專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)微槽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)微槽(micro-chamber)，更具體地，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)微槽，通過(guò)其在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)時(shí)可以將細(xì)胞培養(yǎng)在一個(gè)細(xì)胞單位中。
背景技術(shù)：
到目前為止，對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)變化以及細(xì)胞對(duì)某些化學(xué)制劑的反應(yīng)的觀察通常是觀測(cè)基于一群細(xì)胞的某些數(shù)值的平均值，假設(shè)這群細(xì)胞來(lái)自于同一個(gè)細(xì)胞。但是實(shí)際上，一群細(xì)胞的細(xì)胞周期通常并不一致。因而各個(gè)細(xì)胞在不同周期發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)。
為了解決這些問(wèn)題，研發(fā)了諸如同步培養(yǎng)方法(synchronousculture process)等技術(shù)。但是，由于培養(yǎng)的細(xì)胞不是來(lái)自于一個(gè)完全相同的細(xì)胞，使得在蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)上的差異可能是由于在培養(yǎng)前衍生的各個(gè)細(xì)胞的基因不同所導(dǎo)致的。這樣，在分析對(duì)于刺激的反應(yīng)時(shí)，很難判斷反應(yīng)的差別到底是細(xì)胞本身反應(yīng)機(jī)制的一般應(yīng)答還是由于細(xì)胞存在差異(即基因信息上的差異)。
同樣地，對(duì)于細(xì)胞系也很難斷定對(duì)刺激反應(yīng)的再現(xiàn)性的差異是否是由于每個(gè)細(xì)胞基因不同而造成的，因?yàn)橥ǔＦ洳皇怯梢粋€(gè)完全相同的細(xì)胞培養(yǎng)出來(lái)的。
而且，由于對(duì)于細(xì)胞的刺激(信號(hào))通常有兩種類型，一種是通過(guò)細(xì)胞周?chē)芤褐泻械男盘?hào)物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物及溶解的氣體的量給予，另一種是通過(guò)細(xì)胞間的物理接觸提供，所以也造成了難于判斷差異的情形。
另一方面，到目前為止，在生物技術(shù)領(lǐng)域觀察細(xì)胞時(shí)，通常是從一個(gè)大的培養(yǎng)容器中取出一部分培養(yǎng)的細(xì)胞群放在顯微鏡下觀察，或者是通過(guò)將整個(gè)顯微鏡裝入一個(gè)塑料容器中控制溫度，然后將一個(gè)小容器放入大容器中并調(diào)節(jié)二氧化碳濃度和濕度進(jìn)行觀察。然后設(shè)計(jì)成在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)可以用新鮮培養(yǎng)液更換已經(jīng)使用的培養(yǎng)液，從而維持所述溶液條件恒定。
例如，有一種通過(guò)一種機(jī)制維持營(yíng)養(yǎng)條件恒定的方法，其中一個(gè)循環(huán)泵根據(jù)基質(zhì)表面，在高于基質(zhì)上緣水平和低于基質(zhì)下緣水平之間向上和向下操縱培養(yǎng)基的水平，由此當(dāng)水平降低到較低水平時(shí)，培養(yǎng)基就被注入；當(dāng)水平升高到較高水平時(shí)，培養(yǎng)基就被排出(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)Hei 10-191961)。
另外，一種維持培養(yǎng)容器營(yíng)養(yǎng)條件恒定的方法是將進(jìn)口管的一端插入培養(yǎng)容器以向培養(yǎng)容器中導(dǎo)入新鮮培養(yǎng)基，將出口管的一端插入培養(yǎng)容器以從培養(yǎng)容器中排出培養(yǎng)基和將氣體管的一端插入培養(yǎng)容器以通過(guò)泵交換培養(yǎng)容器中的氣體部分，其中進(jìn)口管、出口管和氣體管在其各自管道上都安裝上過(guò)濾器以防止細(xì)菌侵入培養(yǎng)容器(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)Hei 8-172956)。
然而，這兩種方法都不能在控制要培養(yǎng)的細(xì)胞的溶液環(huán)境以及細(xì)胞間的物理接觸時(shí)培養(yǎng)所述培養(yǎng)細(xì)胞。
因此，本發(fā)明人解決了這些問(wèn)題，本發(fā)明人發(fā)明了可以只選擇一個(gè)特異的新的細(xì)胞并且培養(yǎng)這個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞系的一種技術(shù)，其中在觀察細(xì)胞的時(shí)候可以控制細(xì)胞的溶液環(huán)境條件并維持容器中細(xì)胞濃度恒定的一種技術(shù)，以及在研究細(xì)胞間相互作用時(shí)觀察培養(yǎng)物的一種技術(shù)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)2002-153260)。
