本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，尤其涉及一種與卵巢癌和子宮內膜癌相關的長鏈非編碼RNA PCGEM1的siRNA和應用。

背景技術：

卵巢癌和子宮內膜癌是最致命的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率高，并且近幾年呈上升趨勢，嚴重威脅著我國女性的生命健康。早期篩查與及早診治對卵巢癌和子宮內膜癌患者的預后及療效至關重要。

近年來，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移、耐藥中的作用成為研究熱點。長鏈非編碼RNA是一類定位于細胞核或細胞質中，轉錄本長度大于200 nt，且以RNA的形式調控基因的表達水平的一類非編碼RNA。lncRNA 主要可分為5種類型，具體為反義長鏈非編碼RNA ,內 含 子 非 編 碼RNA，基 因 間 長 鏈 非 編 碼RNA，啟動子相關長鏈非編碼RNA，非翻譯區(qū)長鏈非編碼RNA。由于不參與編碼形成蛋白質分子，早期lncRNA被定義為不具備生物學功能的轉錄組“噪音”。但近年來發(fā)現(xiàn)lncRNA能以RNA形式在表觀遺傳學、轉錄及轉錄后等多種層面調控基因的表達。lncRNA能夠與多種生物分子結合，通過多種途徑和分子機制調控基因表達，參與多種生物學功能。

前列腺癌的基因表達標記1（PCGEM1）的lncRNA通常過度侵略前列腺癌，并與增殖有密切的關系。此外，PCGEM1外源性過表達抑制細胞凋亡，誘導自噬和刺激的人滑膜細胞增殖的影響。但并沒有關于lncRNA PCGEM1在卵巢癌和子宮內膜癌組織中表達情況的相關報道，并且尋找到有效的早期發(fā)病的生物標志物，以及相關的分子機制對指導卵巢癌和子宮內膜癌臨床診治及治療有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供一種與卵巢癌和子宮內膜癌相關的長鏈非編碼RNA PCGEM1的siRNA和應用。該長鏈非編碼RNA與癌細胞的增殖、凋亡能力相關，可作為卵巢癌和子宮內膜癌的診斷標志，為兩種惡性腫瘤治療的提供分子靶點，針對其設計的siRNA可應用于抗腫瘤的藥物的制備。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種與卵巢癌和子宮內膜癌相關的長鏈非編碼RNA PCGEM1，其DNA序列如SEQ.ID. NO.1所示；針對該長鏈非編碼RNA設計的siRNA，所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分別如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

SEQ.ID.NO.2 ： GGAAACAACCUUUAACUUA。

SEQ.ID.NO.3 ： UAAGUUAAAGGUUGUUUCC。

所述的與卵巢癌和子宮內膜癌相關的長非編碼RNA PCGEM1的siRNA可以用于制備抗卵巢癌和子宮內膜癌藥物。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)LncRNA PCGEM1在上皮性卵巢癌和子宮內膜癌患者中的表達均高于正常卵巢組織和子宮內膜組織，LncRNA PCGEM1表達異常和卵巢癌、子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，這為卵巢癌、子宮內膜癌的LncRNA的臨床治療和科學研究提供了基礎。

本發(fā)明提供的與卵巢癌、子宮內膜癌相關的LncRNA，是通過長鏈非編碼RNA芯片技術分別對3對卵巢癌、正常卵巢組織及子宮內膜癌、子宮內膜正常組織中差異表達的長鏈非編碼RNA進行了分析篩選，獲得了在卵巢癌、子宮內膜癌組織中高表達的長鏈非編碼RNA分子。本發(fā)明提供的與卵巢癌和子宮內膜癌相關的LncRNA，是由上海SIGMA生物公司獨家的Rosetta算法，確保基因設計時的高效特異性基礎上設計siRNA序列；其質粒序列由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計。在獲取了其具體的序列之后，并設計siRNA序列及質粒序列進行轉染；采用該片段敲低/高表達卵巢癌細胞系A2780、OVCAR3及子宮內膜癌細胞系HEC-1B、Ishikawa中該長鏈非編碼RAN分子的表達后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖活性下降/上升。因此該基因的功能可能與癌細胞的增殖能力相關。

附圖說明

圖1利用qRT-PCR檢測PCGEM1在卵巢癌及正常組織中的表達情況。

圖2利用MTT法檢測PCGEM1干擾/過表達對卵巢癌細胞增殖的影響。

圖3檢測PCGEM1干擾/過表達對卵巢癌細胞凋亡的影響。

圖4利用qRT-PCR檢測PCGEM1在子宮內膜癌及正常子宮內膜組織中的表達情況。

圖5利用MTT法檢測PCGEM1干擾/過表達對子宮內膜癌細胞增殖的影響。

圖6檢測PCGEM1干擾/過表達對子宮內膜癌細胞凋亡的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內容。在實施例中未作特殊說明的操作方法均為本技術領域常規(guī)操作方法。

