專利名稱：一種在三七細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三七細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種誘導(dǎo)原人參三醇型皂甙甙元合成酶即原人參二醇-6-羥化酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)人參皂甙的成分比例等，提高原人參三醇型皂甙含量及生產(chǎn)率的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又稱田七、三七參、人參三七等，為五加科人參屬植物，主要分布于中國(guó)西南部的云南、廣西等地。
《本草綱目》中載有其藥用功效，如活血化瘀、鎮(zhèn)定止痛、止血補(bǔ)血和滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究揭示了三萜類人參皂甙是其主要生物活性成分之一。人參皂甙并非單一成分，它們種類多，根據(jù)其甙元的不同可分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂甙和齊墩果烷型五環(huán)三萜皂甙。已經(jīng)證明達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂甙比齊墩果烷型五環(huán)三萜皂甙具有更強(qiáng)的生物活性，前者又分為原人參二醇型(如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3等)和原人參三醇型(如Rg1、Rg2、Rg1、Re等)人參皂甙。各人參皂甙單體的生物活性不一，有的甚至相反。例如，Rb1、Rb2抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Rg1興奮中樞神經(jīng)(鄭光植等，三七生物學(xué)及其應(yīng)用，1994)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Re具有明顯的抗高血糖活性(Attele等，Diabetes 2002，61851-1858)，可能成為一類新型抗糖尿病藥物；人參皂甙Re和Rg1具有抑制神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡作用(Xu等，J Asian Nat Prod Res 2005，7215-224；Chen等，Eur JPharmacal 2003，4731-7)，可能成為一類新型治療帕金森等神經(jīng)性疾病的藥物。原人參三醇型人參皂甙Rg1和Re新生物活性的發(fā)現(xiàn)使其備受關(guān)注。
近年來(lái)，商業(yè)化人參產(chǎn)品已覆蓋許多國(guó)家，僅人參原材料2002年的銷量已超過(guò)12億美元(金在漢，碩士學(xué)位論文，2004)。
細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)人參皂甙有效成份，由于生產(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種更有效的可操作的方法，因此，利用細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)人參皂甙具有較大的市場(chǎng)潛力。由于不同人參皂甙組分的生理活性的差別大，使得總?cè)藚⒃磉?各單體人參皂甙的混合物)較難顯示良好的原人參三醇型人參皂甙的專一生物活性。并且，如上述，各單體人參皂甙的分子結(jié)構(gòu)非常相似、理化性質(zhì)也相近，故難以簡(jiǎn)單把它們分離開來(lái)；即使能分離獲得，由此也會(huì)大大增加生產(chǎn)成本，這使得以目前的技術(shù)用原人參三醇型人參皂甙單體開發(fā)新藥較為困難。
Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)以及鐘建江和王威(中國(guó)發(fā)明專利，ZL 01126882.4)報(bào)道了茉莉酮酸類化合物能提高三七細(xì)胞的皂甙含量和改變單體含量比例，但這些工作是側(cè)重提高原人參二醇型人參皂甙(Rb1)與原人參三醇型人參皂甙(Rg1+Re)的含量的比例。如果能對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中各單體皂甙的積累進(jìn)行更好調(diào)控，使其生產(chǎn)更多的原人參三醇型人參皂甙，對(duì)于其商業(yè)應(yīng)用無(wú)疑具有重要價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開一利在三七細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的無(wú)法提高原人參三醇型人參皂甙含量占總?cè)藚⒃磉昂勘壤蜕a(chǎn)率偏低的缺陷，為工業(yè)化經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)原人參三醇型人參皂甙奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的本發(fā)明在在三七細(xì)胞培養(yǎng)基中添加苯巴比妥，誘導(dǎo)原人參二醇-6-羥化酶(P6H)的活性，從而來(lái)提高三七細(xì)胞原人參三醇型人參皂甙含量比例和生產(chǎn)率。
本發(fā)明的方法包括如下步驟將三七(Panax notoginseng)種子細(xì)胞在添加有苯巴比妥的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；所說(shuō)的MS培養(yǎng)基在文獻(xiàn)Murashige等(Plant Physiol 1962，15473-479)中已經(jīng)有公開的報(bào)道；每隔10-15天傳代一次，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)；所說(shuō)的三七細(xì)胞的來(lái)源，在發(fā)明人以往的專利(中國(guó)發(fā)明專利，ZL 01126882.4)中已經(jīng)公開報(bào)道，具體如下三七種子經(jīng)消毒后誘導(dǎo)出無(wú)菌三七植株，從無(wú)菌三七植株剪取0.5-1.0cm長(zhǎng)的胚根，在添加有0-20mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0-10mg/L6-糠基氨基嘌呤(KT)及10-30g/L蔗糖的MS瓊脂培養(yǎng)基中于20-30℃下暗培養(yǎng)，2-4周后長(zhǎng)出愈傷組織。選擇較旺盛生長(zhǎng)的愈傷組織接種到裝有50ml新鮮培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，培養(yǎng)基為添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。每隔10～15天傳代一次，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)。
培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.001～10.0mM，特別優(yōu)選的為0.01-5.0mM。
培養(yǎng)基中添加苯巴比妥的時(shí)間為培養(yǎng)期間的第0～15天，即苯巴比妥可在培養(yǎng)初期加入培養(yǎng)基，或在培養(yǎng)過(guò)程中加入培養(yǎng)基；所說(shuō)的苯巴比妥可采用商業(yè)化的產(chǎn)品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下C12H12O3N2分子量為232.24人參單體皂甙可通過(guò)高壓液相色譜法(Wang W & Zhong JJ，J BiosciBioeng 2002，9348-53)測(cè)定。
本發(fā)明的方法，可顯著提高P6H酶的活性和原人參三醇型皂甙(Rg1+Re)含量，使原人參三醇型皂甙占總皂甙含量達(dá)85％，同時(shí)原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率提高了約2倍。這表明通過(guò)添加苯巴比妥誘導(dǎo)P6H，可有效調(diào)節(jié)單體皂甙組份的多樣性并增強(qiáng)三七培養(yǎng)細(xì)胞原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)能力，顯示了本發(fā)明的方法具備工業(yè)化實(shí)施的前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)采用的是由多年生三七植株的根誘導(dǎo)而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)細(xì)胞。對(duì)照培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖。將真空過(guò)濾所得濕細(xì)胞2g接種到裝有50ml新鮮培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，25℃暗培養(yǎng)，細(xì)胞在40℃干燥后稱重。P6H活性誘導(dǎo)和單體皂甙的調(diào)控方法是于培養(yǎng)第4天添加苯巴比妥。P6H活性的測(cè)定依照岳才軍(博士論文，2005)介紹的方法；干細(xì)胞按照Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)的方法萃取處理后高效液相色譜分析各單體皂甙的含量。結(jié)果見(jiàn)表1和表2(培養(yǎng)13天)。
實(shí)施例2單體皂甙的調(diào)控采用對(duì)照培養(yǎng)基在不同時(shí)間添加0.5mM苯巴比妥，其它條件同實(shí)例1。結(jié)果見(jiàn)表3和表4(培養(yǎng)13天)。
表1.不同濃度苯巴比妥(PB)對(duì)P6H酶活性的誘導(dǎo)作用

