本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法及其試劑盒。

背景技術：

環(huán)狀RNA(ciucular RNA,circRNA)是一種區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的RNA家族新成員，其為不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴且以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構的非編碼RNA分子。早在1980年，環(huán)狀RNA就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是在很長的一段時間內(nèi)，由于研究技術水平的限制，環(huán)狀RNA被認為是錯誤可變剪切而形成的副產(chǎn)品，屬于自然界中一種極罕見的現(xiàn)象，且甚至被當做遺傳意外或?qū)嶒炄藶橐蛩厮拢⑽匆饘W術界重視。隨著深度RNA測序和規(guī)模化生物信息技術的發(fā)展，研究者才發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)存在大量環(huán)狀RNA分子。2012年Salzman等人通過高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA廣泛存在人的轉(zhuǎn)錄組當中，從而引起人們對環(huán)狀RNA研究的興趣。2013年Hansen等人發(fā)現(xiàn)CDR1as/CiRS-7可以作為miR-7 sponge調(diào)控基因表達，證實了環(huán)狀RNA在人體內(nèi)的重要作用。最新研究表明環(huán)狀RNA具有閉合環(huán)狀結(jié)構，主要通過非典型可變剪切加工產(chǎn)生，廣泛存在于各種生物細胞中，具有結(jié)構穩(wěn)定，難以被RNA酶降解、表達豐度高、物種間保守性好，表達具有組織及時空特異性等特征。目前已有研究顯示環(huán)狀RNA跟神經(jīng)發(fā)育、動脈粥樣硬化、強直性肌營養(yǎng)不良、癌癥等疾病相關，并且在人唾液和血液中檢測到環(huán)狀RNA的存在，則表明環(huán)狀RNA可以在血液，尿液，腹水等臨床標本中穩(wěn)定存在，這些特征使得環(huán)狀RNA在新型疾病診斷與治療方法的開發(fā)應用上具有廣闊的前景。

CN 104388548 A公開了一種高通量環(huán)狀RNA測序的方法，其包括：人工合成外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA；對外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA進行質(zhì)量控制；將外源線性ERCC-0004-RNA和外源環(huán)狀ERCC-0013-RNA按等摩爾比混合，得到混合外源RNA；向待測序樣本的總RNA中加入混合外源RNA，得到第一混合物；去除第一混合物中的核糖體RNA，得到第二混合物；對第二混合物進行3’末端生物素標記，并去除標記上生物素的套索RNA及線性RNA，得到第三混合物；去除第三混合物中的線性RNA，得到第四混合物；對第四混合物進行標準的高通量轉(zhuǎn)錄組測序并對測序數(shù)據(jù)進行生物學分析。該方法步驟復雜，且需要預先合成外源RNA。

由于環(huán)狀RNA無法直接分離，故而迄今文獻中對于環(huán)狀RNA文庫構建并沒有一個標準的方法，大多數(shù)研究中采用去除rRNA并去除線性RNA，然后再構建用于高通量測序文庫的方法，也有一小部分研究是去除rRNA后直接建庫，或者去除線性RNA后直接建庫，還有極小一部分研究是采用去除PolyA+RNA后建庫的方法。這些方法存在rRNA去除不徹底，數(shù)據(jù)重復性差等缺點。因此，如何高效、穩(wěn)定地構建用于環(huán)狀RNA高通量測序的文庫，仍然是亟待解決的一個技術難題。

此外，目前市場上還沒有專門的環(huán)狀RNA建庫試劑盒，需要科研人員從QIAGEN、Illumina、Backman、NEB、Life technology等多家公司分別購買RNA提取、rRNA去除、線性RNA去除、文庫構建等產(chǎn)品，然后摸索合適的條件進行建庫。這種多家試劑組合建庫一方面價格昂貴，另一方面需要有較高實驗技能的科研人員花費較長的時間去摸索最佳實驗條件，嚴重限制了環(huán)狀RNA研究的進展，因此有必要開發(fā)一款能高效、穩(wěn)定地構建用于環(huán)狀RNA高通量測序文庫的專用試劑盒。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于上述問題，本發(fā)明發(fā)明人對環(huán)狀RNA測序進行反復研究和分析，開發(fā)出一種能夠高效穩(wěn)定地構建環(huán)狀RNA高通量測序文庫的方法，該方法rRNA殘留比例低，數(shù)據(jù)重復性較好，且該方法尤其適用于FFPE組織等RNA質(zhì)量差的樣品。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法，其依次包括以下步驟：

