本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)，具體是一種高效避免污染的炭疽病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
炭疽病是許多作物上的重要病害，在不少作物上常造成重大經(jīng)濟(jì)損失。引起炭疽病的病原菌為炭疽菌屬(Colletotrichum)的真菌，常見的是膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。分生孢子是炭疽病菌的無性繁殖體，在炭疽病的病害循環(huán)和病害流行中發(fā)揮重大作用。在實驗室內(nèi)，分生孢子也是炭疽病研究不可缺少的材料。有關(guān)孢子的形成發(fā)育生理、對不良環(huán)境的生存適應(yīng)性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應(yīng)等研究，都需要使用孢子形態(tài)的材料；新型防治藥物研發(fā)方面的有關(guān)研究，如藥劑對孢子的致毒效應(yīng)等，也需要孢子；分子生物學(xué)領(lǐng)域的有關(guān)研究，如致病相關(guān)基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是炭疽病日常研究的重要的菌體形態(tài)。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子要達(dá)到?jīng)]有雜菌污染的狀態(tài)。
炭疽病菌能在常規(guī)培養(yǎng)基上形成分生孢子，實驗室制備培養(yǎng)分生孢子的常規(guī)方法是，利用普通培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)器具，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)平板，炭疽病菌在培養(yǎng)平板上生長并形成分生孢子。
一般實驗室使用的培養(yǎng)皿由皿底和皿蓋組成，限于當(dāng)前培養(yǎng)皿的制作工藝技術(shù)，皿底與皿蓋間很難達(dá)到均勻貼合的程度，大多數(shù)培養(yǎng)皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養(yǎng)皿內(nèi)外的空氣流動可暢通無阻。培養(yǎng)皿這順暢的通氣性，對需要良好通氣條件的孢子形成發(fā)育非常有利，但正是這順暢的通氣性，導(dǎo)致培養(yǎng)皿內(nèi)的生物材料容易受外界污染空氣的干擾，培養(yǎng)得到帶有雜菌污染的孢子成品的機(jī)率較大。尤其是一般的植物病理學(xué)實驗室，當(dāng)前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養(yǎng)箱，該類培養(yǎng)箱通常為了實現(xiàn)工作室內(nèi)快速恒溫及溫度均勻分布狀態(tài)，往往將工作室設(shè)計為循環(huán)空氣的模式。利用這類培養(yǎng)箱進(jìn)行的產(chǎn)孢培養(yǎng)，培養(yǎng)皿周圍空氣處于常流動狀態(tài)，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料污染的機(jī)率相當(dāng)高，通常培養(yǎng)7天可造成50％以上的培養(yǎng)平板被雜菌污染，即使一些培養(yǎng)平板上看不到明顯的青霉菌等實驗室污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染情況仍然存在。因此，利用培養(yǎng)皿培養(yǎng)制備炭疽病菌分生孢子，在技術(shù)上很難排除污染的可能。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種高效避免污染的炭疽病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
一種高效避免污染的炭疽病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)方法的步驟如下：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.三角瓶式培養(yǎng)基的制備：用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為三角瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.炭疽病菌的移植：用移植工具將實驗室常備的炭疽病菌菌絲體，移植入步驟2制備的三角瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產(chǎn)孢：將步驟3操作完備后的三角瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；通常培養(yǎng)6天后，三角瓶式培養(yǎng)基面上已形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。
5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的炭疽病菌分生孢子液。
本發(fā)明的特色與優(yōu)點是：
1)三角瓶配上常規(guī)瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護(hù)三角瓶內(nèi)不受雜菌污染，獲得高質(zhì)量的孢子成品。
2)三角瓶內(nèi)收集孢子比培養(yǎng)皿內(nèi)收集孢子的操作更為方便。
3)三角瓶的保護(hù)可使得產(chǎn)孢菌落能隨意放置一段時間而不受污染，并保持產(chǎn)孢狀態(tài)，便于與需要孢子的工作程序銜接。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是三角瓶與瓊脂類培養(yǎng)基的結(jié)合與應(yīng)用。
