發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞的限定的(defined)表面。特別是，本發(fā)明提供了對(duì)在限定的細(xì)胞培養(yǎng)表面培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞和其他成體干細(xì)胞所需的材料和方法。

背景技術(shù)：

人類胚胎干細(xì)胞(hES)通常需要基底和培養(yǎng)基以保持無(wú)限期自我更新和多能性的特點(diǎn)。最常見的培養(yǎng)hES細(xì)胞的基底是生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)(TC)聚苯乙烯表面或涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的TC培養(yǎng)容器，例如：BD Matrigel^TM涂覆的TC培養(yǎng)容器上的不活躍的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的單層。對(duì)這兩種基底的限定都不佳，并且存在高度的實(shí)驗(yàn)變異性。由于人胚胎干細(xì)胞(hES)被認(rèn)為在促進(jìn)發(fā)育生物學(xué)知識(shí)、藥物發(fā)現(xiàn)方面具有顯著有效的影響，并且在今后的臨床應(yīng)用中可能發(fā)揮重要作用，因此鑒定這些細(xì)胞在限定的表面上的培養(yǎng)條件是非常重要的。

發(fā)明概述

一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)基底，包括：具有薄膜粘附于其上的細(xì)胞培養(yǎng)表面，其中所述薄膜包含一種或多種等離子聚合單體；以及在涂覆有薄膜的表面上的涂層，該涂層(coating)從包括一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和水性溶劑的涂覆溶液(coating solution)中沉積形成，其中涂覆溶液中總細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的濃度為約1ng/mL到約1mg/mL。

在其他方面，本發(fā)明還提供了一種制備細(xì)胞培養(yǎng)基底的方法，包括：提供細(xì)胞培養(yǎng)表面；將薄膜等離子聚合到該表面上以形成涂覆有薄膜的表面，其中等離子聚合利用一種或多種單體；以及引入涂覆溶液到薄膜涂覆的表面以形成細(xì)胞培養(yǎng)基底，該涂覆溶液包括一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和水性溶劑，其中涂覆溶液中總細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的濃度為約1ng/mL到約1mg/mL。

在某些方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，包括：提供細(xì)胞培養(yǎng)基底；將干細(xì)胞的懸浮液應(yīng)用至細(xì)胞培養(yǎng)基底；在37℃，含5％二氧化碳的潮濕空氣條件中孵育在所述細(xì)胞培養(yǎng)基底上的干細(xì)胞；以及允許干細(xì)胞粘附在所述細(xì)胞培養(yǎng)基底上，其中粘附的細(xì)胞主要保持在未分化狀態(tài)。除非在介質(zhì)中使用特定的分化因子誘導(dǎo)分化(例如：實(shí)施例10)。

更有利的一方面，本發(fā)明還可能提供了一種使干細(xì)胞具有良好的粘附特性、同時(shí)又有利于避免干細(xì)胞分化的細(xì)胞培養(yǎng)基底。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：比較描述接種于各種基底上的結(jié)晶紫染色的人胚胎干細(xì)胞(hES)的細(xì)胞集落粘附情況：涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)，更具體地說(shuō)，Matrigel^TM，一種復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白混合物(圖1A)的組織培養(yǎng)(TC)處理的聚苯乙烯培養(yǎng)板，涂覆有人纖維連接蛋白TC處理的聚苯乙烯培養(yǎng)板(圖1B)；和涂覆有人纖連蛋白(圖1C)和生長(zhǎng)介質(zhì)的等離子聚合培養(yǎng)板。

圖2比較在選擇的基底上的典型hES細(xì)胞的集落形態(tài)學(xué)：傳代18代之后的，涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)(如，Matrigel^TM)的TC培養(yǎng)板(圖2A),和涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板(圖2B)。

圖3未分化的hES細(xì)胞(H9系)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，其在核內(nèi)表達(dá)OCT-3/4標(biāo)志蛋白。細(xì)胞用生長(zhǎng)介質(zhì)培養(yǎng),分別在涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板(圖3B)和涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)(如，Matrigel^TM)的TC培養(yǎng)板(陽(yáng)性對(duì)照，圖3A)上培養(yǎng)。

圖4生長(zhǎng)在涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板和涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)(如，Matrigel^TM)的TC培養(yǎng)板(陽(yáng)性對(duì)照)上的未分化的hES細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況的定量熒光活化細(xì)胞分檢器(FACS))分析。

圖5生長(zhǎng)在涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板和涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)(如：Matrigel^TM)的TC培養(yǎng)板(陽(yáng)性對(duì)照)上的hES細(xì)胞形成的胚狀體中，種系特異性標(biāo)志物基因的表達(dá)情況的定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)分析。

圖6在hES細(xì)胞來(lái)源的分化的細(xì)胞中，種系特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況的免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析。

圖7集中于層中的hFN的圖像表示及示意圖。圖7A對(duì)涂覆有不同濃度的人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板和TC培養(yǎng)板上結(jié)合的纖連蛋白含量的比較，并通過(guò)抗人纖連蛋白ELISA檢測(cè)。圖7B在涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板上生長(zhǎng)3天的hES細(xì)胞(H9系)的結(jié)晶紫染色。

圖8人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在含血清的MSC介質(zhì)中在組織培養(yǎng)培養(yǎng)板(圖8A)上和在無(wú)血清的MSC介質(zhì)中在涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板(圖8B)上的粘附情況和生長(zhǎng)情況的比較。

圖9人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化成脂肪細(xì)胞的分化潛能的比較。將傳代5代后的MSCs接種于未涂覆的組織培養(yǎng)培養(yǎng)板上(圖9A)或接種于涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板上，并用脂肪形成介質(zhì)誘導(dǎo)(圖9B)。鋪在組織培養(yǎng)板上的細(xì)胞之前用含血清的介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。鋪在涂覆有纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板上的細(xì)胞之前在同樣表面用不含血清的MSC介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。

圖10 hES細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞在組織培養(yǎng)板和等離子聚合培養(yǎng)板上的粘附情況和生長(zhǎng)情況的比較。將細(xì)胞接種在未涂覆的組織培養(yǎng)培養(yǎng)板(圖10a)，順序涂覆有多聚鳥氨酸和層粘連蛋白的組織培養(yǎng)培養(yǎng)板(圖10b)，未涂覆的等離子聚合培養(yǎng)板(圖10c)和涂覆有人纖連蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板(圖10d)上。

圖11 hES細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞在組織培養(yǎng)培養(yǎng)板、涂覆有或未涂覆各種ECM蛋白的等離子聚合培養(yǎng)板上的粘附情況和生長(zhǎng)情況的比較。

圖12該圖表描述了MTS測(cè)定法檢測(cè)hES細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞的生存能力。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了一種限定的細(xì)胞培養(yǎng)基底，該基底能夠在更長(zhǎng)的時(shí)間培養(yǎng)中，使得處于未分化狀態(tài)的干細(xì)胞繁殖，并且維持其自我更新與多能性的特點(diǎn)。本發(fā)明的限定的培養(yǎng)表面與標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基底例如組織培養(yǎng)處理的基底相比，能夠促進(jìn)處于未分化狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)元干細(xì)胞更有效的粘附與擴(kuò)展。在一些具體實(shí)施方案中，從所述限定的細(xì)胞培養(yǎng)表面上繁殖hES細(xì)胞、人骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和hES細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式中，所述限定的細(xì)胞培養(yǎng)表面無(wú)異物。