(S1)提取樣品中的總RNA；

(S2)去除樣品中的DNA；

(S3)檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量，確定RNA質(zhì)量符合要求；

(S4)去除rRNA；

(S5)去除線性RNA；

(S6)構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S1)中提取樣品中的總RNA是采用Trizol法進行的，該方法特別適用于組織和細胞樣品。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S2)中去除樣品中的DNA是采用DNase I消化法進行的。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S3)中檢測樣品中總的RNA質(zhì)量依次包括以下步驟：

(S31)利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度以及是否有污染；

(S32)利用紫外分光光度計檢測RNA的純度，即OD260/280比值；

(S33)檢測RNA的完整性。

更優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S33)中檢測RNA的完整性是利用Agilent 2100生物分析儀進行的。

在本發(fā)明中，OD(optical density)表示被檢測物質(zhì)吸收掉的光密度，OD260/280比值是指在波長260nm和280nm處的吸光光度比值，用于判斷RNA的純度。理論上，在純RNA的情況下OD260/280比值為2，其中OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白質(zhì)的吸光度。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S4)中去除rRNA是采用RNase H消化法進行的。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S4)去除rRNA依次包括以下步驟：

(S41)將與rRNA序列互補的DNA探針等質(zhì)量混合，形成DNA探針庫；

(S42)將所獲得DNA探針庫與經(jīng)過檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量確定RNA質(zhì)量符合要求的RNA混合雜交，形成DNA-RNA雜交物；

(S43)用RNase H消化所獲得的DNA-RNA雜交物；

(S44)用DNase I消化DNA探針，獲得rRNA耗竭的RNA；

(S45)通過熒光計測定rRNA耗竭的RNA的濃度。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S42)中所用的DNA探針庫與RNA的重量比為(1-2)：1，優(yōu)選1:1。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S42)中混合雜交所采用的條件為在95℃的溫度下雜交2分鐘，然后以0.1℃/s的速度將溫度緩慢地降低至45℃。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S43)中用RNase H消化所獲得的DNA-RNA雜交物所采用的條件為在37℃的溫度下消化30分鐘。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S45)中測定rRNA耗竭的RNA的濃度所采用的熒光計是通過Qubit熒光計進行的。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S5)中去除線性RNA是采用RNase R消化法進行的，其中RNase R與RNA的用量比為(2.5-3.5)U:1ug，優(yōu)選3:1，即每1微克RNA中加入3個活性單位(U)的RNase R。

更優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S5)中去除線性RNA所采用的RNase R消化法的消化條件為在35-45℃，優(yōu)選37℃的溫度下消化20-40分鐘，優(yōu)選30分鐘。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S6)中構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫是采用dUTP法進行的。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S6)中構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫依次包括以下步驟：

(S61)RNA片段化；

(S62)第一鏈合成：采用逆轉(zhuǎn)錄酶加隨機引物的方法進行；

(S63)第二鏈合成：利用RNase H消化RNA/cDNA雜交物中的RNA鏈，然后通過DNA聚合酶I合成第二條鏈；

(S64)末端修復：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基團；

(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；

(S66)Y型Adapter連接：利用T4 DNA Ligase連接Adapter和加了A尾的dsDNA；

(S67)第二鏈消化和文庫擴增：利用UNG酶消化第二鏈；

(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S61)中RNA片段化的條件為在90-96℃，優(yōu)選94℃的溫度下片段化3-6分鐘，優(yōu)選5分鐘。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S61)中RNA片段化后的峰值位于300-350bp。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S62)第一鏈合成利用放線菌素D抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的依賴DNA的DNA聚合酶活性，以保留鏈的方向性信息。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S66)Y型Adapter連接中Adapter末端采用硫代磷酸酯鍵連接T，以防止形成Adapter二聚體，進一步優(yōu)選地，連接產(chǎn)物純化采用1×beads純化一次后，0.7×/0.2×beads進行片段大小篩選，以選擇合適的大小的片段。