三角瓶雖然屬植物病理學(xué)實驗室的日常器具，但其常規(guī)用途主要是裝盛培養(yǎng)基滅菌；也常見用于裝盛液體培養(yǎng)基、或植物組織類培養(yǎng)基(如籽粒、秸稈等)進(jìn)行病原菌培養(yǎng)。
瓊脂類培養(yǎng)基的應(yīng)用，現(xiàn)有的技術(shù)規(guī)范都是使用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，將瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)基平板，并在該培養(yǎng)平板上培養(yǎng)病原菌。
炭疽病菌分生孢子在瓊脂培養(yǎng)基上的制備培養(yǎng)，均為應(yīng)用常規(guī)的技術(shù)規(guī)范，即利用培養(yǎng)皿結(jié)合瓊脂類培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行制備培養(yǎng)；至今還未見有利用三角瓶作培養(yǎng)器具，在瓊脂類培養(yǎng)基上進(jìn)行炭疽病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)的孢子制備技術(shù)。可能原因是對培養(yǎng)皿的長期依賴及習(xí)慣沿用，以及通常認(rèn)為病原菌產(chǎn)孢需要通氣性良好的環(huán)境條件，而培養(yǎng)皿恰好能滿足良好的通氣性。
普通三角瓶套上瓶塞后，雖然形成通氣性較差的封閉環(huán)境，但發(fā)明人反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，炭疽病菌能在該較為封閉的環(huán)境內(nèi)的瓊脂培養(yǎng)基上形成分生孢子；而三角瓶的應(yīng)用，則正好解決應(yīng)用培養(yǎng)皿容易導(dǎo)致污染的重大技術(shù)問題。
炭疽病菌可在許多瓊脂類培養(yǎng)基上生長并形成分生孢子，本發(fā)明所述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基是實驗室常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，其組分為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL；按常規(guī)方法煮配。培養(yǎng)基煮配完畢后，可直接分裝到三角瓶中；由于三角瓶底部多屬曲面狀態(tài)，培養(yǎng)基量過少會造成瓶底局部無培養(yǎng)基或培養(yǎng)基過薄，培養(yǎng)基過多則容易造成浪費；通常每瓶(250mL規(guī)格)裝入20～30mL培養(yǎng)基為宜，其它規(guī)格的三角瓶酌情增減液量。
套好瓶塞后，常規(guī)高壓高溫滅菌，滅菌后取出三角瓶平置于平直的桌面上，冷卻后形成三角瓶式培養(yǎng)基。
瓶式培養(yǎng)基也可以用另一種方法分裝，先用較大的三角瓶按常規(guī)方式裝入液量較多的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；再如同倒培養(yǎng)皿平板一樣，使用前加熱熔化后，分裝到滅菌的空白三角瓶內(nèi)。
炭疽病菌的移植可按常規(guī)方式移植，用普通菌落上的菌絲體作移植用的母體菌體；為加速培養(yǎng)進(jìn)程，可在一個瓶式培養(yǎng)基上植入多塊菌絲塊。
產(chǎn)孢培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)箱內(nèi)實施，溫度控制在炭疽病菌生長的適宜溫度，本發(fā)明培養(yǎng)溫度采用28℃；培養(yǎng)過程對光照條件和濕度條件無特別需求。
通常產(chǎn)孢制備培養(yǎng)6天后，三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基面上已形成濃密的氣生菌絲和大量分生孢子。
用無菌水收集獲得的分生孢子，實際操作可用T形玻棒刷洗菌落，使孢子釋放到洗孢水液中。
實施例1
應(yīng)用本發(fā)明一種高效避免污染的炭疽病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)杧果炭疽病菌菌株Cg-1的分生孢子，按如下步驟實施操作：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.三角瓶式培養(yǎng)基的制備：用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配比為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL；將培養(yǎng)基分裝于步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，每瓶裝30mL，常規(guī)高壓高溫滅菌后成為三角瓶式培養(yǎng)基，備用。
3.炭疽病菌的移植：用移植針將實驗室常備的杧果炭疽病菌菌株Cg-1菌絲體，移植入步驟2制備的三角瓶式培養(yǎng)基上。
4.培養(yǎng)產(chǎn)孢：將步驟3操作完備后的三角瓶式培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)6天后，三角瓶式培養(yǎng)基面上已形成菌絲密集的菌落，菌落上形成大量的分生孢子。
5.分生孢子的收集：用無菌水洗脫步驟4獲得的菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的杧果炭疽病菌分生孢子液。
用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為12.3×106個/mL的分生孢子液。
實施例2
應(yīng)用本發(fā)明一種高效避免污染的炭疽病菌分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)杧果炭疽病菌菌株Cg-2的分生孢子，按實施例1的步驟1至步驟5操作實施，不同的只是步驟3使用的菌株是Cg-2。
用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為1.6×106個/mL的分生孢子液。