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)表面。優(yōu)選的，該細(xì)胞培養(yǎng)表面限定在培養(yǎng)皿上。細(xì)胞培養(yǎng)表面可以限定在細(xì)胞培養(yǎng)容器或其他結(jié)構(gòu)中的介質(zhì)上。細(xì)胞培養(yǎng)表面的材料可以包括塑料(例如：聚苯乙烯，丙烯腈丁二烯苯乙烯，和聚碳酸脂)；玻璃；微孔過(guò)濾器(例如，纖維素，尼龍，玻璃纖維，聚酯，和聚碳酸酯)；在批量或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)或者基因工程中作為生物反應(yīng)器的材料(例如：生物反應(yīng)器)，其中包括中空纖維管或微載體珠；聚四氟乙烯陶瓷和相關(guān)聚合材料。任何以上所列舉的材料以及其他材料都適用于本發(fā)明。用于所述細(xì)胞培養(yǎng)表面的材料可能選自于：纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、尼龍、玻璃、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，聚甲基戊烷，聚丙烯，聚乙烯及其組合。這些材料均為多孔的或非多孔的。

為了說(shuō)明本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)或培養(yǎng)容器都應(yīng)納入本文參考?？梢岳斫猓景l(fā)明可以應(yīng)用于各種細(xì)胞培養(yǎng)表面，包括但不限于存在于細(xì)胞培養(yǎng)容器中的介質(zhì)上限定的表面，如微珠，微孔過(guò)濾器或其他過(guò)濾或者結(jié)合介質(zhì)。優(yōu)選的，所述細(xì)胞培養(yǎng)表面是由聚苯乙烯形成的。

可以預(yù)計(jì)任何用于粘附培養(yǎng)的培養(yǎng)容器都可以使用。本發(fā)明預(yù)計(jì)的優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)容器配置包括多孔培養(yǎng)板(例如：6孔、12孔和24孔培養(yǎng)板)，培養(yǎng)皿(例如：有蓋培養(yǎng)皿)，實(shí)驗(yàn)試管，培養(yǎng)瓶，滾瓶，試管或搖瓶，或其他類似物。

所述細(xì)胞培養(yǎng)表面涂覆有等離子聚合薄膜。等離子體聚合物來(lái)源是一種或多種單體?？衫玫木酆蠁误w包括：不飽和有機(jī)化合物，如烯胺、鹵化烯烴、烯羧酸和羧酸酯、烯腈化合物、氧合的烯烴和烯碳?xì)浠衔铩Ｄ承┚唧w實(shí)施方式中，烯烴可包括乙烯基和烯丙基形式。在另一些具體實(shí)施方式中，可以使用環(huán)化合物，如環(huán)己烷，環(huán)戊烷和環(huán)丙烷。

本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，各種等離子聚合技術(shù)可以用于將一種或多種單體置于細(xì)胞培養(yǎng)表面上。優(yōu)選的，是在表面上放置帶正電荷的聚合膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，等離子聚合表面也可能帶負(fù)電荷，這取決于被使用的蛋白質(zhì)。胺優(yōu)選地用作聚合物的單體來(lái)源。在一些具體實(shí)施方式中，采用等離子體源來(lái)制做等離子體聚合單體以產(chǎn)生氣體放電，從而提供能量以啟動(dòng)氣態(tài)單體的聚合反應(yīng)，并能夠在培養(yǎng)容器表面上沉積形成聚合物薄膜?？梢岳铆h(huán)狀化合物，其可通過(guò)輝光放電的方法包含氣體等離子體。這些環(huán)狀化合物的衍生物，例如1,2-二胺環(huán)己烷，也在氣體等離子體中通常是可聚合的。

特別優(yōu)選的是，等離子可聚合單體包含：羥基，胺或羧酸基團(tuán)。該聚合物膜可從由丙烯酸、甲基丙烯酸，醋酸和乙烯基乙酸的含羧酸的單體的組得到，所述單體包括但不限于含有可聚合羧酸的乙烯基單體。通常的胺單體包括：多達(dá)20個(gè)碳原子(一般大多是2至8個(gè)碳)的完全飽和和不飽和胺化合物。烯鍵式不飽和化合物(尤其是伯，仲或叔胺)包括烯丙胺，而飽和單體，包括：甲胺，丙胺，庚胺和二氨基丙烷。這些中，通過(guò)使用烯丙基胺和二胺可得到特別有利的結(jié)果。

也可使用可聚合單體的混合物。另外，可聚合單體可與其他一般本身不視為可聚合的氣體混合，例如：氬氣、氮?dú)夂蜌錃狻?/p>

本發(fā)明中一個(gè)方面，聚合物包括胺共聚物(聚合兩種或兩種以上的單體)。該共聚物是由有機(jī)胺與飽和(烷烴)或不飽和(烯烴，二烯或炔烴)碳?xì)浠衔镞M(jìn)行等離子聚合形成的。該碳?xì)浠衔锟啥嘀?0個(gè)碳(但更普遍的是4至8個(gè)碳)。烷烴的例子是丁烷、戊烷和己烷。烯烴的例子是丁烯和戊烯。二烯的例子是1-7辛二烯。共同單體也可包括芳香烴，如苯乙烯。

等離子體聚合可以以任何胺：碳?xì)浠衔锉壤膬煞N組分的共聚物聚合進(jìn)行。共等離子體聚合優(yōu)選的胺：碳?xì)浠衔锏谋壤缦逓?00(胺):0(碳?xì)浠衔?至20(胺):80(碳?xì)浠衔?，以及這之間的任何比例。

其上具有等離子聚合薄膜涂層的細(xì)胞培養(yǎng)表面，涂覆組合物固定在具有涂覆組合物的涂覆有薄膜的表面上。該涂覆組合物包括一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和水性溶劑。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞外基質(zhì)”是本領(lǐng)域公知的。它的組分包括一種或多種以下蛋白：纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、生腱蛋白、巢蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、彈性蛋白、明膠、膠原蛋白、肌原纖蛋白、分區(qū)蛋白、錨定蛋白、軟骨粘連蛋白、鏈接蛋白、骨唾液蛋白、骨鈣蛋白、骨橋蛋白、epinectin、透明質(zhì)粘連蛋白、粗纖維調(diào)節(jié)素、表皮整連配體蛋白和韁蛋白。其他胞外基質(zhì)蛋白在Kleinman et al.,J.Biometer.Sci.Polymer Edn.,5:1-11,(1993)中描述，將其并入本文作為參考。此處術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞外基質(zhì)”還包括目前未知的但在未來(lái)可能被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)，因?yàn)樗鳛榧?xì)胞外基質(zhì)的特征容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

在一些方面，在涂覆組合物中總蛋白的濃度可能是約1ng/mL至約1mg/mL。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在涂覆組合物中總蛋白的濃度約為1μg/mL至約300μg/mL。在更優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，在涂覆組合物中總蛋白的濃度約為5μg/mL至約200μg/mL。