優(yōu)選地，在所述環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法中，所述步驟(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫依次包括以下步驟：

(S681)檢測文庫濃度；

(S682)采用Agilent 2100檢測文庫質(zhì)量；

(S683)根據(jù)文庫濃度，將不同的標引文庫混合，準備上機測序。

與常規(guī)方法相比，本發(fā)明所提供的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法高效、穩(wěn)定，rRNA殘留比例低，環(huán)狀RNA檢出效率高，數(shù)據(jù)重復性較好，測序結(jié)果驗證成功率高，尤其適用于FFPE組織等RNA質(zhì)量差的樣品。

此外，本發(fā)明還提供一種環(huán)狀RNA高通量測序文庫構建的試劑盒，其包括：

(1)環(huán)狀RNA富集試劑、DNase I、RNase H、RNaseR；

(2)種屬特異的DNA探針；

(3)文庫構建所需的各種酶：DNA聚合酶I、Large(Klenow)Fragment、T4 Polynucleotide Kinase(T4 PNK)、Klenow Fragment、Escherichia coli UDG、T4 DNA Ligase(Rapid)、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；

(4)磁珠、dNTP、Nuclease Free Water、dUTP、接頭、引物等，

其中，所述種屬特異的DNA探針能與相應物種的rRNA序列互補。

本發(fā)明所提供的環(huán)狀RNA高通量測序文庫構建試劑盒操作簡單，條件優(yōu)化，成本低，是環(huán)狀RNA研究的一個有力工具。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

(1)本發(fā)明環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法因為建立了種屬特異的DNA探針庫，采用RNaseH去除與探針結(jié)合的rRNA，并采用RNaseR進一步富集環(huán)狀RNA，所以rRNA殘留比例低，環(huán)狀RNA檢出效率高，數(shù)據(jù)重復性較好，測序結(jié)果驗證成功率高，尤其適用于FFPE組織等RNA質(zhì)量差的樣品；

(2)本發(fā)明環(huán)狀RNA高通量測序文庫構建試劑盒操作簡單，條件優(yōu)化，成本低，是環(huán)狀RNA研究的一個有力工具。

附圖說明

圖1為本發(fā)明環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法的一種實施方式的流程圖；

圖2-1為本發(fā)明實施例1細胞樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的建庫完成后利用Agilent 2100對文庫進行質(zhì)檢的結(jié)果；

圖2-2為本發(fā)明實施例2新鮮肝癌組織樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的建庫完成后利用Agilent 2100對文庫進行質(zhì)檢的結(jié)果；

圖2-3為本發(fā)明實施例3FFPE樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的建庫完成后利用Agilent 2100對文庫進行質(zhì)檢的結(jié)果；

圖3為實施例1細胞樣本測序完成后挑選20個環(huán)狀RNA進行QPCR驗證的結(jié)果。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步地詳細描述。

具體地，如圖1所示，本發(fā)明實施例提供一種環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法，其依次包括以下步驟：

S1，提取樣品中的總RNA；

提取樣品中的總RNA是采用Trizol法進行的，該方法特別適用于組織和細胞樣品。

S2，去除樣品中的DNA。

優(yōu)選地，去除樣品中的DNA是采用DNase I消化法進行的。

S3，檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量，確定RNA質(zhì)量符合要求。

優(yōu)選地，檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量依次包括以下步驟：

(S31)利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度以及是否有污染；

(S32)利用紫外分光光度計檢測RNA的純度，即OD260/280比值；

(S33)檢測RNA的完整性。

所述步驟(S33)中檢測RNA的完整性是利用Agilent 2100生物分析儀進行的。

S4，去除rRNA。

去除rRNA是采用RNase H消化法進行的。

RNase H消化法去除rRNA依次包括以下步驟：

(S41)將與rRNA序列互補的DNA探針等質(zhì)量混合，形成DNA探針庫；

(S42)將所獲得DNA探針庫與經(jīng)過檢測并評定樣品中總的RNA質(zhì)量確定RNA質(zhì)量符合要求的RNA混合雜交，形成DNA-RNA雜交物；