*kat每秒鐘每毫克蛋白合成原人參三醇的摩爾數(shù)；f＝1×10-15。
表2.不同濃度苯巴比妥(PB)對(duì)三七培養(yǎng)細(xì)胞人參皂甙含量比例和原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率的影響

*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生產(chǎn)率是指原人參三醇型人參皂甙(Rg1+Re)的生產(chǎn)率。
表3.不同時(shí)間添加苯巴比妥(PB)對(duì)P6H酶活性的誘導(dǎo)作用

*kat每秒鐘每毫克蛋白合成原人參三醇的摩爾數(shù)；f＝1×10-15。
表4.不同時(shí)間添加苯巴比妥(PB)對(duì)三七培養(yǎng)細(xì)胞人參皂甙含量比例和原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率的影響

*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生產(chǎn)率是指原人參三醇型皂甙(Rg1+Re)的生產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種在三七細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括將三七(Panax notoginseng)種子細(xì)胞在添加有苯巴比妥的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，每隔10-15天傳代一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，搖床轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.001～10.0mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.01-5.0mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加苯巴比妥的時(shí)間為培養(yǎng)期間的第0～15天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在三七細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法是基于對(duì)原人參三醇型皂甙甙元(原人參三醇)的合成酶酶活水平的操作。在三七細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加原人參三醇合成酶酶活的誘導(dǎo)劑苯巴比妥，有效提高了原人參三醇型皂甙含量占總皂甙含量的比例和生產(chǎn)率。占總皂甙含量可達(dá)85％，生產(chǎn)率約提高了2倍。本發(fā)明所述的方法克服了現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)存在的原人參三醇型皂甙含量占總?cè)藚⒃磉昂勘壤蜕a(chǎn)率偏低的缺陷，為工業(yè)化經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)原人參三醇型皂甙奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P33/00GK1710093SQ200510027538
公開日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月6日
發(fā)明者鐘建江, 岳才軍 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 上海穎興生物科技有限公司