用于涂層的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白可能是自然來(lái)源的和從人類或動(dòng)物組織中純化的。備選地，ECM蛋白在性質(zhì)上也可能是基因工程的重組蛋白或人工合成的蛋白。ECM蛋白可能是整個(gè)蛋白質(zhì)或是肽段形式。在涂層中使用的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白涂層的例子包括：層粘連蛋白、I型膠原、Ⅳ型膠原、纖連蛋白和玻連蛋白。

在一些具體實(shí)施方案中，涂覆組合物無(wú)異物，因?yàn)榈鞍拙鶠槿嗽吹?。這是特定的研究應(yīng)用可能需要的。

在一些具體實(shí)施方案中，涂覆組合物包括纖連蛋白或重組纖連蛋白的合成產(chǎn)生的肽片段。

在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，涂覆組合物包含的混合物至少包括纖維連接蛋白和玻連蛋白。

在其他一些具體實(shí)施方案中，涂覆組合物優(yōu)選包括層粘連蛋白。

用于制備涂覆組合物的水性溶劑可以是水或緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，特別是杜爾貝科磷酸鹽緩沖液(DPBS)，或例如細(xì)胞介質(zhì)。在一些具體實(shí)施方案中，DMEM，KO/DMEM,DMEM/F12,RPMI，或本領(lǐng)域中已知的其他細(xì)胞介質(zhì)，適合用作水性溶劑用于制備涂層。合適的水性溶劑稀釋劑可以包含任何細(xì)胞培養(yǎng)基，其提供了符合胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的條件，并且優(yōu)選地將細(xì)胞保持在自我更新和未分化的狀態(tài)，直到其在體外定向到特定的細(xì)胞類型的作用。這些介質(zhì)可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買，例如，來(lái)自StemCell Technologies,Inc.(Vancouver,BC,Canada),Invitrogen Corporation(Carlsbad,CA)或Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。

涂覆組合物優(yōu)選包括單一類型的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在一些優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，涂覆組合物包括纖連蛋白，特別適用于培養(yǎng)干細(xì)胞。例如，合適的涂覆組合物可通過(guò)稀釋人纖連蛋白制備，例如由Becton,Dickinson &Co.of Franklin Lakes,NJ(BD)(Cat#354008)出售的人類纖連蛋白，溶于杜爾貝科磷酸鹽緩沖液(DPBS)，使得蛋白濃度為5μg/mL至約200μg/mL。

在其他一些具體實(shí)施方案中，涂覆組合物優(yōu)選包括層粘連蛋白。例如，合適的涂覆組合物可由用杜爾貝科磷酸鹽緩沖液(DPBS)稀釋的層粘連蛋白(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)；cat#L6274和L2020)制備，其中蛋白濃度為5μg/ml至約200μg/ml。

在一些具體實(shí)施方案中，涂覆組合物的pH值為約7.0至約8.5。可以使用任何能維持該組合物的pH在約7.0至8.5范圍內(nèi)的緩沖組分來(lái)維持該pH。在這個(gè)范圍內(nèi)的有效緩沖系統(tǒng)包括，但不僅限于：二乙醇胺，三乙醇胺，(1,3-二(三[羥甲基]甲氨基)丙烷)；3-[N,N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸：DIPSO；(N-[2-羥乙基]哌嗪-N’-[4-丁烷磺酸]HEPBS)；(N-(4-(2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸：HEPES)；3-(N-嗎啉基)丁烷磺酸：MOBS)；(哌嗪-N,N’-二[2-羥基丙磺酸：POPSO)；(N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸:TAPS；3-(N-三[羥甲基]甲氨基)-2-羥基丙磺酸:TAPSO)；(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸:TES；(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸:甘氨酸；N-乙基嗎啉,二甲基亮氨酰甘氨酸鈉5:5-二乙基巴比妥和2氨基,2甲基-1:3丙二醇。

用于制備本發(fā)明中的培養(yǎng)系統(tǒng)的涂覆組合物包括多種組分，這些組分可以影響涂層中的生長(zhǎng)因子到達(dá)細(xì)胞的通暢性，和/或協(xié)助細(xì)胞粘附，和/或影響涂層中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。這些組分可以包括，但不僅限于：鹽、稀釋劑、硫酸乙酰肝素蛋白多糖。

在基底上的涂層中還包括其他各種材料。這些材料包括，但不僅限于，細(xì)胞、抗體、酶、受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)的其它成分、細(xì)胞因子、激素和藥物。在一些具體實(shí)施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可以結(jié)合到這些材料上。這些生物活性材料，如果存在，可以很容易地提供給培養(yǎng)的細(xì)胞，以調(diào)控或調(diào)節(jié)它們的性質(zhì)或行為。

本發(fā)明提供了制備穩(wěn)定的、即用型的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的方法。這種方法包括將細(xì)胞外基質(zhì)涂覆組合物應(yīng)用到被等離子聚合膜涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)表面，其中涂覆組合物中總蛋白濃度為約1ng/mL至約1mg/mL。這種方法也包括將涂覆組合物中的蛋白固定在這類薄膜涂覆的容器上一段時(shí)間；以及從薄膜涂覆的平板上移除過(guò)量的涂覆組合物。

涂覆組合物一般以以下用量應(yīng)用：

大約0.5到2.0mL的涂覆組合物能夠應(yīng)用到6孔的多孔板的一個(gè)孔；大約0.25到1.0mL能夠應(yīng)用到12孔板或24孔的多孔的一個(gè)孔；大約50μL到100μL能夠應(yīng)用到96孔的多孔板的一個(gè)孔；大約0.5到2.0mL能夠應(yīng)用到一個(gè)35mm的平皿；大約0.5到4.0mL能夠應(yīng)用到一個(gè)60mm的平皿；大約2.0到12.0mL能夠應(yīng)用到直徑100mm的平皿；大約0.5mL到4.0mL能夠加入到一個(gè)T25的培養(yǎng)瓶(有25cm²細(xì)胞粘附表面積)；大約2.0mL到12.0mL能夠加入到一個(gè)T75的培養(yǎng)瓶(有75cm²細(xì)胞粘附表面積)；大約5.0mL到25.0mL能夠加入到一個(gè)T175的培養(yǎng)瓶(有175cm²細(xì)胞粘附面積)。

應(yīng)用之后，將涂覆組合物保持在涂覆有薄膜的表面上，以使組合物中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白粘附到等離子聚合板上。該涂覆組合物可以被維持在一個(gè)非可控環(huán)境(例如：室溫)或者一個(gè)可控環(huán)境(例如：加熱或制冷條件下)。特別地，涂覆的等離子聚合板有利地在溫度為約22℃到大約37℃之間孵育大約30分鐘到約4小時(shí)，使蛋白能夠粘附到基底表面。備選地，涂覆的等離子聚合培養(yǎng)板在使用前在4℃孵育過(guò)夜至2周。用于細(xì)胞培養(yǎng)之前，立即將過(guò)量的涂層組分要從涂覆的基底移除，以清除未粘附的蛋白和剩余溶液。

