本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)NtZFP8基因提高植物組織培養(yǎng)分化效率的方法。

背景技術(shù)：

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞全能性的體現(xiàn)。隨著體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理研究的深入及相關(guān)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅在林木、農(nóng)作物和園藝作物的快速繁殖方面得到廣泛應(yīng)用，也在基因工程品種培育中發(fā)揮著重要的作用。植物組織培養(yǎng)主要通過兩個(gè)途徑：其一為外植體直接誘導(dǎo)發(fā)生；其二是間接誘導(dǎo)發(fā)生，即通過體細(xì)胞誘導(dǎo)成胚性愈傷組織，愈傷組織再分化出芽，獲得再生植株。分化效率是衡量植物組織培養(yǎng)技術(shù)效率的重要指標(biāo)。

外植體和愈傷組織的分化是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，需要一些特定的物理和化學(xué)因子進(jìn)行啟動(dòng)和維持，如受體植物的基因型，外植體類型和生理狀態(tài)，培養(yǎng)基組成以及植物激素組成等。如在水稻中研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型水稻，其愈傷組織分化能力不同，粳稻要明顯優(yōu)于秈稻(Lin Y J,Zhang Q.Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice[J].Plant Cell Reports,2005,23(8):540-547.)，同時(shí)也對(duì)秈稻愈傷組織轉(zhuǎn)基因效率產(chǎn)生影響(Tie W,Zhou F,Wang L,et al.Reasons for lower transformation efficiency in indica rice using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation:lessons from transformation assays and genome-wide expression profiling[J].Plant Molecular Biology,2012,78(1):1-18.)。外植體和愈傷組織分化效率問題增加了植物組織培養(yǎng)工廠化規(guī)模繁育的周期，提高了生產(chǎn)成本。

前人通過調(diào)節(jié)激素配比，改變培養(yǎng)基成分以及改良培養(yǎng)環(huán)境等措施提高分化能力(朱克明,陶慧敏,徐碩,等.水稻愈傷分化和再生研究進(jìn)展[J].種子,2016(11):55-59.)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過植物生物工程進(jìn)行受體植物改造從而提高再生能力已成為一個(gè)新的研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種新的基因，并通過將其轉(zhuǎn)基因的方式來提高植物組織培養(yǎng)分化效率。

本發(fā)明首先提供了一種基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述重組載體是重組pCAMBIA1301載體。

本發(fā)明還提供了一種重組菌，它包含前述重組載體.優(yōu)選地，所述重組菌為重組農(nóng)桿菌，進(jìn)一步優(yōu)選為重組農(nóng)桿菌EHA105。

本發(fā)明還提供了一種蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示.

本發(fā)明還提供了前述的基因片段、重組載體、重組菌、蛋白在提高植物的外植體和/或愈傷組織的分化效率中的用途。

其中，所述植物為煙草。

本發(fā)明還提供了一種提高植物組織培養(yǎng)分化效率的方法，取前述的基因片段、重組載體、重組菌，轉(zhuǎn)入植物中，獲得穩(wěn)定表達(dá)前述蛋白的植株或者種子，即可。

其中，所述植物為煙草。

本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)NtZFP8提高植物組織培養(yǎng)再生率的方法，采用煙草本發(fā)明NtZFP8基因片段，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因材料，并且驗(yàn)證試驗(yàn)表明NtZFP8基因能夠?qū)χ参锿庵搀w和愈傷組織分化起著重要作用，分化得到的再生芽能夠發(fā)育成植株，因此可將所述基因和重組質(zhì)粒在品種選育和組織培養(yǎng)工廠化中應(yīng)用，從植物基因工程這一條新途徑服務(wù)于應(yīng)用和生產(chǎn)。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為NtZFP8基因的PCR擴(kuò)增的電泳圖，其中M泳道為分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker,購自艾德萊公司)，1-2泳道為NtZFP8擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為轉(zhuǎn)NtZFP8基因農(nóng)桿菌菌落PCR的電泳圖，其中M泳道為分子量標(biāo)記(AL2000DNAMarker,購自艾德萊公司)，1-6泳道為農(nóng)桿菌菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖3 NtZFP8基因表達(dá)水平的鑒定結(jié)果，其中，1為野生型對(duì)比，2和3為超表達(dá)實(shí)驗(yàn)組。