(S43)用RNase H消化所獲得的DNA-RNA雜交物；

(S44)用DNase I消化DNA探針，獲得rRNA耗竭的RNA；

(S45)通過熒光計測定rRNA耗竭的RNA的濃度。

所述步驟(S42)中所用的DNA探針庫與RNA的質(zhì)量比為(1-2)：1，優(yōu)選1:1。

所述步驟(S42)中混合雜交所采用的條件為在95℃的溫度下雜交2分鐘，然后以0.1℃/s的速度將溫度緩慢地降低至45℃，45℃保溫5分鐘。

所述步驟(S43)中用RNase H消化所獲得的DNA-RNA雜交物所采用的條件為在37℃的溫度下消化30分鐘。

所述步驟(S45)中測定rRNA耗竭的RNA的濃度所采用的熒光計是通過Qubit熒光計進行的。

所述步驟(S45)中得到的產(chǎn)物進一步用安捷倫2100儀器檢測證實已看不到18S，28S rRNA存在的典型峰圖。

S5，去除線性RNA。

去除線性RNA是采用RNase R消化法進行的，其中RNase R與RNA的用量比為(2.5-3.5)U:1ug，優(yōu)選3:1，即每1微克RNA中加入3個活性單位(U)的RNase R。

去除線性RNA所采用的RNase R消化法的消化條件為在35-45℃，優(yōu)選37℃的溫度下消化20-40分鐘，優(yōu)選30分鐘。

S6，構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫。

構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫是采用dUTP法進行的。

dUTP法構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫依次包括以下步驟：

(S61)RNA片段化；

(S62)第一鏈合成：采用逆轉(zhuǎn)錄酶加隨機引物的方法進行，原料為dNTPs(dA,dC,dG和dT各25mM)；

(S63)第二鏈合成：利用RNase H消化RNA/cDNA雜交物中的RNA鏈，然后通過DNA聚合酶I合成第二條鏈，原料為dUTP mix(10mM dA,dC,dG and 20mM dU)；

(S64)末端修復：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基團；

(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；

(S66)Y型Adapter連接：利用T4 DNA Ligase連接Adapter和加了A尾的dsDNA；

(S67)第二鏈消化和文庫擴增：利用UNG酶消化第二鏈；

(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫。

所述步驟(S61)中RNA片段化的條件為在90-96℃，優(yōu)選94℃的溫度下片段化3-6分鐘，優(yōu)選5分鐘。

所述步驟(S61)中RNA片段化后的峰值位于300-350bp。

所述步驟(S62)第一鏈合成利用放線菌素D抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的依賴DNA的DNA聚合酶活性，以保留鏈的方向性信息。

所述步驟(S66)Y型Adapter連接中Adapter末端采用硫代磷酸酯鍵連接T，以防止形成Adapter二聚體，進一步優(yōu)選地，連接產(chǎn)物純化采用1×beads純化一次后，0.7×/0.2×beads進行片段大小篩選，以選擇合適的大小的片段。

所述步驟(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫包括以下步驟：

(S681)Qubit熒光計檢測文庫濃度；

(S682)采用Agilent 2100檢測文庫質(zhì)量；

(S683)根據(jù)文庫濃度，將不同的標引文庫混合，準備上機測序。

與常規(guī)方法相比，本發(fā)明所提供的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建方法高效、穩(wěn)定，rRNA殘留比例低，環(huán)狀RNA檢出效率高，數(shù)據(jù)重復性較好，測序結(jié)果驗證成功率高，尤其適用于FFPE組織等RNA質(zhì)量差的樣品。

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加簡潔明了，本發(fā)明將用以下具體實施例進行闡明，但本發(fā)明絕非僅限于這些實施例。以下實施例僅為本發(fā)明較優(yōu)選的實施例，且僅用于闡述本發(fā)明，不能理解為對本發(fā)明的范圍的限制。應當指出的是，凡在本發(fā)明的實質(zhì)和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