本發(fā)明要解決的問(wèn)題但是，上述專利申請(qǐng)(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(Kokai)2002-153260)中所使用的光夾(photo pincette)技術(shù)，其捕獲能力的范圍在pN(piconewton)的程度，其足以捕獲懸浮細(xì)胞但不足以捕獲自遷移的細(xì)胞。而且，它也很難在培養(yǎng)時(shí)從培養(yǎng)區(qū)中選擇性回收遷移細(xì)胞。
因此，本發(fā)明人對(duì)上述微槽進(jìn)行了很多研究，并發(fā)明了一種新的微槽，其中在培養(yǎng)時(shí)能夠在微槽中選擇性回收遷移細(xì)胞的通路可以通過(guò)可逆改變微槽的形狀來(lái)開(kāi)啟或關(guān)閉。
解決問(wèn)題的方法本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)微槽包括一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)，至少2個(gè)連接細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)與外界的通路，開(kāi)啟或關(guān)閉通路的裝置(means)以及光學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)及開(kāi)啟或關(guān)閉通路的裝置，其中一個(gè)通路是通過(guò)它可以將可能含有細(xì)胞的培養(yǎng)液注入到細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的流體通路，而另外一個(gè)通路是通過(guò)它可以將可能含有細(xì)胞的培養(yǎng)液從細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)排出的流體通路，所述通路的至少一部分由彈性材料包圍，且所述開(kāi)啟和關(guān)閉裝置用于通過(guò)基本垂直于光學(xué)觀察裝置的觀察方向從外部擠壓或牽拉所述通路來(lái)開(kāi)啟或關(guān)閉通路或改變通路的寬度。
這里用到的光學(xué)觀察裝置包括光學(xué)顯微鏡、錄影設(shè)備、照相機(jī)等等。它們可以連接個(gè)人電腦等進(jìn)行圖像處理。為了觀察方便，它們也可以同時(shí)與照明裝置一起使用。
優(yōu)選在沒(méi)有操縱開(kāi)啟和關(guān)閉裝置的時(shí)候通路的寬度與靶細(xì)胞的大小是相同的程度。因此，根據(jù)靶細(xì)胞大小的不同，合適的通路寬度也可以變化。當(dāng)在沒(méi)有操縱開(kāi)啟和關(guān)閉裝置的時(shí)候通路的寬度小于靶細(xì)胞大小時(shí)，細(xì)胞在正常狀態(tài)下不能夠通過(guò)通路，只有在通路打開(kāi)時(shí)才能通過(guò)。因此，這個(gè)結(jié)構(gòu)適于分離細(xì)胞。
開(kāi)啟和關(guān)閉裝置可以是通過(guò)外力作用于通路來(lái)開(kāi)啟或關(guān)閉通路或改變通路的寬度。其可以是任何應(yīng)用機(jī)械力量的裝置或者是引起空間體積變化的裝置等。
優(yōu)選開(kāi)啟和關(guān)閉裝置在鄰近通路處有一空隙，所述空隙充入氣體或液體，空隙的大小通過(guò)改變氣體或液體的壓力來(lái)改變，從而開(kāi)啟或關(guān)閉通路或改變通路寬度。最常用的方法是這個(gè)空隙充入空氣，這樣形成的充入空氣的空隙可以用作空氣池(reservoir)，從而通過(guò)氣壓來(lái)控制通路的開(kāi)啟或關(guān)閉。
通路可以完全用彈性材料包圍，或者也可以只用彈性材料制造其開(kāi)啟和關(guān)閉裝置。優(yōu)選空隙和通路采用相同的包圍材料，這樣空隙大小的改變可以直接影響通路的寬度。
彈性材料可以是任何彈性材料。通常使用對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)物無(wú)有害作用的合成聚合物。具體地，優(yōu)選彈性材料是硅氧烷型樹(shù)脂。
為了光學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)并開(kāi)啟或關(guān)閉細(xì)胞培養(yǎng)微槽的通路，優(yōu)選僅用透明材料制造必需的部分。整體可以用透明彈性材料制造。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為本發(fā)明的基本構(gòu)造一個(gè)實(shí)例的示意圖。
圖2為通路開(kāi)啟或關(guān)閉方法的一個(gè)實(shí)例的示意圖。
圖3為細(xì)胞培養(yǎng)微槽制作方法的一個(gè)實(shí)例的顯微照片。
圖4為本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)微槽制造方法中使用的模具和聚合物細(xì)胞培養(yǎng)微槽的一個(gè)實(shí)例的顯微照片。
圖5為細(xì)胞培養(yǎng)微槽通路開(kāi)啟和關(guān)閉狀態(tài)的顯微照片。
圖6為一個(gè)細(xì)胞通過(guò)打開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)微槽的通路的顯微照片，圖中箭頭所指的為細(xì)胞。
