1.一種脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌的構(gòu)建方法,其特征在于:包括如下步驟:
(1)以裂殖壺菌的基因組為DNA模板,用上游引物對和下游引物對分別PCR擴(kuò)增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA,上述上游引物對包括上游正向引物和上游反向引物,分別如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示,下游引物對包括下游正向引物和下游反向引物,分別如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示;
(2)將上游片段UFabA和下游片段DFabA與敲除載體連接,構(gòu)建重組敲除質(zhì)粒;
(3)將上述重組敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化裂殖壺菌,用抗性平板篩選,并經(jīng)PCR抗性基因序列驗(yàn)證,得轉(zhuǎn)化子,即所述脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述敲除載體為pBlu-Zeo。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于:所述PCR擴(kuò)增的程序包括如下:(1)94℃,5min;(2)94℃,30s;(3)55℃,30s;(4)72℃,1min;(5)重復(fù)(2)~(4)35個循環(huán);(6)72℃,10min;(7)4℃保存。
4.一種多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法,其特征在于:用權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述構(gòu)建方法構(gòu)建的裂殖壺菌工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法,其特征在于:包括如下步驟:
(1)將所述裂殖壺菌工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),獲得種子培養(yǎng)液;
(2)將步驟(1)所得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),以發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸,得發(fā)酵液;
(3)將步驟(3)所得的發(fā)酵液中的菌體充分消化,加入正己烷混勻后靜置分層,獲得有機(jī)相,接著用正己烷清洗該有機(jī)相至無色,最后去除正己烷,即得所述多不飽和脂肪酸。
6.如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟(1)為:將所述裂殖壺菌工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中,于27~29℃,180~220rpm培養(yǎng)24~48h,獲得種子培養(yǎng)液。
7.如權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)方法,其特征在于:所述步驟(2)為:將步驟(1)所得的種子培養(yǎng)液以3~5%的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于27~29℃,180~220rpm培養(yǎng)4~6d,以發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸,得發(fā)酵液。