實施例1細胞樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建

(S1)細胞樣品中的總RNA的提取

取細胞樣品1×10⁷個，在4℃下用PBS洗一次，然后向6孔板每個孔中加入1mL Trizol，并用1mL槍頭反復吹打10次。將樣品收集到EP管內(nèi)，加入200μL氯仿，上下顛倒混勻30s后靜置3min。隨后再在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心15min，溶液裂解液分三層，其中上層為溶于水相的RNA。取上層溶液并向其中加入等體積的異丙醇，混勻并4℃靜置10min。之后再次在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min并移除上清液。隨后在沉淀中加入1mL 75％乙醇并上下顛倒混勻重懸沉淀。然后還在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min并移除上清，保留沉淀。然后將沉淀在室溫下干燥15min直至管壁無液體。隨后加入25μL DEPC H₂O溶解RNA，以獲得RNA溶液。

(S2)去除細胞樣品中的DNA

配制如下所示的實驗體系：

然后將上述實驗體系在室溫下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并渦旋混勻15s，隨后靜置10min以使DNase I失活。其后加入250μL無水乙醇并渦旋混勻15s，隨后進行短暫離心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子純化RNA，并使用25μL DEPC H₂O進行洗脫，得到去除DNA后的RNA樣品。

(S3)檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量，確定RNA質(zhì)量符合要求

利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測去除DNA后的RNA樣品中的RNA降解程度并確定是否有污染，結(jié)果顯示該樣品無污染且RNA降解程度小。隨后利用紫外分光光度計檢測RNA的純度，其中OD260/280比值為1.95，純度較高。之后再通過Agilent 2100生物分析儀分析RNA的完整性，顯示RNA完整性很好，RIN值為9.2。

(S4)去除rRNA

設計195條與細胞中的rRNA序列互補的50bp DNA探針等質(zhì)量混合在一起，形成DNA探針庫，然后配制如下所示的實驗體系：

DNA探針庫 5μg

去除DNA后的RNA樣品 5μg

5×hybridization buffer 5μL(其成分為1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.4)；

補DEPC水至25μL。

將上述實驗體系在95℃下混合兩分鐘，然后以0.1℃/s的速度將實驗體系的溫度降低至45℃，形成DNA-RNA雜交物。隨后將10μL RNase H(5U/μL)和5μL已預熱至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分為：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl₂，100mM DTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA雜交物中。然后在37℃的溫度下消化與DNA雜交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XPbeads進行純化。之后向反應體系中加入5μL Turbo DNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的條件下消化DNA探針30min。隨后使用2.2×RNA Clean XP beads進行純化，得到rRNA耗竭的RNA，同時用Qubit熒光計測定rRNA耗竭的RNA濃度，結(jié)果顯示濃度為21.78ng/μL。

(S5)去除線性RNA

配制如下所示的實驗體系：

將上述體系置于37℃水浴中消化30min，獲得線性RNA去除的RNA，同時用Qubit熒光計測定其濃度，結(jié)果顯示濃度為4.60ng/μL。

(S6)構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫

(S61)RNA片段化

配制如下所示的實驗體系：

5×First Strand Buffer 8μL

線性RNA去除的RNA 10μL

Nuclease free H₂O 2μL；

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。

(S62)第一鏈合成：

配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H₂O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。隨后將反應體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：25℃10min；42℃50min；70℃15min；4℃Hold。之后加入38μL RNA Clean XP和19μL 100％ethanol進行純化，并使用16μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，獲得RNA/cDNA雜交物，同時轉(zhuǎn)移至新管中。

(S63)第二鏈合成

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系在16℃下孵育2.5h。隨后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇進行純化并用32μL Qiagen EB進行洗脫，得到dsDNA。

(S64)末端修復

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下保持30min。隨后加入28μL RNA Clean XP和14μL乙醇進行并用17μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，得到末端修復后的dsDNA。