實施例1。

一、Lnc RNA PCGEM1在卵巢癌病人及正常卵巢組織、子宮內膜癌及正常子宮內膜組織中的表達情況。

1、標本采集。

在患者知情的情況下，于術中采集卵巢癌及正常卵巢組織、子宮內膜癌及正常子宮內膜組織標本，生理鹽水清洗后，保存于液氮或-80℃超低溫冰箱中，備用；組織標本于2014年6 月-2015年6 月，在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術室，由陳醫(yī)生采集。

2、引物設計。

根據(jù)位置信息為chr1在UCSC ( Mar.2006 ) 中查找該長非編碼RNAEUlncRNA1的部分序列信息，并根據(jù)獲取的序列信息采用Primer Premier5 . 0設計了PCGEM1的引物PCR引物。

PCR檢測所用引物。

上游引物（SEQ.ID.NO.4）：CCACCCAATGCTAATGAAG。

下游引物（SEQ.ID.NO.5）：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。

3、應用qRT-PCR方法分別檢測PCGEM1在卵巢癌、正常卵巢組織及子宮內膜癌組織、正常子宮內膜組織的表達量。

3.1、收集的組織標本總RNA提取。

將收集正常卵巢組織、卵巢癌組織以及正常子宮內膜組織、子宮內膜組織標本用Trizol浸泡，以備提取總RNA；加入Trizol的1/5體積量的氯仿，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化后，室溫靜置5分鐘；4℃條件下，12,000g離心處理20分鐘，吸取上清液轉移至另一個新的離心管中，向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在30℃下靜置10分鐘；4℃條件下，12,000g離心處理20分鐘，棄去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下顛倒洗滌離心管管壁，4℃條件下12,000g離心處理10分鐘后，棄去乙醇，室溫干燥沉淀5-10分鐘，加入適量（10-20ul）的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度（定量RNA濃度1ug/ul， OD260/OD280 1.8-2.0之間表示RNA純度較高）。

3.2、逆轉錄合成cDNA。

采用 GoScript 反轉錄系統(tǒng)（A5000、A5001），按照以下操作步驟進行反轉錄得到的 cDNA：第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1μg/μl) 5μl。

Random Primers (0.5 μg /μl) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 μg/μl) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3μl。

第二步：將模板 RNA 與引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物進行 70℃、5 min 預變性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT -Mix，向每個樣品管加入 10 μl。

組分 反轉錄混合液 終濃度。

Nuclease-Free Water 1.6 μl 。

GoScript? 5X Reaction Buffer 4 μl 1X。

MgCl₂ (25 mM) 2 μl 2.5mM。

PCR Nucleotide Mix 1 μl 0.5mM。

Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl 20units。

GoScript? Reverse Transcriptase 1 μl。

第四步：設置反轉錄程序，包括退火、延伸、逆轉錄酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。程序完成后得到 cDNA。

3.3、Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反應混合液（反應液配置可在室溫進行），并分至各反應管，然后加入2ul模板。

組分 體積（20ul反應體系） 終濃度。

Nuclease-Free Water 7 μl。

上游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

下游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

GoTaq?qPCR Master Mix,2X 10ul 1X。

CXR 100X 0.2ul 1X。

（2）采用ABI PRISM?7500 Real-Time PCR System，兩步法進行PCR標準擴增程序。

（3）導出數(shù)據(jù)，Realtime PCR結果用2-△△CT法進行分析。利用Graphad Prism軟件分別繪制出卵巢癌和正常卵巢組織、子宮內膜癌及正常子宮內膜組織表達水平的圖表，結果如圖1和圖4；其中圖1表示lncRNA PCGEM1表達在上皮性卵巢癌中比在正常卵巢組織中顯著更高，^*P <0.05；圖4表示lncRNA PCGEM1表達在子宮內膜癌中比在正常子宮內膜組織中顯著增高。

以上說明lncRNA PCGEM1與卵巢癌、子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展相關。

二、體外細胞功能實驗。

1、卵巢癌細胞株A2780、OVCAR3購自中科院細胞庫，子宮內膜癌細胞株HEC-1B購自中科院細胞庫，細胞培養(yǎng)基DMEM/RPMI 1640和胎牛血清均購自HyClone公司，PCGEM1質粒表達載體購自蘇州吉瑪技術有限公司，siRNA干擾片段序列由上海SIGMA生物公司合成，RNA抽提試劑RNAiso Plus購自寶生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits購自Invitrogen公司，定量PCR試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix購自Invitrogen公司，PCGEM1基因和管家基因18S引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.1、細胞培養(yǎng)：卵巢癌和子宮內膜癌細胞用含10%的胎牛血清細胞培養(yǎng)基，于37℃，5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，利用PCGEM1基因RNA干擾和過表達質粒轉染卵巢癌細胞系A2780、OVCAR3和子宮內膜癌細胞系HEC-1B，按照lipo2000說明書分別將PCGEM1的siRNA及PCGEM1質粒轉入細胞中，進行培養(yǎng)。