本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)適用于多種應(yīng)用，包括培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES)、間充質(zhì)和神經(jīng)元干細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，無(wú)異物的、限定的細(xì)胞培養(yǎng)基底能夠在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，有效地維持未分化的ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞的自我更新和多能性的特點(diǎn)。

在一些具體實(shí)施方案中，ES細(xì)胞，特別是人胚胎干細(xì)胞(hES)，可用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器培養(yǎng)。例如，人胚胎干細(xì)胞包括，但不限于，以下細(xì)胞系：例如H1、H9以及H14。這些細(xì)胞系例如，可以從WiCell研究中心，Madison，WI得到。

本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)表面可能用于培養(yǎng)干細(xì)胞。該方法包括培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞和提供一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一種具有等離子聚合表面的培養(yǎng)容器；和在其之上的涂覆組合物形成的涂層。該涂覆組合物包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和水性溶劑的混合物，涂覆組合物中總蛋白濃度為約1ng/mL到約1mg/mL。該培養(yǎng)方法也包括加入胚胎干細(xì)胞的懸浮液到細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中；和在5％CO₂的濕潤(rùn)空氣以及37℃條件下孵育胚胎干細(xì)胞，以產(chǎn)生未分化的集落用于脂肪干細(xì)胞擴(kuò)展。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以包括基本介質(zhì)和添加物以輔助干細(xì)胞粘附到細(xì)胞培養(yǎng)基底。在一些具體實(shí)施方案中，包括培養(yǎng)基如mTeSR^TM1(StemCell Technologies Inc.)。但是，這里注明，培養(yǎng)方法不限于這種培養(yǎng)基。

在一些具體實(shí)施方案中，成體干細(xì)胞，可以是間充質(zhì)干細(xì)胞，可以用本發(fā)明的方法培養(yǎng)。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞可以包括，但不限于，骨髓來(lái)源的細(xì)胞，例如人間充質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞如從Lonza(Wakersville,MD)獲得。

在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基是不含血清的介質(zhì)，例如MSC SFM(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。但是，這里注明，培養(yǎng)方法不限于該培養(yǎng)基。

在其他的具體實(shí)施方案中，來(lái)源于hES細(xì)胞的神經(jīng)元干細(xì)胞，可以使用本發(fā)明的方法培養(yǎng)。

在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)hES細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞的培養(yǎng)基是不含血清的介質(zhì)，DMEM/F12+Glutamax,N2,B27,bFGF和青/鏈霉素。

本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)能夠被用于檢測(cè)各種抑制因子或刺激因子，以確定它們?cè)诩?xì)胞研究中的效力。刺激因子可以包括本領(lǐng)域公知的生長(zhǎng)因子。例如，可以包括一種或多種血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，例如PDGF AA、PDGF BB；胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)，例如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，例如，酸性FGF、堿性FGF、β-內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-P1、TGFβ1.2、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，例如BMP 1、BMP 2、BMP 3、BMP 4；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)，例如，VEGF、胎盤生長(zhǎng)因子；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，例如，EGF、雙調(diào)蛋白、β細(xì)胞素，肝素結(jié)合EGF；白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14；集落刺激因子(CSF)，例如CSF-G、CSF-GM、CSF-M；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)；干細(xì)胞因子；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。其他生長(zhǎng)因子在Sporn和Roberts，Peptide Growth Factors and Their Receptors I,Springer-Verlag,New York(1990)中進(jìn)行了描述，將其全部并入本文作為參考。術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)因子”旨在包括現(xiàn)在未知的但是在將來(lái)可能發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子，因?yàn)樗鼈冏鳛樯L(zhǎng)因子的特性本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易能夠鑒定。

本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以添加血清，但優(yōu)選是不含血清的。該培養(yǎng)基可能是之前通過(guò)暴露于成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞而適應(yīng)的培養(yǎng)基(例如飼養(yǎng)條件培養(yǎng)基)。用于培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的合適的、確定不含血清的培養(yǎng)基，mTeSR^TM1，能夠從StemCell Technologies,Inc.購(gòu)得。用于培養(yǎng)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的合適的、不含血清的培養(yǎng)基，MSC SFM，能夠從Invitrogen公司(Carlsbad,CA)得到。

制備方法

本發(fā)明提供了一種制備穩(wěn)定的、即用型的細(xì)胞培養(yǎng)基底的方法。該方法包括將細(xì)胞外基質(zhì)涂覆溶液應(yīng)用到細(xì)胞培養(yǎng)容器的等離子聚合的涂覆有薄膜的表面，其中涂覆溶液中總蛋白濃度是約1ng/ml至約1mg/ml。該方法還包括保持涂覆溶液位于涂覆有薄膜的表面上，以使得涂覆溶液中的蛋白固定在基底表面上；以及從基底移除過(guò)量涂覆溶液。本發(fā)明的某些方面，一種或多種涂覆溶液可以至添加至等離子聚合涂覆有薄膜的表面。

在一些具體實(shí)施方案中，含有相同或不同ECM蛋白的涂覆溶液可以依次應(yīng)用。在涂覆應(yīng)用之間，可以使用可選的洗滌步驟。在一些具體實(shí)施方案中，該洗滌步驟可以包括用雙蒸水、緩沖液(例如，PBS)或者培養(yǎng)基洗滌基底。在另一些具體實(shí)施方案中，該洗滌步驟可以包括用封閉液洗滌基底。

涂覆溶液，包括細(xì)胞外基質(zhì)組分，能夠保持在至少薄膜涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)表面的一個(gè)表面上，例如細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如，燒瓶或者細(xì)胞培養(yǎng)板)，在使得細(xì)胞外基質(zhì)蛋白充分粘附到涂覆的表面的一定溫度和/或一定時(shí)間下。例如，薄膜涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)容器可以保持在室溫放置約1到約4個(gè)小時(shí)，以進(jìn)行粘附。或者，該容器在4℃孵育一段時(shí)間(例如，4小時(shí)到2周)。涂覆的基底也可以在溫度約為22℃至約37℃條件下孵育約30分鐘到約4小時(shí)，以使蛋白粘附到基底表面。移除(例如，吸干)任何過(guò)量的涂覆溶液之后，并用水性溶劑(例如，水、緩沖溶液、ddH₂O、培養(yǎng)介質(zhì))洗滌涂覆的基底，以清除未結(jié)合的蛋白。使用以上提到的封閉液，提高涂覆基底的穩(wěn)定性。

涂覆之后，可選進(jìn)行無(wú)菌處理。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該裝置用紫外(UV)燈進(jìn)行無(wú)菌處理。

一些方面，在將涂覆溶液應(yīng)用到涂覆有薄膜的表面之后，立即冷凍細(xì)胞培養(yǎng)基底。冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)基底可以在-20℃儲(chǔ)存多至3個(gè)月，使用前解凍。例如，作為ECM蛋白的層粘連蛋白可以作為一種涂覆溶液應(yīng)用，就像上面提到的，能夠同所得細(xì)胞培養(yǎng)表面一起冷凍和儲(chǔ)存。

以下的例子僅為說(shuō)明目的，并非特意以任何方式對(duì)本發(fā)明的使用和具體實(shí)施方案進(jìn)行限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1在化學(xué)法限定的等離子聚合表面的ECM涂層