(S65)加A尾

配制如下所示的實驗體系：

然后在37℃下孵育30min。隨后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇進行純化并用10μL Nuclease Free H₂O洗脫，得到加了A尾的dsDNA。

(S66)Y型Adapter連接：

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下孵育20min，隨后與24μL“12P XP”beads混合并在室溫下孵育6min，之后保留上清液并將其與12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室溫下孵育6min，隨后用10μL Nuclease Free H₂O洗脫兩次，得到洗脫液，之后將洗脫液與12μL AMPure XP混合，再次在室溫下孵育6min，然后使用30μL Qiagen EB洗脫1次，得到產(chǎn)物。

(S67)第二鏈消化和文庫擴增

將15μL上述產(chǎn)物與1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系近PCR擴增，循環(huán)條件為：94℃30s；(98℃10s；65℃30s；72℃30s)循環(huán)15個循環(huán)；72℃5min；然后將實驗體系的溫度保持在4℃。隨后加入43μL AMPure XP beads進行純化并利用12μL Qiagen EB進行洗脫，得到文庫。

(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫

先用Qubit熒光計檢測文庫濃度，結(jié)果為4.06ng/μL。然后使用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫質(zhì)量，檢測結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示插入片段大小合格，峰型單一，峰值在200-500bp左右。隨后根據(jù)檢測濃度，將不同的標引文庫混合。用Qubit熒光計檢測文庫濃度后開始續(xù)上機測序工作。

實施例2新鮮肝癌組織樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建

(S1)新鮮肝癌組織樣品中的總RNA的提取

取新鮮肝癌組織樣品50g，在4℃下用PBS洗一次，并剪碎組織。隨后加入1mL Trizol，并用手提式高速分散器勻漿15次。之后將樣品收集到EP管內(nèi)并加入200μL氯仿，上下顛倒混勻30s后靜置3min。隨后再在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心15min，溶液裂解液分三層，其中上層為溶于水相的RNA。取上層溶液并向其中加入等體積的異丙醇，混勻并靜置10min。之后再次在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min并移除上清液。隨后在沉淀中加入1mL 75％乙醇并上下顛倒混勻重懸沉淀。然后還在4℃的溫度和12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min并移除上清，保留沉淀。然后將沉淀在室溫下干燥15min直至管壁無液體。隨后加入30μL DEPC H₂O溶解RNA，以獲得RNA溶液。

(S2)去除新鮮組織樣品中的DNA

配制如下所示的實驗體系：

然后將上述實驗體系在室溫下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并渦旋混勻15s，隨后靜置10min以使DNase I失活。其后加入250μL無水乙醇并渦旋混勻15s，隨后進行離心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子純化RNA，并使用25μL DEPC H₂O進行洗脫，得到去除DNA后的RNA樣品。

(S3)檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量，確定RNA質(zhì)量符合要求

利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測去除DNA后的RNA樣品中的RNA降解程度并確定是否有污染，結(jié)果顯示該樣品無污染且RNA降解程度較小。隨后利用紫外分光光度計檢測RNA的純度，其中OD260/280比值為2.05，純度較高。之后再通過Agilent 2100生物分析儀分析RNA的完整性，顯示RNA完整性較好，RIN為7.1。

(S4)去除rRNA

設計195條與新鮮組織中的rRNA序列互補的50bp DNA探針等質(zhì)量混合在一起，形成DNA探針庫，然后配制如下所示的實驗體系：

DNA探針庫 5μg

去除DNA后的RNA樣品 5μg

5×hybridization buffer 5μL(其成分為1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH7.4)

補DEPC水至25μL。

將上述實驗體系在95℃下混合兩分鐘，然后以0.1℃/s的速度將實驗體系的溫度降低至45℃，形成DNA-RNA雜交物。隨后將10μL RNase H(5U/μL)和5μL已預熱至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分為：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl₂，100mM DTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA雜交物中。然后在37℃的溫度下消化與DNA雜交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XP beads進行純化。之后向反應體系中加入5μL Turbo DNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的條件下消化DNA探針30min。隨后使用2.2×RNA Clean XP beads進行純化，得到rRNA耗竭的RNA，同時用Qubit熒光計測定rRNA耗竭的RNA濃度，結(jié)果顯示濃度為24.8ng/μL。

