本發(fā)明涉及食用菌育種領(lǐng)域，具體的說涉及一種靈芝擔孢子萌發(fā)的方法。
背景技術(shù)：
靈芝[Ganoderma lucidum(Curtis)P.Karst.]隸屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、靈芝屬。《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》將其列為上品，有“益心氣，補中，增智慧，不忘”、“久服輕身不老，延年神仙”，在民間有悠久的應(yīng)用歷史?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明靈芝具有多種功效：1.抗腫瘤作用；2.免疫調(diào)節(jié)作用；3.抗放射作用；4.對神經(jīng)系統(tǒng)作用；5.對心血管作用；6.對呼吸系統(tǒng)的作用；7.對消化系統(tǒng)的作用。靈芝的交配型為四極性異宗結(jié)合，即兩個不同的細胞核共存于一個細胞的菌絲才能進行生殖生長而形成子實體。目前，靈芝常用的育種手段主要有雜交、原生質(zhì)體融合以及誘變等。近來的研究表明目前生產(chǎn)上使用的靈芝菌株間的遺傳多樣性不高，而以此為親本材料通過雜交或誘變或原生質(zhì)體融合等手段獲得的雜交菌株或誘變菌株或融合菌株中出現(xiàn)超親現(xiàn)象的概率很低，因而嚴重影響了育種效率的提高和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)靈芝新品種的獲得。而靈芝品種作為靈芝產(chǎn)業(yè)的源頭和重要要素，在很大程度上影響著靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
靈芝擔孢子是靈芝生長發(fā)育后期通過減數(shù)分裂產(chǎn)生的單核生殖細胞，因而具有豐富的遺傳多樣性，從而為靈芝新品種的選育提供了絕好的材料。但是沒有萌發(fā)的靈芝擔孢子是無法生成初級菌絲的，因而無法通過雜交、原生質(zhì)體融合或誘變等手段進行靈芝品種選育。靈芝孢子具有兩層壁，十分堅韌，一般的化學(xué)、物理方法很難將其打破；在自然界中非常難以萌發(fā)，在實驗室條件下萌發(fā)率也極低。從而限制了靈芝的新品種選育。
雖然利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)可以解決因靈芝擔孢子萌發(fā)率極低，單核菌株不易獲得而出現(xiàn)的難題，但通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)獲得的單核菌株，因沒有發(fā)生減數(shù)分裂，造成獲得的單核菌株的遺傳多樣性不豐富。因此通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)難以獲得廣泛變異的新菌株。
為了解決靈芝育種尤其是實驗室育種的問題，需要開發(fā)一種新的擔孢子萌發(fā)的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明首先提到了一種靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由如下組分組成：
靈芝煮出液，PDA粉末和水；
其中靈芝煮出液、PDA粉末和水的比例為：300～400mL：39g：600～700mL；
其中所述的靈芝煮出液是通過如下方法制備得到的：
將靈芝子實體加入水中，電磁爐800～1600w加熱15～20min，過濾，取濾液即可。
具體的靈芝煮出液是通過如下方法制備得到的：
取靈芝子實體15～20g，加入300～400mL蒸餾水，電磁爐800～1600w加熱10～15min，過濾，取濾液，并加水定容至300～400mL，得到靈芝煮出液。
本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基進行靈芝擔孢子萌發(fā)的方法，該方法為：