化學(xué)法限定的等離子聚合的培養(yǎng)容器(12或6多孔培養(yǎng)板形式)被各種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白涂覆。單一或組合的ECM蛋白，用杜爾貝科磷酸緩沖溶液(DPBS)或者DMEM/F12介質(zhì)稀釋后，加入(6孔培養(yǎng)板：1mL/孔以及12或24孔培養(yǎng)板：0.5mL/孔)，然后將培養(yǎng)板在37℃或室溫涂覆2小時(shí)。在用于hES細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，立即移除涂覆溶液。實(shí)驗(yàn)中用到以下ECM：ECM包括但不僅限于人纖連蛋白、人層粘連蛋白、人玻連蛋白、人膠原IV、BD Matrigel^TMhESC-qualified Matrix，F(xiàn) Plus；Sigma公司的一種纖連蛋白樣工程蛋白聚合體；Takara Bio USA公司的另外一種重組人纖連蛋白片段Retronectin。

化學(xué)法限定的等離子聚合6孔培養(yǎng)板(BD Primex 1(包括胺和正電荷表面，Cat#359296))和BD Primex 2(包括羧基和負(fù)電荷表面，Cat#359297))由各種無(wú)動(dòng)物成分ECM涂覆?；瘜W(xué)法限定的等離子聚合24孔培養(yǎng)板(BD PureCoat amine，正電荷等離子聚合表面，Cat#354723或者356723)由各種人和動(dòng)物來(lái)源的ECM涂覆。

涂覆溶液通過(guò)用杜爾貝科磷酸緩沖溶液稀釋單一或混合的ECM蛋白獲得，蛋白質(zhì)終濃度為5μg/mL至50μg/mL

將涂覆溶液以1mL/孔的體積加入6孔培養(yǎng)板，或以0.5mL/孔的體積加入12孔培養(yǎng)板。

涂覆溶液在等離子聚合培養(yǎng)板上進(jìn)行孵育，至少室溫2小時(shí)或者4℃過(guò)夜。

在培養(yǎng)板用于培養(yǎng)hES細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，立即移除涂覆溶液。

實(shí)施例2在ECM涂覆的等離子聚合表面上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞

hES細(xì)胞在ECM涂覆的等離子聚合表面上培養(yǎng)

hES干細(xì)胞(H1、H9或H14細(xì)胞系，來(lái)自WiCell研究所)最初從陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)板上(hES細(xì)胞生長(zhǎng)在涂覆BD Matrigel^TM hESC-qualified Matrix的6孔TC培養(yǎng)板上，生長(zhǎng)在mTeSR^TM1培養(yǎng)基上)鋪至等離子聚合培養(yǎng)板上(有或無(wú)ECM涂覆)。

在37℃，用分散酶(2mg/mL)處理陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)板上細(xì)胞5分鐘，隨后用DMEM/F12培養(yǎng)基迅速洗滌4次，然后用塑料吸管或吸頭在少量體積的mTeSR^TM1培養(yǎng)基中機(jī)械切割至小塊。mTeSR^TM1培養(yǎng)基中重懸的hES細(xì)胞團(tuán)以1:3至1:6的分流比接種在檢測(cè)表面上，在含5％CO₂的濕潤(rùn)空氣，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換一次培養(yǎng)基，初始鋪板后一般每4至6天解離一次。

在等離子聚合BD Primex 1板上hESC的解離

培養(yǎng)在涂覆有BD人纖連蛋白的BD Primex 1培養(yǎng)板上的hES細(xì)胞慣常用TryPLE select(Invitrogen,用DMEM/F12以1:2(v:v)稀釋)進(jìn)行解離以傳代培養(yǎng)和長(zhǎng)期維持。簡(jiǎn)言之，移除用盡的培養(yǎng)基，細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌一次，然后用稀釋的TryPLE select(1mL/孔)室溫處理2分鐘。然后迅速移除解離試劑，并用DMEM/F12培養(yǎng)基迅速洗滌細(xì)胞3次。隨后將mTeSR^TM1培養(yǎng)基(StemCell Technologies，Inc.)加入到處理過(guò)的細(xì)胞中，用5mL塑料吸管或者吸頭將集落機(jī)械切割至小塊。細(xì)胞的分散和鋪板按照上面部分描述的進(jìn)行。

hES細(xì)胞集落的粘附情況測(cè)定

比較在用不同ECM蛋白涂覆的等離子聚合表面上的hES細(xì)胞的粘附情況。

在室溫下，用4％的多聚甲醛固定hES細(xì)胞20分鐘，然后用杜爾貝科磷酸緩沖溶液(DBPS)洗滌兩次，每次5分鐘。隨后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色(以1:10用DPBS稀釋)5分鐘，接著用DPBS洗滌一次。將含有固定和用結(jié)晶紫染色的細(xì)胞的培養(yǎng)板用激光掃描儀掃描，并且顯示每孔的粘附集落(圖1)。圖1A是(TC)-處理的聚苯乙烯培養(yǎng)板，其用BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆，圖1B是TC培養(yǎng)板，其用BD人纖連蛋白涂覆；以及圖1C是BD Primex 1培養(yǎng)板，其用BD人纖連蛋白涂覆(Cat#359296)，并且用mTeSR^TM1培養(yǎng)基培養(yǎng)(StemCell Technologies,Inc.)。

通常使用相差顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞集落的粘附和形態(tài)學(xué)。如圖2A和圖2B顯示，hES細(xì)胞(H9系)在用BD人纖連蛋白涂覆的等離子聚合BD Primex 1培養(yǎng)板(Cat#359296)上培養(yǎng)18代(圖2B)。在用纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上的細(xì)胞形態(tài)非常類似于培養(yǎng)在陽(yáng)性對(duì)照基底，即用BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆的TC培養(yǎng)板上的hES細(xì)胞集落(圖2A)。當(dāng)在這些培養(yǎng)基底上培養(yǎng)時(shí)，hES細(xì)胞都主要維持在未分化狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將人胚胎干細(xì)胞(hES)(H9系)接種于用BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix或人纖連蛋白涂覆的組織培養(yǎng)(TC)-處理的聚苯乙烯培養(yǎng)板上；并且接種在用人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1上。細(xì)胞用mTeSR^TM1培養(yǎng)基(StemCell Technologies,Inc)培養(yǎng)4天，固定并用結(jié)晶紫染色。圖1顯示的是每個(gè)表面的相對(duì)細(xì)胞粘附情況。能夠看出，在用人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1上的集落粘附情況(圖1C)與陽(yáng)性對(duì)照基底(用BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆的TC培養(yǎng)板，圖1A)相當(dāng)。但是，用人纖連蛋白涂覆的TC表面不支持可見的hES細(xì)胞集落粘附或在mTeSR^TM1培養(yǎng)基生長(zhǎng)(圖1B)。

在用或不用各種類型的人纖連蛋白涂層的BD Primex 1和TC培養(yǎng)板上的hES細(xì)胞集落粘附情況的結(jié)果如下所示：

表1

基于集落粘附的大致的數(shù)目、集落中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)(例如：緊湊對(duì)單個(gè)細(xì)胞)、增殖率和自發(fā)分化程度，認(rèn)為表面與上陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)。