2、過表達∕干擾效率檢測：轉染效率結果采用QRT-PCR檢測，干擾效率在50%以上，過表達效率在5倍以上。

2.1、過表達∕干擾PCGEM1后進行細胞增殖實驗（MTT）。

增殖實驗：選取細胞系中PCGEM1過表達∕干擾作為實驗組，轉染空載體的細胞作為對照組，進行細胞計數(shù)，將細胞種到96孔板中，每孔3000個細胞，加100ul培養(yǎng)液，分別于0，24，48，72小時加入20ul 5 mg/mL MTT溶液細胞培養(yǎng)箱孵育2-4小時后，在37℃孵育4小時，棄掉上清液，再加入150ul DMSO，使用分光光度計在490nm下測OD值,整理數(shù)據(jù)繪制成折線圖，見圖2和圖5。

2.1.1、過表達PCGEM1后的卵巢癌細胞系及子宮內膜癌細胞系細胞增殖實驗結果見圖2-1至圖2-4和圖5-1；其中圖2-1至圖2-2表示在卵巢癌A2780和OVCAR3細胞中轉染PCGEM1 質粒，其表達升高；圖2-3至圖2-4表示PCGEM1表達升高，細胞增殖能力顯著增強；其中圖5-1表示轉染PCGEM1質粒提高其在子宮內膜癌細胞中的表達水平。

可見，過表達PCGEM1基因后, 卵巢癌及子宮內膜癌細胞增殖能力增強。

2.1.2、PCGEM1干擾后的卵巢癌細胞系及子宮內膜癌細胞細胞增殖實驗結果見圖2-5至2-8和圖5-2至圖5-4，其中圖2-5至圖2-6表示卵巢癌細胞系轉染si- PCGEM1降低其表達；圖2-7至圖2-8表示沉默PCGEM1，細胞增殖能力明顯下降；圖5-2表示利用siRNA能夠沉默其表達；圖5-3表示PCGEM1表達增加，細胞增殖能力顯著提高；圖5-4表示沉默表達，細胞增殖能力受到抑制。

可見，干擾掉PCGEM1基因后,卵巢癌及子宮內膜癌細胞增殖能力下降。

2.2 、干擾∕過表達PCGEM1后細胞凋亡實驗。

實驗前將細胞在6cm盤培養(yǎng)，加入處理因素(PCGEM1基因RNA干擾或過表達質粒)轉染48小時后，進行實驗。細胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1500r離心處理5分鐘后收集細胞，預冷的PBS洗滌兩次，離心后，收集細胞約5×10 ⁵個，加入1×Binding Buffer，重懸細胞100ul，加入5μL Annexin V-FITC和5uL PI Staining Solution(干擾)或者5μL Annexin V-7AAD和5uL PE Staining Solution（高表達），輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘，再加入400μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻；樣品在1小時內流式細胞儀檢測。

2.2.1、過表達PCGEM1后的卵巢癌細胞系及子宮內膜癌細胞系細胞凋亡實驗結果，見圖3-1至3-2和圖6-1；其中圖3-1至圖3-2表示PCGEM1表達上升，卵巢癌細胞凋亡比例明顯下降；圖6-1表示在子宮內膜癌細胞系中，PCGEM1表達升高，細胞凋亡比例明顯下降。

可見，過表達PCGEM1基因后，卵巢癌及子宮內膜癌細胞凋亡能力減弱。

2.1.2、PCGEM1干擾后的卵巢癌細胞系及子宮內膜癌細胞系凋亡實驗結果見圖3-3至3-4和圖6-2；其中圖3-3至圖3-4表示利用siRNA沉默PCGEM1的表達，卵巢癌細胞系凋亡率增加顯著；圖6-2表示沉默PCGEM1顯著促進子宮內膜癌細胞凋亡。

可見，干擾掉PCGEM1基因后，卵巢癌及子宮內膜癌細胞凋亡能力增加。

序列表

＜110＞中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

＜120＞一種與卵巢癌和子宮內膜癌相關的長鏈非編碼RNA PCGEM1的siRNA和應用

＜160＞5

＜210＞1

＜211＞427

＜212＞DNA

＜213＞長鏈非編碼RNA PCGEM1的核苷酸序列

＜400＞1

tctagaaagg actagaaagt gtgaaatcta ttagtcttcg atatgaaatt ctctgtctct gtaaaagcat 70

ttcatattta caagacacag gcctactcct agggcagcaa aaagtggcaa caggcaagca gagggaaaag 140

agatcatgag gcatttcaga gtgcactgtc ttttcatata tttctcaatg ccgtatgttt ggttttattt 210

tggttgcatt ctgaaatgcc cttgttgcaa atattggtta tattgattaa atttacactt aatggaaaca 280

acctttaact taccagatga acaaacccac aaaagcaaaa aatcaaaagc cctacctttg atttcatatt 350

ttctgtgtaa ctggattaaa ggattcctgc ttgcttttgg gcataaatga taatggaata tttccaggta 420

ttctaga 427

＜210＞2

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物sense

＜400＞2

ggaaacaacc uuuaacuua 19

＜210＞3

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物antisense

＜400＞3

uaaguuaaag guuguuucc 19

＜210＞4

＜211＞19

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

ccacccaatg ctaatgaag 19

＜210＞5

＜211＞22

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞5

cgtcgccgtc cagctcgacc ag 22