圖4為野生型和超表達(dá)NtZFP8煙草的愈傷組織分化圖，其中A為野生型對(duì)比，B為超表達(dá)實(shí)驗(yàn)組。

具體實(shí)施方式

若未特別指明，實(shí)施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》(馬文麗，2011)一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實(shí)施例1本發(fā)明NtZFP8基因的分離以及轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建

本實(shí)施例主要是NtZFP8基因獲得，載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因材料制備的方法，簡要介紹如下。試驗(yàn)中所用煙草背景材料為貴煙6號(hào)，由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物發(fā)育生理實(shí)驗(yàn)室保存。

(1)基因片段和載體的構(gòu)建

稱取0.5克煙草新鮮葉片，提取煙草RNA，用PrimeScript^TM RT reagent Kit(RR037Q)合成cDNA，設(shè)計(jì)引物(NtZFP8-F：5’-ATGGACAAAACAGACAGAGAAAC-3’；NtZFP8-R：5’-TCACAAGTGTAGATCTAAACTCACAT-3’)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的條帶大小的片段(結(jié)果如圖1所示)。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(Takara,805A)純化，連接T載體(Transgene Biotech,CT101-01)，用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化物在含有卡那霉素的LB平板上篩選，挑取單克隆，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

擴(kuò)增得到的目的片段NtZFP8基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)為：

ATGGACAAAACAGACAGAGAAACTCGTGATTTCATGAACGTGGAGTCCTTCTCTCAGCTACCCTTTATTCGACCAGCACCAGCTAATAAAGAAAAAGCCATTAGGCTTTTTGGCAAAGAATTTGGTACTGCTGGTGACTCCATGGCTGCAACAGAATCCACTGAAACAAACCCTAGCCAAGAAGAAATCAAAGACCATATTAGCAACAACAGTGAGAGCAGTCGAAAATTCGAGTGCCATTATTGTTGCAGGAATTTCCCGACTTCACAAGCACTAGGAGGACATCAAAATGCTCATAAGAGAGAACGCCAGAATGCTAAAAGAGCGCATCTTCAATCTGCAATGGTACACGGTGCTTTAACAGAGGCAAATATTTATGGAATAATGAATTACCATCGTCTTGGTAGTGCGCCAACAGCAGCTTATCATCATCACTACGCAACCAACAATATTAACAGTGCTACTAGGTTTTATGGAAGCCATCACCATGTTAATAGTACCCCTTATAATTCTCATCAAACTCCTATAAATGGAAGTCCTTTAGCTTTATGGAGGATTCCTGCAGCAACTAGTGTTCATCATACTTCTTCGTCTTCGTCTAATTTTGGCCGTGAACGATCCATGAATATGCAGCCATTGCCAGTATTTGCTGCTAATAATGAGGATTTCAAGCCTTCTCCAATCATCAATAGCTCAAGTTCTCAAAGAGGGTTCGGATATGAAACAAAGGCCGGAATTAAAGATCATGTGAGTTTAGATCTACACTTGTGA

前述核苷酸序列所述的NtZFP8基因可以通過采用上述方法獲得，也可以直接合成。

提取含有NtZFP8基因的質(zhì)粒，雙酶切，T4-DNAligase(RT406)連接pCAMBIA1301載體，16℃連接過夜后，將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR，菌落PCR結(jié)果(結(jié)果如圖2所示)顯示出現(xiàn)與NtZFP8基因大小相一致的擴(kuò)增產(chǎn)物。

(2)轉(zhuǎn)基因植物的準(zhǔn)備

將重組農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液濃度為OD600＝0.6。

將煙草葉盤浸沒在菌液中，浸泡10分鐘。置于含有6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.5mg/L的MURASHIGE SKOOG(MS)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購自美國PhytoTech公司)中，暗處培養(yǎng)2d；為除去多余的農(nóng)桿菌，將煙草葉盤轉(zhuǎn)移到含有6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.5mg/L和頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)基上后。

