本發(fā)明涉及蛋白制備領(lǐng)域，具體涉及一種通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)制備半胱氨酸蛋白酶的方法。

背景技術(shù)：

半胱氨酸蛋白酶最為一個重要的蛋白酶家族，廣泛地參與植物各種生理過程，例如，種子萌發(fā)、幼苗的發(fā)育、脅迫反應(yīng)、植物組織分化和衰老等過程。植物半胱氨酸蛋白酶主要屬于木瓜蛋白酶(C1A，papain-like cydteine proteinases)和豆類蛋白酶家族(C13 the legumains)，而對前者的研究最為詳細(xì)。木瓜蛋白酶很多都含有10-26個疏水氨基酸組成的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽。在酶前體中有一個35-150個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域，封閉了酶的活性位點(diǎn)，同時該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的正確折疊和定位也至關(guān)重要。

半胱氨酸蛋白酶參與了根瘤的發(fā)育、根瘤的脅迫反應(yīng)以及根瘤的衰老調(diào)節(jié)等，半胱氨酸蛋白酶在根瘤的衰老過程中發(fā)揮了重要作用，而在定型根瘤百脈根中沒有相關(guān)的研究結(jié)果。本發(fā)明找到了一個來源于百脈根并能調(diào)控根瘤衰老的蛋白酶，能夠增加固氮酶活，增大根瘤直徑，延遲衰老，最終植株生長茂盛。本發(fā)明在國內(nèi)外未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)制備半胱氨酸蛋白酶的方法，該無細(xì)胞蛋白合成表達(dá)系統(tǒng)無需制備mRNA且表達(dá)量高。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)制備半胱氨酸蛋白酶的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克?。?/p>

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脈根網(wǎng)站中進(jìn)行比對分析，找到百脈根中的同源克??；設(shè)計特異的引物從百脈根基因組中擴(kuò)增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以PCR方法分別引入雙酶切位點(diǎn)到該序列兩端；

步驟(2)：重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

將PCR擴(kuò)增得到的基因片段用內(nèi)切酶雙酶切，載體pET28a用同樣的內(nèi)切酶雙酶切，回收目的片段，然后用DNA連接酶連接載體和目的片段，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組子得到重組質(zhì)粒pET28a-AsNODf32；

步驟(3)：配制無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，所述表達(dá)體系包括如下成分：HEPES-KOH緩沖液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸鉀、醋酸銨、醋酸鎂、亞葉酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大腸桿菌抽提物；將步驟(2)中篩選得到的重組質(zhì)粒加入無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)。

步驟(4)：半胱氨酸蛋白酶沉淀處理：

用質(zhì)量濃度為0.5％～1.5％的弱去污劑溶液將半胱氨酸蛋白酶沉淀進(jìn)行重懸沉淀，加入少量還原劑離心震蕩至沉淀全部溶解，取上清，加入分散劑至終濃度為0.2％～2％，GSSG至終濃度1～5mM，GSSH至終濃度2～8mM，靜置12～18h；取出靜置后的蛋白，于TE緩沖液中透析，離心得到上清，即為最終的半胱氨酸蛋白酶溶液。

本發(fā)明的有益效果為：采用無細(xì)胞高效表達(dá)的蛋白后處理的過程，對無細(xì)胞大量表達(dá)的蛋白沉淀進(jìn)行先變性后復(fù)性的方法，制備出了免疫活性較好的半胱氨酸蛋白酶，克服了普通表達(dá)系統(tǒng)的低表達(dá)量和需要添加脂質(zhì)體才有活性的問題；該方法無需制備mRNA且表達(dá)量高，同時簡化后續(xù)純化步驟。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備的半胱氨酸蛋白酶的電泳圖；

圖2為實(shí)施例2制備的半胱氨酸蛋白酶的電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅是范例性的，僅用以對本發(fā)明的技術(shù)方案做更進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍內(nèi)，對技術(shù)方案進(jìn)行的修改或者替換均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)制備半胱氨酸蛋白酶的方法，包括以下步驟：

步驟(1)：半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克?。?/p>

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脈根網(wǎng)站中進(jìn)行比對分析，找到百脈根中的同源克?。辉O(shè)計特異的引物從百脈根基因組中擴(kuò)增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以PCR方法分別引入雙酶切位點(diǎn)到該序列兩端；

步驟(2)：重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

將PCR擴(kuò)增得到的基因片段用內(nèi)切酶雙酶切，載體pET28a用同樣的內(nèi)切酶雙酶切，回收目的片段，然后用DNA連接酶連接載體和目的片段，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組子得到重組質(zhì)粒pET28a-AsNODf32；