取靈芝擔孢子，用水稀釋，形成擔孢子懸浮液，使擔孢子的濃度為×103個/mL；
吸取擔孢子懸浮液均勻涂布于上述靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上；
于25～28℃避光培養(yǎng)至擔孢子萌發(fā)。
本發(fā)明還提供了一種靈芝擔孢子收集與萌發(fā)的方法，該方法包括如下步驟：
⑴適合擔孢子收集的靈芝子實體選擇
選取生長發(fā)育良好、菌蓋美觀且正在噴射靈芝擔孢子的靈芝子實體(正生長于菌棒上)；
⑵擔孢子收集
擔孢子收集采用套筒方式，用兩頭開口的保鮮袋套住靈芝子實體，再用一端封閉的無紡布圓筒套在外部；
擔孢子收集期間的環(huán)境溫度維持在20～30℃；收集時間為3～5d，取靈芝菌蓋上方的擔孢子；
⑶擔孢子保存
收集的靈芝擔孢子存放于無菌的離心管中，并置于4～10℃，待用；
⑷擔孢子萌發(fā)
取靈芝擔孢子，用水稀釋，形成擔孢子懸浮液，使擔孢子的濃度為×103個/mL；
吸取擔孢子懸浮液均勻涂布于上述靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上；
于25～28℃避光培養(yǎng)至擔孢子萌發(fā)。
本發(fā)明所提供的將采用套筒方式收集的靈芝擔孢子在靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上進行萌發(fā)，靈芝擔孢子的萌發(fā)率在10％以上，甚至高達20％，從而獲得靈芝孢子的單核菌株。本方法解決了在實驗室條件下靈芝擔孢子萌發(fā)率極低的難題，從而為未來的靈芝單孢雜交育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的靈芝擔孢子萌發(fā)方法簡單、易行，無需用到特殊的儀器、設(shè)備和藥品，普通的實驗室即可通過本發(fā)明獲得所需的靈芝擔孢子菌株用于靈芝的雜交育種。通過孢子萌發(fā)獲得的單核菌株(由擔孢子萌發(fā)而成的單倍體的菌絲稱為初級菌絲，也稱為初生菌絲，是單核的；由任何一個獨立分離的單細胞繁殖而成的純種群體及其后代即為菌株)遺傳多樣性豐富，所以以此為材料進行雜交獲得的后代的遺傳性狀穩(wěn)定，且有利于獲得新的遺傳性狀，克服了原生質(zhì)體單核菌株雜交遺傳變異小，誘變育種不穩(wěn)定的缺陷，為靈芝的品種改良和新品種選育打下堅實的基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1靈芝擔孢子在培養(yǎng)基上萌發(fā)。
具體實施例
下列實施例中所用靈芝子實體為“滬農(nóng)靈芝1號”，來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所。
實施例1靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基的配制
取靈芝子實體15g，加入300mL蒸餾水，800w加熱15min，過濾，取濾液，并加蒸餾水定容至300mL，得到靈芝煮出液；
靈芝煮出液300mL，PDA粉末(購自BD公司)39g，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌15min。
實施例2靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基的配制
取靈芝子實體17g，加入400mL蒸餾水，1200w加熱12min，過濾，取濾液，并加蒸餾水定容至400mL，得到靈芝煮出液；
靈芝煮出液400mL，PDA粉末(購自BD公司)39g，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌15min。
實施例3靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基的配制
取靈芝子實體20g，加入400mL蒸餾水，1600w加熱10min，過濾，取濾液，并加蒸餾水定容至400mL，得到靈芝煮出液；