在用或不用各種ECM蛋白涂層的等離子聚合的BD Primex 1和Primex 2培養(yǎng)板上的hES細(xì)胞集落粘附的結(jié)果如下所示：

表2

基于集落粘附的大致的數(shù)目、集落中的細(xì)胞形態(tài)學(xué)(例如：緊湊對(duì)單個(gè)細(xì)胞)、增殖率和自發(fā)分化程度，認(rèn)為表面與陽(yáng)性對(duì)照相等。

實(shí)施例3-未分化的hESC的鑒定

形態(tài)學(xué)分析(圖2)顯示：當(dāng)用mTeSR^TM1在用BD人纖連蛋白(圖2B)涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板(Cat#359296)上培養(yǎng)時(shí)，hES細(xì)胞主要維持在未分化時(shí)期,并且與培養(yǎng)在陽(yáng)性對(duì)照基底(用BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆的TC培養(yǎng)板，圖2A)上的細(xì)胞相當(dāng)。

用mTeSR^TM1在BD人纖連蛋白(圖3B)涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞和在陽(yáng)性對(duì)照基底(BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆的TC培養(yǎng)板，圖3A)上培養(yǎng)的細(xì)胞中未分化標(biāo)志物OCT-3/4的表達(dá)是相當(dāng)?shù)摹?/p>

定量FACS分析(操作規(guī)程在下文實(shí)施例5中)顯示：在BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1上的培養(yǎng)16代的hES細(xì)胞(H9系)的未分化hES細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)(OCT－3/4和SSEA－4)與陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞(培養(yǎng)在BD Matrigel^TM hESC-qualified matrix涂覆的TC上)相當(dāng)。表達(dá)未分化標(biāo)志物的細(xì)胞的相對(duì)百分比匯總在下表3中：

表3

實(shí)施例4-通過(guò)胚狀體形成誘導(dǎo)的自發(fā)分化

使用在上文實(shí)施例2中描述的相同的方法，對(duì)hESC集落用任一TryPLE select(Invitrogen)進(jìn)行解離。

將解離的細(xì)胞團(tuán)鋪板在加有分化培養(yǎng)基(補(bǔ)充20％胎牛血清(FBS)、10mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酸、0.1mM beta-巰基乙醇的DMEM/F12培養(yǎng)基)的皮化培養(yǎng)皿(未經(jīng)組織培養(yǎng)處理)或者低粘附的6孔培養(yǎng)板中。

培養(yǎng)在分化培養(yǎng)基中的細(xì)胞團(tuán)在懸浮液中形成胚狀體(EB)，并培養(yǎng)4-15天。隨后，采用QRT-PCR(本領(lǐng)域所公知的操作規(guī)程)分析EB中胚層標(biāo)志物基因的表達(dá)；也可以將EB重新鋪板至明膠涂覆的TC培養(yǎng)板上，在補(bǔ)充20％FBS的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)一步分化一段時(shí)間，并用免疫組化分析胚層特異性蛋白表達(dá)的出現(xiàn)。

實(shí)施例5-hESC多能性的鑒定

H9hES細(xì)胞(在BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上培養(yǎng)13代后)分化成胚狀體(EB)。用QRT-PCR檢測(cè)EB中3個(gè)胚層標(biāo)志物的表達(dá)情況(圖5)。檢測(cè)所有3個(gè)胚層的標(biāo)志物FoxA2(內(nèi)胚層表達(dá)的叉頭盒A2)、HAND1(中胚層表達(dá)的心和神經(jīng)嵴衍生物1)和微管蛋白TUBB3(外胚層中的微管蛋白beta3)。培養(yǎng)在BD Matrigel^TM hESC-qualified Matrix涂覆的TC培養(yǎng)板上的細(xì)胞代表陽(yáng)性對(duì)照。相對(duì)于培養(yǎng)在BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上的未分化細(xì)胞(對(duì)照)的胚層標(biāo)志物表達(dá)情況也被顯示?？梢钥闯?，BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的EB中，所有3個(gè)胚層標(biāo)志物的表達(dá)都有明顯的提高，并且表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)。以上的數(shù)據(jù)說(shuō)明：培養(yǎng)在具有纖連蛋白涂層的Primex 1上的細(xì)胞保持了它們的多能性。

圖6顯示的是在隨著EB形成，自發(fā)分化后的胚層標(biāo)志蛋白表達(dá)情況。將hES細(xì)胞(H9系)在BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上培養(yǎng)3代。使細(xì)胞分化成EB10天并轉(zhuǎn)移到明膠涂覆的TC培養(yǎng)板上，在補(bǔ)充了20％FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10天。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。

實(shí)施例6－免疫組織化學(xué)操作規(guī)程

本實(shí)施例涉及檢測(cè)未分化hES細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)的免疫組織化學(xué)操作規(guī)程(數(shù)據(jù)在實(shí)施例3中概述，并在圖3中顯示)。操作規(guī)程用于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞。同樣的操作規(guī)程也可用于檢測(cè)分化的hES細(xì)胞中胚層特異性蛋白的表達(dá)情況(數(shù)據(jù)在實(shí)施例4中概述，并在圖6中顯示)。為了后續(xù)的研究，在12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，并且每孔中使用隨后操作規(guī)程中標(biāo)明的一半的體積。

用2mL的杜爾貝科磷酸緩沖液(DPBS)洗滌培養(yǎng)的hES細(xì)胞。隨后，用1mL的4％的多聚甲醛在室溫固定細(xì)胞20分鐘。固定的細(xì)胞用2mL的DPBS洗滌兩次，每次5分鐘。隨后，用1mL含0.1％牛血清蛋白(BSA)和10％正常山羊血清的DPBS封閉細(xì)胞。在封閉步驟中，用含1％BSA和10％正常山羊血清的DPBS制備一抗工作液，來(lái)獲得理想的抗體濃度。需要注意的是，在封閉液和一抗溶液中，正常血清可以替換成來(lái)源于其他物種的血清，這取決于二抗的宿主物種來(lái)源。

封閉之后，將細(xì)胞與1mL/孔的稀釋的抗體工作液在室溫孵育2小時(shí)或者在2-8℃孵育過(guò)夜。隨后，用2mL含1％BSA的DPBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。

二抗用含1％BSA的DPBS按照1:2000稀釋?？捎玫臒晒舛拱ǎ篈lex 488或594綴合的適當(dāng)?shù)亩?Invitrogen-Molecular Probes)。將細(xì)胞與1mL/孔的稀釋的二抗室溫避光孵育60分鐘。隨后，用2mL含1％BSA的DPBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。之后，用2mL的DPBS覆蓋細(xì)胞，觀測(cè)，并用熒光顯微鏡拍照。

實(shí)施例7－FACS分析操作規(guī)程

培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板中的人胚胎干細(xì)胞(hES)(H9系)的匯合培養(yǎng)物用杜爾貝科磷酸緩沖液(DPBS)短暫漂滌，并用1mL/孔的0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)在37℃處理2-3分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)表面解離。加入2mL/孔的含20％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基以滅活胰酶。然后用吸管上下吹吸輕柔地將細(xì)胞分散，1000rpm離心5分鐘使其沉淀。

