃硫酸2ml。兩液界面由紅色變?yōu)榧t棕色，最后呈暗棕色。
[0036]②比色鑒定:取總皂甙l(fā)mg，用少量醇溶解，吸取100μ 1于試管中，加5%香莢醛-冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml混勻、密塞，置60°C水浴加熱15min，取出冷卻至室溫，顯紫色。
[0037]③薄層層析:取總皂甙5mg加少量甲醇溶解，以硅膠G薄層(涼開，105°C活化40min)層離。以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)展開，以硫酸-水(1:1)作顯色劑噴霧后涼開，105°C加熱15min，顯紫色斑點(diǎn)，以碘蒸氣顯色(將點(diǎn)樣后硅膠板置碘氣缸中數(shù)秒取出)，顯黃色斑點(diǎn)。
[0038]4、得出結(jié)論:通過上述的提取和鑒定，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)的產(chǎn)物為人參皂甙，并無別的可能。同時(shí)，由于在細(xì)胞收集和培養(yǎng)過程中采用了纖維素酶和生長素、果膠酶，使得生產(chǎn)的流程相應(yīng)縮短，產(chǎn)率略有提高。
【權(quán)利要求】
1.基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的人參皂甙提取方法，其特征在于，，是一種利用多年生人參的根細(xì)胞培養(yǎng)，利用酶技術(shù)縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)人參皂甙及多糖的方法，具體流程為: (1)種子細(xì)胞采集: ①取新鮮的多年生人參的根清洗消毒，將洗凈的人參塊根用10-20%次氯酸鈉溶液浸泡10-30分鐘，用無菌水清洗塊根至次氯酸鈉無殘留； ②將清潔后的塊根放入打漿機(jī)加入MS培養(yǎng)基，每1.5g加入10ml，打漿； ③將打漿液加入纖維素酶100mg/kg，放置3-5小時(shí)，用50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液用低速離心機(jī)分離，去雜質(zhì)及上清液收集種子細(xì)胞； (2)種子細(xì)胞培養(yǎng): ①將收集到的種子細(xì)胞接種到含改良MS培養(yǎng)基的種子罐中，接種量為10-20g/L，調(diào)PH5-6，溫度 20-25 °C ； ②搖床或震蕩種子罐培養(yǎng)20-30小時(shí)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量20000-40000個(gè)/ml，即可擴(kuò)大培養(yǎng); (3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng): ①將培養(yǎng)好的種子細(xì)胞接種于有機(jī)械攪拌的生物反應(yīng)器內(nèi)，懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基用改良的MS培養(yǎng)基，接種量為15-25g/L，攪拌速率90-120r/min，pH5_6，通入過濾空氣，速率.0.01-0.05m3/s ; ②加入生長素2，4-D0.5-lmg/L,果膠酶50_80mg/L，暗培養(yǎng)20-25天，細(xì)胞計(jì)數(shù).35000-50000/ml即停止培養(yǎng)； (4)采用離心或其他方法收集人參植物細(xì)胞，即可用常規(guī)方法提取人參皂甙及多糖。
【文檔編號】C07J17/00GK104342399SQ201310336081
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】李肖利 申請人:鄭州同心創(chuàng)遠(yuǎn)生物科技有限公司