(S5)去除線性RNA

配制如下所示的實驗體系：

將上述體系置于37℃水浴中消化30min，獲得線性RNA去除的RNA，同時用Qubit熒光計測定其濃度，結(jié)果顯示濃度為8.2ng/μL。

(S6)構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫

(S61)RNA片段化

配制如下所示的實驗體系：

5×First Strand Buffer 8μL

線性RNA去除的RNA 10μL

Nuclease free H₂O 2μL；

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。

(S62)第一鏈合成：

配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H₂O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。隨后將反應體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：25℃10min；-42℃50min；-70℃15min；-4℃Hold。之后加入38μL RNA Clean XP和19μL 100％ethanol進行純化，并使用16μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，獲得RNA/cDNA雜交物，同時轉(zhuǎn)移至新管中。

(S63)第二鏈合成

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系在16℃下孵育2.5h。隨后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇進行純化并用32μL Qiagen EB進行洗脫，得到dsDNA。

(S64)末端修復

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下保持30min。隨后加入28μL RNA Clean XP和14μL乙醇進行并用17μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，得到末端修復后的dsDNA。

(S65)加A尾

配制如下所示的實驗體系：

然后在37℃下孵育30min。隨后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇進行純化并用10μL Nuclease Free H₂O洗脫，得到加了A尾的dsDNA。

(S66)Y型Adapter連接：

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下孵育20min，隨后與24μL“12P XP”beads混合并在室溫下孵育6min，之后保留上清液并將其與12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室溫下孵育6min，隨后用10μL Nuclease Free H₂O洗脫兩次，得到洗脫液，之后將洗脫液與12μL AMPure XP混合，再次在室溫下孵育6min，然后使用30μL Qiagen EB洗脫1次，得到產(chǎn)物。

(S67)第二鏈消化和文庫擴增

將15μL上述產(chǎn)物與1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系近PCR擴增，循環(huán)條件為：94℃30s；(-98℃10s；-65℃30s；-72℃30s)循環(huán)15個循環(huán)；-72℃5min；然后將實驗體系的溫度保持在-4℃。隨后加入43μL AMPure XP beads進行純化并利用12μL Qiagen EB進行洗脫，得到文庫。

(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫

先用Qubit熒光計檢測文庫濃度，結(jié)果為5.16。然后使用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫質(zhì)量，檢測結(jié)果見圖2，插入片段大小合格，峰型單一，峰值在200-500bp左右。隨后根據(jù)檢測濃度，將不同的標引文庫混合。用Qubit熒光計檢測文庫濃度后開始上機測序工作。

實施例3 FFPE樣品中的環(huán)狀RNA高通量測序文庫的構建

(S1)FFPE樣品中的總RNA的提取

取FFPE樣品切片成8μm厚的片狀，立即轉(zhuǎn)移7片切片至1.5mL離心管。然后加入1mL二甲苯并劇烈渦旋30s，并在14000rpm的轉(zhuǎn)速下離心2min。之后加入1mL乙醇至樣品中并渦旋混勻30s，再在14000rpm的轉(zhuǎn)速下離心2min，移除上清，保留沉淀。在37℃的溫度下干燥15min以去除乙醇。隨后向沉淀中加入200μL裂解液和20μl Proteinase K并渦旋混勻。其后在55℃的溫度下水浴15min，之后在80℃的溫度下水浴15min。低速短暫離心后加入200μL緩沖液至樣品中并渦旋混勻20s。隨后加入600μL無水乙醇至樣品中并渦旋混勻20s。之后轉(zhuǎn)移混合液至吸附柱中，并在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心50s，倒棄流出液，把柱子裝在收集管中。隨后加入500μL漂洗液至柱子中，再在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心50s，倒棄流出液，把柱子裝在收集管中。其后再加入500μL漂洗液至柱子中，再在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心50s。倒棄流出液，把柱子裝在收集管中。隨后在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心3min，以甩干柱子的基質(zhì)，并將柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。隨后加入30μL DEPC水至柱子的膜中央并靜置2min，然后在13000rpm的轉(zhuǎn)速下離心1min以獲得RNA溶液。