煙草葉盤在含有6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.5mg/L，卡那霉素100mg/L和頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)基上生長兩周以后，觀察到有葉盤膨大，顏色變淺，在葉片邊緣出現(xiàn)愈傷組織。經(jīng)過兩周的處理，將葉盤轉(zhuǎn)移到含有6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L，萘乙酸0.5mg/L，卡那霉素50mg/L和頭孢霉素300mg/L的MS培養(yǎng)基上做篩選培養(yǎng)。培養(yǎng)3周以后，在葉片邊緣的愈傷組織上產(chǎn)生了大量的叢生芽。待叢生芽生長到2cm左右，將其移到含有100mg/L氨芐霉素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。兩周后進(jìn)行練苗，三天后移栽到花盆中進(jìn)行生長。

收集上述農(nóng)桿菌侵染后的煙草收獲的種子，在含有100mg/L氨芐霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，選擇可以正常生長的苗栽培至土中，成熟后收種子，繼續(xù)含有100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基篩選。

取陽性種子進(jìn)行分子鑒定，測定NtZFP8基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，證明本發(fā)明的確獲得了目的基因NtZFP8基因穩(wěn)定表達(dá)的純合體。

NtZFP8基因表達(dá)的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)為：

MDKTDRETRDFMNVESFSQLPFIRPAPANKEKAIRLFGKEFGTAGDSMAATESTETNPSQEEIKDHISNNSESSRKFECHYCCRNFPTSQALGGHQNAHKRERQNAKRAHLQSAMVHGALTEANIYGIMNYHRLGSAPTAAYHHHYATNNINSATRFYGSHHHVNSTPYNSHQTPINGSPLALWRIPAATSVHHTSSSSSNFGRERSMNMQPLPVFAANNEDFKPSPIINSSSSQRGFGYETKAGIKDHVSLDLHL

以下通過試驗(yàn)例的方式來說明本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)例1 NtZFP8基因直接提高植物外植體分化效率的能力

1、試驗(yàn)方法

將野生型煙草種子和NtZFP8超表達(dá)煙草種子(實(shí)施例1制備含有NtZFP8基因的種子)，分別與次氯酸鈉(1％)中消毒4分鐘，至于滅菌濾紙上晾干，放于含有MS固體培養(yǎng)基的平板上萌發(fā)。7天后，轉(zhuǎn)移到含有MS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，15天后，用于外植體分化試驗(yàn)。

分別取野生型和NtZFP8超表達(dá)煙草無菌苗第三片葉片，用1cm打孔器獲得同等大小葉片，至于含有MS固體培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行分化誘導(dǎo)，20d后觀察分化效率獲得情況。

2、試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，野生型煙草葉盤誘導(dǎo)后，有芽點(diǎn)出現(xiàn)，但無法長大，無法得到有利用價(jià)值的再生芽；NtZFP8超表達(dá)煙草葉盤誘導(dǎo)后，7天后開始出現(xiàn)芽點(diǎn)，芽點(diǎn)能逐步長大，達(dá)到3cm以上，得到具有利用價(jià)值的再生芽。

試驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明NtZFP8基因轉(zhuǎn)入煙草后，可以提高煙草外植體的分化能力。

試驗(yàn)例2 NtZFP8基因提高植物愈傷組織分化效率的能力

按照試驗(yàn)例1所述方法獲得葉盤，置于含有6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.5mg/L的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。10天后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化情況和芽點(diǎn)數(shù)目；15天后，統(tǒng)計(jì)再生苗獲得數(shù)目。

結(jié)果表明，如圖4所示，得到的陽性煙草葉片愈傷組織產(chǎn)生早，表面芽狀突起更多，獲得的再生苗數(shù)目顯著高于野生型煙草。

試驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明NtZFP8基因轉(zhuǎn)入煙草后，可以提高煙草愈傷組織的分化能力。