步驟(3)：配制無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，所述表達(dá)體系包括如下成分：HEPES-KOH緩沖液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸鉀、醋酸銨、醋酸鎂、亞葉酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大腸桿菌抽提物；將步驟(2)中篩選得到的重組質(zhì)粒加入無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)。

步驟(4)：半胱氨酸蛋白酶沉淀處理：

用質(zhì)量濃度為0.5％～1.5％的弱去污劑溶液將半胱氨酸蛋白酶沉淀進(jìn)行重懸沉淀，加入少量還原劑離心震蕩至沉淀全部溶解，取上清，加入分散劑至終濃度為0.2％～2％，GSSG至終濃度1～5mM，GSSH至終濃度2～8mM，靜置12～18h；取出靜置后的蛋白，于TE緩沖液中透析，離心得到上清，即為最終的半胱氨酸蛋白酶溶液。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述大腸桿菌抽提物是用S30緩沖液從大腸桿菌中提取的S30抽提物；所述S30緩沖液包括如下成分：

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，沉淀處理中添加的弱去污劑為SKL、Triton X2100、辛烷基葡糖苷、脫氧膽酸鹽、SDS、CTAB、吐溫20、NP-40等，優(yōu)選為質(zhì)量濃度為0.5％的SKL溶液。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，還原劑為DTT、DTE、GSH、β-巰基乙醇等，優(yōu)選為DTT。

實(shí)施例1

1.半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克隆

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脈根網(wǎng)站中進(jìn)行比對分析，找到百脈根中的同源克??；設(shè)計特異的引物從百脈根基因組中擴(kuò)增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以合成的DNA作為PCR模板，上游引物為5’-GATCGGATCCCTGCCGAAAGCGCCG-3’，下游引物為5’-ATG AAGCTTAATATCACGCACATAT-3’，分別引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸6min。

2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到的基因片段回收并用內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，載體pET28a同樣用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，回收大的片段。然后用T4 DNA連接酶連接載體和目的片段，以其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。利用LB氨芐青霉素卡那霉素平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子做菌落PCR，對有目的條帶的轉(zhuǎn)化子菌落提取重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶酶切進(jìn)一步鑒定，并送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，得到重組質(zhì)粒pET28a-AsNODf32。

3.配制無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，所述表達(dá)體系包括如下成分：57mM HEPES-KOH緩沖液、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸鉀、80mM醋酸銨、15mM醋酸鎂、34μg/mL亞葉酸、33μg/mL T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、占總重量2％的PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、占總重量24％的大腸桿菌抽提物；將重組質(zhì)粒pET28a-AsNODf32加入無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中，取300μL表達(dá)體系溶液于D-Tube^TM透析管中，并置于50mL離心管中，于30℃孵育過夜，離心，分離上清和沉淀，沉淀層即為半胱氨酸蛋白酶。其中，大腸桿菌抽提物是用S30緩沖液從大腸桿菌中提取的S30抽提物；所述S30緩沖液包括如下成分：

5.沉淀處理

沉淀用PBS重懸，離心，去掉上清，重復(fù)該步驟2次。用1mL0.5％SKL溶液重懸沉淀，加DTT到終濃度為5mM，30℃，220r，震蕩1h至沉淀全部溶解。離心，取上清。加入20％PEG 4000至終濃度為0.2％，50mM GSSG至終濃度1mM，100mM GSSH至終濃度2mM。離心管放置4℃，靜置12h。取出靜置后的蛋白，透析于TE緩沖液3天。透析期間TE緩沖液更換2次。離心，得到上清。即為最終的半胱氨酸蛋白酶溶液。圖1為實(shí)施例1制備的半胱氨酸蛋白酶的電泳圖。

實(shí)施例2

步驟1～4和實(shí)施例1步驟1～4相同，其中步驟5中沉淀處理如下：

沉淀用PBS重懸，離心，去掉上清，重復(fù)該步驟2次。用1mL1.5％SKL溶液重懸沉淀，加DTT到終濃度為5mM，30℃，220r，震蕩1h至沉淀全部溶解。離心，取上清。加入20％PEG 4000至終濃度為2％，50mM GSSG至終濃度5mM，100mM GSSH至終濃度8mM。離心管放置4℃，靜置12h。取出靜置后的蛋白，透析于TE緩沖液3天。透析期間TE緩沖液更換2次。離心，得到上清。即為最終的半胱氨酸蛋白酶溶液。圖2為實(shí)施例2制備的半胱氨酸蛋白酶的電泳圖。

<110> 武漢金開瑞生物工程有限公司

<120> 一種通過無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)制備半胱氨酸蛋白酶的方法

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 百脈根

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