靈芝煮出液400mL，PDA粉末(購自BD公司)39g，用蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌15min。
實施例4靈芝擔孢子的收集和萌發(fā)
1.適合擔孢子收集的子實體選擇
選取生長發(fā)育良好、菌蓋美觀且正在噴射靈芝擔孢子的靈芝子實體(正生長于菌棒上)，用蒸餾水進行清洗，確保子實體和菌棒清潔，用于收集靈芝擔孢子。
2.擔孢子收集
擔孢子收集采用套筒方式，用兩頭開口的保鮮袋套住靈芝子實體，再用一端封閉的無紡布圓筒套在外部。
擔孢子收集期間的環(huán)境溫度維持在20～30℃；收集時間為3d，取靈芝菌蓋上方的擔孢子用于萌發(fā)。
3.擔孢子保存
收集的靈芝擔孢子存放于無菌的離心管中，并置于4～10℃，待用。
4.擔孢子萌發(fā)
取極少量的靈芝擔孢子，用無菌蒸餾水逐步稀釋，形成擔孢子懸浮液，確保擔孢子的濃度為2×103個/mL。吸取50μL擔孢子懸浮液均勻涂布于實施例1中制備的靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上，然后于25～28℃避光培養(yǎng)至擔孢子萌發(fā)。
5.初級菌絲體的獲得及鑒定
用無菌的10μL小槍頭在無菌條件下挑取擔孢子萌發(fā)的菌落于PDA平板中央，同時在其邊緣斜插一無菌蓋玻片，25～28℃培養(yǎng)。當菌絲長至蓋玻片上，即可在無菌條件下將其取出并置于顯微鏡下進行鏡檢，觀察是否有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的即為初級菌絲體。最終獲得了“滬農(nóng)靈芝1號”的擔孢子萌發(fā)而成的單核菌株100株。涂布萌發(fā)培養(yǎng)基平板上的擔孢子總數(shù)為1000個，所以根據(jù)下列靈芝擔孢子萌發(fā)率的計算公式，
可以計算出本實施例中的靈芝擔孢子萌發(fā)率為10％。
靈芝擔孢子的萌發(fā)率(％)＝(平板上挑取的單菌落總數(shù)/涂布于平板上的擔孢子總數(shù))*100％
6.靈芝孢子單核菌株交配型測定
靈芝為典型的四極性異宗結(jié)合真菌，因而理論上其后代應(yīng)具有4種交配型。因此通過交配型測定，了解“滬農(nóng)靈芝1號”擔孢子交配型與理論上的交配類型是否一致；同時還可以通過交配型測定，明確這些靈芝孢子萌發(fā)的單核菌株的交配型，為后續(xù)的靈芝單孢雜交育種奠定基礎(chǔ)，提高育種的效率。
以“滬農(nóng)靈芝1號”一個孢子單核菌株1的交配型記為A1B1，作為交配型測定的基準菌株，將余下99株孢子單核菌株分別與菌株1接種在PDA平板上進行對峙培養(yǎng)，待兩個孢子單核菌株的菌絲接觸2～3d后，取交界處的菌塊于新的PDA平板上，并在菌塊邊緣斜插一無菌蓋玻片，25～28℃培養(yǎng)。待菌絲延伸至蓋玻片上，取出該蓋玻片于顯微鏡下觀察菌絲有無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)則表示待測試菌株與菌株1發(fā)生性親和反應(yīng)，所有與菌株1發(fā)生性親和反應(yīng)的單核菌株的交配型則判定為A2B2。選出交配型為A2B2的單核菌株中的1株，將其定為測交菌株C1。
將所有不與單核菌株1發(fā)生性親和反應(yīng)的孢子單核菌株與菌株C1對峙培養(yǎng)，能與菌株C1發(fā)生性親和反應(yīng)的孢子單核菌株的交配型則判定為A1B1。
將與菌株1和菌株C1均不發(fā)生性親和反應(yīng)，但與菌株1形成假鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)(具有假鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的菌株是不能進行生殖生長而形成子實體的)的某個單核菌株定為測交菌株D1，其交配型則判定為A2B1。將與菌株1和菌株C1均不發(fā)生親和反應(yīng)的所有其他單核菌株分別與菌株D1對峙培養(yǎng)，與菌株D1發(fā)生性親和反應(yīng)，形成鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的菌株的交配型則判定為A1B2；與菌株D1不發(fā)生親和反應(yīng)的菌株的交配型即為A2B1。