圖中所示數(shù)字說(shuō)明如下101，102連接空氣壓力控制區(qū)的接合處(connecting joint)103，104空氣通路(passage)105，106，202空氣池107溶液流(含有細(xì)胞的培養(yǎng)液)108，109，111，201，204通路110細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)112，302，304玻璃基板(glass base plate)113，303聚合物(硅氧烷型樹(shù)脂)203細(xì)胞301模具305氣壓控制區(qū)連接器(connector)本發(fā)明的實(shí)施方案以下闡述本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)微槽的細(xì)節(jié)。然而，本發(fā)明不以任何方式限制這種細(xì)胞培養(yǎng)微槽。
圖1顯示本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)微槽的基本構(gòu)造。如圖1a的水平視圖(B-B)和圖1b的縱向視圖(A-A)所示，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)微槽100包括一個(gè)在可視區(qū)光學(xué)透明的彈性聚合物上形成的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)110，空氣池105、106以通過(guò)膨脹或者壓縮來(lái)控制位于所述細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)兩端的通路108、109、111的開(kāi)啟或關(guān)閉狀態(tài)，空氣通路103、104用于壓縮或減壓空氣池，及與空氣控制區(qū)連接的接合處101、102，所有這些都安置在光學(xué)透明的基板112上，如載玻片等，從而溶液(含有細(xì)胞的培養(yǎng)液)可以連續(xù)流向流體107的方向。
如圖1所示，根據(jù)兩個(gè)通路108、109的開(kāi)啟或關(guān)閉狀態(tài)，可以從培養(yǎng)區(qū)110中捕獲或者排出培養(yǎng)的細(xì)胞。這里，開(kāi)啟或關(guān)閉通路指的是通過(guò)控制空氣池內(nèi)空氣的壓力來(lái)擴(kuò)張或收縮通路周?chē)木酆衔锉诒砻娑{(diào)節(jié)通路111的寬度。通路水平安置在平面上，與光學(xué)顯微鏡的光軸垂直，因此通路的寬度可以通過(guò)光學(xué)儀器測(cè)量。因此，例如在使用光學(xué)顯微鏡的時(shí)候，可以僅通過(guò)觀察來(lái)確定通路的寬度，即開(kāi)啟或關(guān)閉狀態(tài)，而不需要流動(dòng)樣品。因此，在這種開(kāi)放狀態(tài)的目測(cè)證實(shí)下，可以控制空氣池105、106中的氣壓。而且，利用圖像處理自動(dòng)測(cè)量這種開(kāi)放狀態(tài)，可以對(duì)預(yù)先確定的開(kāi)放狀態(tài)設(shè)置一種反饋控制。
接下來(lái)，開(kāi)啟或關(guān)閉通路如圖2所示。圖2a和b分別是水平視圖和橫截面視圖，顯示了在適度關(guān)閉通路時(shí)，只有溶液可以通過(guò)通路而細(xì)胞203不能通過(guò)。往空氣池202中導(dǎo)入空氣加壓，關(guān)閉通路204，所以可以根據(jù)其壓力程度來(lái)控制能夠通過(guò)其的細(xì)胞大小。
另一方面，圖2c和d分別示出通路開(kāi)放時(shí)的水平視圖和橫截面視圖，所以溶液和細(xì)胞都能通過(guò)通路201。將空氣池202中的空氣排出，使得通路204開(kāi)放，這樣根據(jù)其減壓程度所有的細(xì)胞都能夠通過(guò)。
圖3闡述了制作細(xì)胞培養(yǎng)微槽的方法的實(shí)例。首先，利用如光刻法等精細(xì)加工技術(shù)制作模具(圖3-1)。例如，可以在玻璃片302上光固化可以光固化的、厚壁抗蝕材料SU-8以在形成模具301。然后，光學(xué)透明的彈性聚合物可以倒入并在模具中固化以將聚合物成形為模具的形狀(圖3-2)。此處可以使用在可視區(qū)域內(nèi)光學(xué)透明的彈性聚合物材料，例如硅氧烷樹(shù)脂(聚二甲基硅氧烷等)。聚合物固化后，用打孔器在其上打孔形成貫通孔以用于空氣和溶液流動(dòng)，然后將聚合物從模具上剝離(圖3-2)。最后，該精細(xì)構(gòu)造的聚合物被粘到玻璃基板304上，其進(jìn)一步具有一個(gè)與氣壓控制區(qū)連接的連接器，以及溶液的進(jìn)口和出口。如此形成的最終產(chǎn)品就可以用作細(xì)胞培養(yǎng)的微槽。
圖4為光學(xué)顯微鏡圖，顯示了一個(gè)用可光固化的樹(shù)脂SU-8根據(jù)圖3的方法制作的細(xì)胞培養(yǎng)微槽模具(圖4a)和用模具成形后聚合物精細(xì)結(jié)構(gòu)(圖4b)的實(shí)例。由該光學(xué)顯微鏡圖中可以看出模具的精細(xì)結(jié)構(gòu)被精確地轉(zhuǎn)移給聚合物。