對(duì)于細(xì)胞內(nèi)抗原(例如：OCT-3/4)，重懸細(xì)胞沉淀，并用1％多聚甲醛(1mL/管)在37℃固定10分鐘。將固定的細(xì)胞用3mL/孔的滲透/洗滌緩沖液(BD Pharmingen)簡(jiǎn)單洗滌一次。通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀；去上清，用3mL/孔的滲透/洗滌緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并在冰上孵育15分鐘，以滲透化細(xì)胞。滲透化之后，再離心一次使細(xì)胞沉淀，并重懸在100μl滲透/洗滌緩沖液中，用合適的一抗探測(cè)(～3×10⁵細(xì)胞同500ng的一抗孵育)。孵育1小時(shí)之后，用3mL的滲透/洗滌緩沖液洗滌，并重量在100μL同樣的緩沖液中。加入二抗，細(xì)胞在室溫避光孵育30分鐘。孵育之后，按照之前的方法洗滌細(xì)胞，并重懸在200μL含1μg/ml的碘化丙錠(Sigma)的滲透/洗滌緩沖液中，以鑒定活細(xì)胞。用FACS流式細(xì)胞儀(BD)進(jìn)行熒光激活的細(xì)胞分類器(FACS)分析。每個(gè)樣本總共分析30000個(gè)事件，并用CellQuest 3.0軟件(BD)分析數(shù)據(jù)。

對(duì)于表面抗原(例如：SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等)，進(jìn)行相似的操作規(guī)程，其中有一些例外。解離之后，將細(xì)胞垂懸在0.5mL含25％FBS的DPBS中。省略固定步驟以檢測(cè)表面抗原。所有的一抗孵育都在含25％FBS的DPBS中在冰上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)使用200ng抗體，而二抗孵育是在同樣的緩沖液中，在室溫避光進(jìn)行30分鐘。所有其他的步驟類似于上述的細(xì)胞內(nèi)抗原的操作規(guī)程。

實(shí)施例8－纖連蛋白的ELISA測(cè)定

通過(guò)人纖連蛋白的ELISA分析結(jié)果進(jìn)一步確定ECM涂覆的BD Primex培養(yǎng)板的性能。例如，纖連蛋白ELISA或者層粘連蛋白ELISA可以用于評(píng)價(jià)粘附在基底表面上的ECM蛋白的量。舉例來(lái)說(shuō)，一種用于評(píng)價(jià)涂覆的容器的性能的人纖連蛋白ELISA測(cè)定陳述如下。BD Primex 1培養(yǎng)板和涂覆了各種濃度的人纖連蛋白的TC培養(yǎng)板的纖連蛋白ELISA的數(shù)據(jù)圖如圖7所示。

為了制備ELISA一抗工作液，將0.5ml的1:100(v/v)的兔抗人纖連蛋白儲(chǔ)備液(Sigma；catalog no.F3648)加入到40ml含0.5％牛血清蛋白(BSA)的杜爾貝科磷酸緩沖液(DPBS)中。為了制備ELISA二抗工作液，將0.4ml的1:100(v/v)的羊抗兔IgG-HRP儲(chǔ)備液(BD Pharmingen；catalog no.554021)加入到40ml含0.5％BSA的DPBS中。執(zhí)行ELISA反應(yīng)使用：用根據(jù)本發(fā)明制備的ECM-涂覆的6孔BD Primex 1培養(yǎng)板(檢測(cè)培養(yǎng)板)，BD Matrigel^TMhESC-qualified Matrix涂覆的TC培養(yǎng)板(陽(yáng)性對(duì)照)或Falcon 6孔未涂覆培養(yǎng)板(catalog no.353046；陰性對(duì)照)。將這些培養(yǎng)板先用2mL/孔的洗滌緩沖液(含0.02％Tween-20的DPBS)洗滌3次。隨后，加入1mL作為封閉液的含0.5％BSA的DPBS，并且將培養(yǎng)板在室溫下孵育1小時(shí)。然后移除BSA溶液，用上述的洗滌緩沖液洗滌這些培養(yǎng)板。隨后，按1mL/孔加入一抗工作液，將培養(yǎng)板在室溫孵育2小時(shí)。在移出一抗溶液后，培養(yǎng)板再按照上述步驟再次洗滌。隨后，按1mL/孔加入二抗工作液，將培養(yǎng)板在室溫孵育1小時(shí)。在移除二抗溶液后，培養(yǎng)板按照上述步驟再次洗滌。然后，按1mL/孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)底物、TMB(KPL；catalog no.53-00-02)，使藍(lán)色顯色8分鐘后。隨后，加入1mL的終止液(KPL；catalog no.50-85-05)，使培養(yǎng)板輕柔地旋轉(zhuǎn)以促進(jìn)混合。然后，6孔培養(yǎng)板的每孔中取200μl一份轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板的孔中，并在室溫用分光光度計(jì)(Plus384,Molecular Devices)在450nm處檢測(cè)吸光度。在加入終止液后5分鐘內(nèi)進(jìn)行讀板。計(jì)算檢測(cè)培養(yǎng)板、陽(yáng)性對(duì)照TC培養(yǎng)板每孔的平均吸光度。

纖連蛋白ELISA測(cè)定的結(jié)果

等離子聚合BD Primex 1培養(yǎng)板與TC培養(yǎng)板相比，在纖連蛋白粘附的量上沒(méi)有明顯區(qū)別(圖7A)。但是，BD人纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板支持hES細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)(圖1C和7B)，而BD人纖連蛋白涂覆的TC表面卻不是最佳的(圖1B)。因此，通過(guò)ELISA數(shù)據(jù)檢測(cè)的纖連蛋白濃度與hES細(xì)胞在BD Primex1培養(yǎng)板上的粘附和生長(zhǎng)之間沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。

人纖連蛋白的濃度在5到50μg/mL之間能夠支持在Primex 1上的hES細(xì)胞很好地粘附和生長(zhǎng)(圖7B)。但是，集落形態(tài)學(xué)的嚴(yán)格檢查說(shuō)明10-50μg/mL對(duì)于這些細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)是最好的范圍。

這些數(shù)據(jù)共同說(shuō)明：不是結(jié)合的纖連蛋白的量而是該ECM蛋白的構(gòu)型提供給了等離子聚合BD Primex 1培養(yǎng)板利于hES細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)施例9－在ECM涂覆的等離子聚合表面上不含血清的介質(zhì)中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的粘附和生長(zhǎng)

解凍骨髓來(lái)源的MSC(Lonza)，并平鋪于加入含10％血清(MSCGM^TM，Lonza)的MSC完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。在第5代時(shí)，用0.5％胰蛋白酶EDTA解離細(xì)胞，并鋪板在加入含血清(Lonza)的MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基的未涂覆的組織培養(yǎng)板上(陽(yáng)性對(duì)照；圖9A)或加有不含血清的MSC培養(yǎng)基(Invitrogen)的纖連蛋白涂覆的BD primex 1培養(yǎng)板上(圖9B)。培養(yǎng)5天之后，用顯微鏡目測(cè)細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)。在不含血清培養(yǎng)基中，MSC的粘附和生長(zhǎng)一般較差。在此實(shí)施例中，證實(shí)了在纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板上的MSC的粘附情況陽(yáng)性對(duì)照條件(細(xì)胞在含血清的介質(zhì)中，在組織培養(yǎng)表面上培養(yǎng))相當(dāng)。