通過上述三輪交配型測試，可知100株“滬農(nóng)靈芝1號”單核菌株的交配型共有4種。交配型為A1B1的有27株孢子單核菌株，交配型為A2B2的有31株孢子單核菌株，交配型為A1B2的有20株孢子單核菌株，交配型為A2B1的有22株。
實施例5靈芝擔孢子的收集和萌發(fā)
1.適合擔孢子收集的子實體選擇
選取生長發(fā)育良好、菌蓋美觀且正在噴射靈芝擔孢子的“滬農(nóng)靈芝1號”靈芝子實體(正生長于菌棒上)，用蒸餾水進行清洗，確保子實體和菌棒清潔，用于收集靈芝擔孢子。
2.擔孢子收集
擔孢子收集采用套筒方式，用兩頭開口的保鮮袋套住靈芝子實體，再用一端封閉的無紡布圓筒套在外部。
擔孢子收集期間的環(huán)境溫度維持在22～28℃；收集時間為3d，取靈芝菌蓋上方的擔孢子用于萌發(fā)。
3.擔孢子保存
收集的靈芝擔孢子存放于無菌的離心管中，并置于4～6℃，待用。
4.擔孢子萌發(fā)
取極少量的靈芝擔孢子，用無菌蒸餾水逐步稀釋，形成擔孢子懸浮液，確保擔孢子的濃度為1.3×103個/mL。吸取80μL擔孢子懸浮液均勻涂布于實施例2中制備的靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上，然后于25～28℃避光培養(yǎng)至擔孢子萌發(fā)。
5.初級菌絲體的獲得及鑒定
用無菌的10μL小槍頭在無菌條件下挑取擔孢子萌發(fā)的菌落于PDA平板中央，同時在其邊緣斜插一無菌蓋玻片，25～28℃培養(yǎng)。當菌絲長至蓋玻片上，即可在無菌條件下將其取出并置于顯微鏡下進行鏡檢，觀察是否有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的即為初級菌絲體。最終獲得了“滬農(nóng)靈芝1號”的擔孢子萌發(fā)而成的單核菌株83株。涂布萌發(fā)培養(yǎng)基平板上的擔孢子總數(shù)為520個，所以根據(jù)前述靈芝擔孢子萌發(fā)率的計算公式，可以計算出本實施例中的靈芝擔孢子萌發(fā)率約為16％。
實施例6靈芝擔孢子的收集和萌發(fā)
1.適合擔孢子收集的子實體選擇
選取的生長發(fā)育良好、菌蓋美觀且菌蓋邊緣出現(xiàn)0.5cm的白色至淺褐色生長圈的“滬農(nóng)靈芝1號”靈芝子實體(正生長于菌棒上)，用蒸餾水進行清洗，確保子實體和菌棒清潔，用于收集靈芝擔孢子。
2.擔孢子收集
擔孢子收集采用套筒方式，用兩頭開口的保鮮袋套住靈芝子實體，再用一端封閉的無紡布圓筒套在外部。
擔孢子收集期間的環(huán)境溫度維持在25～28℃；收集時間為5d，取靈芝菌蓋上方的擔孢子用于萌發(fā)。
3.擔孢子保存
收集的靈芝擔孢子存放于無菌的離心管中，并置于4～6℃，待用。
4.擔孢子萌發(fā)
取極少量的靈芝擔孢子，用無菌蒸餾水逐步稀釋，形成擔孢子懸浮液，確保擔孢子的濃度為1×103個/mL。吸取100μL擔孢子懸浮液均勻涂布于實施例3中制備的靈芝擔孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上，然后于25～26℃避光培養(yǎng)至擔孢子萌發(fā)。
5.初級菌絲體的獲得及鑒定
用無菌的10μL小槍頭在無菌條件下挑取擔孢子萌發(fā)的菌落于PDA平板中央，同時在其邊緣斜插一無菌蓋玻片，25～28℃培養(yǎng)。當菌絲長至蓋玻片上，即可在無菌條件下將其取出并置于顯微鏡下進行鏡檢，觀察是否有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的即為初級菌絲體。最終獲得了“滬農(nóng)靈芝1號”的擔孢子萌發(fā)而成的單核菌株139株。涂布萌發(fā)培養(yǎng)基平板上的擔孢子總數(shù)為700個，所以根據(jù)前述靈芝擔孢子萌發(fā)率的計算公式，可以計算出本實施例中的靈芝擔孢子萌發(fā)率約為20％。