圖5為一系列的顯微鏡圖，顯示了本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)微槽通路的功能。圖5a顯示當(dāng)通過(guò)用空氣壓縮空氣池而關(guān)閉通路的時(shí)候，細(xì)胞和溶液都不能通過(guò)。圖5b顯示，通過(guò)用負(fù)壓抽氣空氣池的時(shí)候，通路開(kāi)放到一定程度使細(xì)胞不能通過(guò)。從這個(gè)顯微照片可以看出，細(xì)胞被溶液流帶向通路但是不能通過(guò)。通路開(kāi)放的程度可以通過(guò)光學(xué)顯微鏡目測(cè)觀察。這樣可以僅用肉眼觀察來(lái)控制通路的開(kāi)放程度，而不需要流動(dòng)細(xì)胞。圖5c顯示當(dāng)通路進(jìn)一步打開(kāi)的時(shí)候，細(xì)胞可以流出。
圖6是顯示細(xì)胞通過(guò)通路的過(guò)程的顯微照片。細(xì)胞(箭頭)從通路的左邊(圖6-1)通過(guò)通路(圖6-2)轉(zhuǎn)移到通路的右邊(圖6-3)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)微槽有以下特點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)只通過(guò)通路與外界相連，因此，細(xì)胞不會(huì)與開(kāi)啟和關(guān)閉設(shè)備等接觸，這樣不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生額外負(fù)荷。
因?yàn)殚_(kāi)啟和關(guān)閉裝置是在與觀察通路開(kāi)啟或關(guān)閉的方向基本垂直的方向，所以通路的開(kāi)啟或關(guān)閉不會(huì)影響觀察。而且，在觀察細(xì)胞是否通過(guò)通路的同時(shí)，通路開(kāi)啟或關(guān)閉的狀態(tài)也能被觀察到。
由于以上特性，其可以從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出單個(gè)細(xì)胞。
因此，其可以培養(yǎng)遷移細(xì)胞等并且控制容器中細(xì)胞的數(shù)量，這到目前為止還被認(rèn)為是不可能的。而且，它還可以在容器內(nèi)選擇性回收細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)微槽，其包括一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)、至少2個(gè)將所述細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)與外界相連的通路、開(kāi)啟或關(guān)閉通路的裝置以及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)及通路的開(kāi)啟或關(guān)閉進(jìn)行光學(xué)觀察的裝置，其中一個(gè)通路是通過(guò)它可以將可能含有細(xì)胞的培養(yǎng)液注入到細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)內(nèi)的流體通路，而另一個(gè)通路是通過(guò)它可以將可能含有細(xì)胞的培養(yǎng)液排出細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的流體通路，所述通路的至少一部分由彈性材料包圍，并且開(kāi)啟和關(guān)閉裝置用于通過(guò)與光學(xué)觀察裝置的觀察方向基本垂直的方向從外部擠壓或牽拉通路來(lái)控制通路的開(kāi)啟或關(guān)閉或者改變通路的寬度。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)微槽，其中通路的寬度在沒(méi)有操縱開(kāi)啟和關(guān)閉裝置的時(shí)候和靶細(xì)胞的大小相同。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞培養(yǎng)微槽，其中開(kāi)啟和關(guān)閉裝置在鄰近通路處有一空隙，該空隙中充入氣體或液體且該空隙大小通過(guò)改變氣體或液體的壓力而改變，從而控制通路開(kāi)啟或關(guān)閉或者改變通路的寬度。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)微槽，其中彈性材料為硅氧烷型樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在培養(yǎng)中通過(guò)可逆改變微槽的形狀來(lái)開(kāi)啟或關(guān)閉能夠選擇性回收微槽中遷移細(xì)胞的通路的新的微槽。該微槽包括都放置在光學(xué)透明的基板112如載玻片上的一個(gè)在可視區(qū)域光學(xué)透明的、在彈性聚合體中形成的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)110，位于所述培養(yǎng)區(qū)兩端的通路108、109，通過(guò)膨脹和壓縮控制通路開(kāi)啟或關(guān)閉狀態(tài)的空氣池105、106，為空氣池增壓和減壓的空氣通路103、104，以及與氣壓控制部分連接的接合處101、102，從而含有細(xì)胞的培養(yǎng)液向流體107的方向連續(xù)流動(dòng)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK1791666SQ20048001388
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者安田賢二, 高橋一憲 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)