綜上，本發(fā)明制備得到了NtZFP8基因以及重組菌，將其轉(zhuǎn)入植物中，可以有效提高植物的外植體和愈傷組織的分化效率，進(jìn)而提高植物組織培養(yǎng)技術(shù)效率，應(yīng)用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大學(xué)

<120> 一種轉(zhuǎn)NtZFP8基因提高植物組織培養(yǎng)分化效率的方法

<130> GY007-17P1102

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> NtZFP8基因的核苷酸序列

<400> 1

atggacaaaa cagacagaga aactcgtgat ttcatgaacg tggagtcctt ctctcagcta 60

ccctttattc gaccagcacc agctaataaa gaaaaagcca ttaggctttt tggcaaagaa 120

tttggtactg ctggtgactc catggctgca acagaatcca ctgaaacaaa ccctagccaa 180

gaagaaatca aagaccatat tagcaacaac agtgagagca gtcgaaaatt cgagtgccat 240

tattgttgca ggaatttccc gacttcacaa gcactaggag gacatcaaaa tgctcataag 300

agagaacgcc agaatgctaa aagagcgcat cttcaatctg caatggtaca cggtgcttta 360

acagaggcaa atatttatgg aataatgaat taccatcgtc ttggtagtgc gccaacagca 420

gcttatcatc atcactacgc aaccaacaat attaacagtg ctactaggtt ttatggaagc 480

catcaccatg ttaatagtac cccttataat tctcatcaaa ctcctataaa tggaagtcct 540

ttagctttat ggaggattcc tgcagcaact agtgttcatc atacttcttc gtcttcgtct 600

aattttggcc gtgaacgatc catgaatatg cagccattgc cagtatttgc tgctaataat 660

gaggatttca agccttctcc aatcatcaat agctcaagtt ctcaaagagg gttcggatat 720

gaaacaaagg ccggaattaa agatcatgtg agtttagatc tacacttgtg a 771

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> NtZFP8基因表達(dá)的蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Asp Lys Thr Asp Arg Glu Thr Arg Asp Phe Met Asn Val Glu Ser

1 5 10 15

Phe Ser Gln Leu Pro Phe Ile Arg Pro Ala Pro Ala Asn Lys Glu Lys

20 25 30

Ala Ile Arg Leu Phe Gly Lys Glu Phe Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met

35 40 45

Ala Ala Thr Glu Ser Thr Glu Thr Asn Pro Ser Gln Glu Glu Ile Lys

50 55 60

Asp His Ile Ser Asn Asn Ser Glu Ser Ser Arg Lys Phe Glu Cys His

65 70 75 80

Tyr Cys Cys Arg Asn Phe Pro Thr Ser Gln Ala Leu Gly Gly His Gln

85 90 95

Asn Ala His Lys Arg Glu Arg Gln Asn Ala Lys Arg Ala His Leu Gln

100 105 110

Ser Ala Met Val His Gly Ala Leu Thr Glu Ala Asn Ile Tyr Gly Ile

115 120 125

Met Asn Tyr His Arg Leu Gly Ser Ala Pro Thr Ala Ala Tyr His His

130 135 140

His Tyr Ala Thr Asn Asn Ile Asn Ser Ala Thr Arg Phe Tyr Gly Ser

145 150 155 160

His His His Val Asn Ser Thr Pro Tyr Asn Ser His Gln Thr Pro Ile

165 170 175

Asn Gly Ser Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ile Pro Ala Ala Thr Ser Val

180 185 190

His His Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asn Phe Gly Arg Glu Arg Ser Met

195 200 205

Asn Met Gln Pro Leu Pro Val Phe Ala Ala Asn Asn Glu Asp Phe Lys

210 215 220

Pro Ser Pro Ile Ile Asn Ser Ser Ser Ser Gln Arg Gly Phe Gly Tyr

225 230 235 240

Glu Thr Lys Ala Gly Ile Lys Asp His Val Ser Leu Asp Leu His Leu

245 250 255

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> NtZFP8-F

<400> 3

atggacaaaa cagacagaga aac 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> NtZFP8-R

<400> 4

tcacaagtgt agatctaaac tcacat 26