實(shí)施例10在ECM涂覆的等離子聚合表面上MSC分化成為脂肪細(xì)胞

脂肪生成培養(yǎng)操作規(guī)程

脂肪生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基和脂肪生成維持培養(yǎng)基從Lonza購(gòu)買，脂肪生成的操作規(guī)程如下所述。將每孔2mL培養(yǎng)基中的200,000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞鋪板至包含含血清的生長(zhǎng)介質(zhì)(MSCGM^TM,Lonza)的6孔組織培養(yǎng)板或包含不含血清的MSC介質(zhì)(MSC SFM；Invitrogen)的纖連蛋白涂覆的BD Primex 1培養(yǎng)板中。并在含5％ CO₂的潮濕空氣和37℃條件下，孵育細(xì)胞。每2到3天更換一次介質(zhì)，直到培養(yǎng)物達(dá)到匯合(在～7天)。達(dá)到100％匯合之后，進(jìn)行誘導(dǎo)/維持的3次循環(huán)，以刺激脂肪生成分化。每個(gè)循環(huán)由如下步驟構(gòu)成用脂肪生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基飼喂MSC并培養(yǎng)3天(37℃,5％CO₂)，隨后在脂肪生成維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～3天。在完成3個(gè)完整的誘導(dǎo)/維持循環(huán)之后，在脂肪生成維持培養(yǎng)基中再培養(yǎng)MSC 7天，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。用顯微鏡確定誘導(dǎo)的細(xì)胞中脂質(zhì)空泡的出現(xiàn)情況未目視觀察脂肪細(xì)胞分化程度。

MSC分化成脂肪細(xì)胞的結(jié)果

在纖連蛋白涂覆的BD primex 1培養(yǎng)板上的脂肪生成的程度(圖9B)同在陽(yáng)性對(duì)照組織培養(yǎng)板上觀測(cè)到的(圖9A)相類似。該實(shí)施例說(shuō)明：在纖連蛋白涂覆的BD primex 1培養(yǎng)板上用不含血清的介質(zhì)培養(yǎng)的MSC保留了它們分化成為脂肪細(xì)胞的能力，并且分化潛能與陽(yáng)性對(duì)照所觀測(cè)到的情況相當(dāng)。

實(shí)施例11NSC在ECM涂覆的等離子聚合表面上的生長(zhǎng)和粘附

人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元干細(xì)胞(hNSC)在補(bǔ)充了2.5mM L-谷胺酰胺、1％N2、2％B27、20ng/mL bFGF和1％青/鏈霉素的DMEM/F12介質(zhì)(1:1)中在多聚鳥氨酸和其合層粘連蛋白順序涂覆的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

為了涂覆T-75組織培養(yǎng)瓶，加入5mL溶于蒸餾水中的多聚鳥氨酸(20μg/mL)，將培養(yǎng)瓶平置以保證涂覆溶液完全覆蓋了底部表面。將培養(yǎng)瓶室溫下孵育過(guò)夜。24小時(shí)后，移去多聚鳥氨酸溶液，用蒸餾水漂洗培養(yǎng)瓶一次，然后加入5mL溶于杜爾貝科磷酸緩沖鹽溶液的層粘連蛋白(5μg/mL)。將培養(yǎng)瓶底部表面用層粘連蛋白涂覆，37℃孵育2小時(shí)。在用于鋪板hNSC之前立即移去涂覆溶液。

在本實(shí)施例中，檢測(cè)了在ECM涂覆的等離子體表面上hNSC的粘附和生長(zhǎng)狀況。6孔組織培養(yǎng)板和BD Primex 1培養(yǎng)板用BD人纖連蛋白(25μg/mL)室溫下涂覆2小時(shí)，或者使用多聚鳥氨酸(20μg/mL)和層粘連蛋白(5μg/mL)的組合如上文描述的方法進(jìn)行涂覆。組織培養(yǎng)板和BD PureCoat Amine培養(yǎng)板(24孔)用多聚鳥氨酸(20μg/mL)、層粘連蛋白(5μg/mL)或者多聚鳥氨酸(20μg/mL)及層粘連蛋白(5μg/mL)的組合按照上文描述的方法涂覆。

圖10說(shuō)明了hNSC在纖連蛋白涂覆的BD primex 1上的粘附和生長(zhǎng)(圖10d)與多聚鳥氨酸和層粘連蛋白的組合涂覆的組織培養(yǎng)表面(陽(yáng)性對(duì)照，圖10b)相等。然而，hNSC在未涂覆的組織培養(yǎng)表面或BD Primex 1上的生長(zhǎng)和粘附非常低(圖10a和10c分別顯示)。

圖11說(shuō)明hNSC在層粘連蛋白(5μg/mL)涂覆或多聚鳥氨酸和層粘連蛋白的組合涂覆的BD PureCoat Amine上的粘附和生長(zhǎng)好于相同的ECM涂覆的組織培養(yǎng)表面。

實(shí)施例12用MTS測(cè)定法確定NSC的生存能力

一種基于四唑的測(cè)定法用于定量分析細(xì)胞的生存能力。簡(jiǎn)言之，移除介質(zhì)廢液之后，用含MTS試劑(Promega)的介質(zhì)代替，在37℃孵育2小時(shí)。MTS是一種四唑化合物，其能夠被代謝活躍的活細(xì)胞還原成為一種可溶解產(chǎn)物，甲臜，顯紫色。然后，用Safire2^TM微板讀取儀在490nm處漂取甲臜的吸光度。

將hNSC以20,000細(xì)胞/孔的密度接種在孔未被或被多聚鳥氨酸、層粘連蛋白或多聚鳥氨酸、層粘連蛋白的組合涂覆的24孔BD PureCoatAmine培養(yǎng)板中。3天后，輕柔地吸出用盡的培養(yǎng)基，替換為不含bFGF的400μL新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每孔中，加入80μL的MTS試劑，細(xì)胞在37℃孵育1.5小時(shí)。在490nm處讀取吸光度。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持在實(shí)施例8中描述的目測(cè)結(jié)果(圖12)。當(dāng)用單獨(dú)層粘連蛋白涂覆或者多聚鳥氨酸和層粘連蛋白的組合涂覆時(shí)，hNSC在BD PureCoat Amine表面上的生存能力高于組織培養(yǎng)表面大約20到30％。該實(shí)施例證實(shí)：hNSC可以在用單一一種ECM(層粘連蛋白)涂覆的BD PureCoat Amine表面上粘附、生長(zhǎng)和維持生存，并且優(yōu)于用兩種ECM(多聚鳥氨酸和層粘連蛋白；陽(yáng)性對(duì)照)涂覆的組織培養(yǎng)培養(yǎng)板上的這些細(xì)胞的生長(zhǎng)。