(S2)去除FFPE樣品中的DNA

配制如下所示的實驗體系：

然后將上述實驗體系在室溫下孵育30min，之后加入300μL Buffer RP并渦旋混勻15s，隨后靜置10min以使DNase I失活。其后加入250μL無水乙醇并渦旋混勻15s，隨后進行離心以去除管壁上的液滴。然后使用Hipure RNA柱子純化RNA，并使用25μL DEPC H₂O進行洗脫，得到去除DNA后的RNA樣品。

(S3)檢測并評定樣品中的總RNA質(zhì)量，確定RNA質(zhì)量符合要求

利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測去除DNA后的RNA樣品中的RNA降解程度并確定是否有污染，結(jié)果顯示該樣品RNA明顯降解。隨后利用紫外分光光度計檢測RNA的純度，其中OD260/280比值為2.37。之后再通過Agilent 2100生物分析儀分析RNA的完整性，顯示RNA完整性很差，RIN值為4.5。

(S4)去除rRNA

設計195條與FFPE樣本中的rRNA序列互補的50bp DNA探針等質(zhì)量混合在一起，形成DNA探針庫，然后配制如下所示的實驗體系：

DNA探針庫 5μg

去除DNA后的RNA樣品 5μg

5×hybridization buffer 5μL(其成分為1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH 7.4)

補DEPC水至25μL。

將上述實驗體系在95℃下混合兩分鐘，然后以0.1℃/s的速度將實驗體系的溫度降低至45℃，形成DNA-RNA雜交物。隨后將10μL RNase H(5U/μL)和5μL已預熱至37℃的10×RNase H Reaction Buffer(其成分為：500mM Tris-HCl，750mM KCL，30mM MgCl₂，100mM DTT，pH＝8.3)和5μL DEPC水加入至DNA-RNA雜交物中。然后在37℃的溫度下消化與DNA雜交的RNA 30min并使用2.2×RNA Clean XP beads進行純化。之后向反應體系中加入5μL Turbo DNaseⅠ(2U/μL)并在37℃的條件下消化DNA探針30min。隨后使用2.2×RNA Clean XP beads進行純化，得到rRNA耗竭的RNA，同時用Qubit熒光計測定rRNA耗竭的RNA濃度，結(jié)果顯示濃度為19.9ng/μL。

(S5)去除線性RNA

配制如下所示的實驗體系：

將上述體系置于37℃水浴中消化30min，獲得線性RNA去除的RNA，同時用Qubit熒光計測定其濃度，結(jié)果顯示濃度為3.25ng/μL。

(S6)構建用于高通量測序的環(huán)狀RNA文庫

(S61)RNA片段化

配制如下所示的實驗體系：

5×First Strand Buffer 8μL

線性RNA去除的RNA 10μL

Nuclease free H₂O 2μL；

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：94℃5min，然后立刻置于冰上，得到片段化后的RNA。

(S62)第一鏈合成：

配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：65℃3min，然后置于冰上，并加入4μL Nuclease free H₂O、1μL 100mM DTT、0.1μL 25mM dNTPs、0.5μL SupeRase-In、0.5μL M-MulVReverse Transcriptase和4μg Actinomycin D。隨后將反應體系放入PCR儀中孵育，所述PCR儀的程序為：25℃10min；-42℃50min；-70℃15min；-4℃Hold。之后加入38μL RNA Clean XP和19μL 100％ethanol進行純化，并使用16μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，獲得RNA/cDNA雜交物，同時轉(zhuǎn)移至新管中，。

(S63)第二鏈合成

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系在16℃下孵育2.5h。隨后加入38μL RNA Clean XP和19μL乙醇進行純化并用32μL Qiagen EB進行洗脫，得到dsDNA。

(S64)末端修復

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下保持30min。隨后加入28μL RNA Clean XP和14μL乙醇進行并用17μL Nuclease Free H₂O進行洗脫，得到末端修復后的dsDNA。

(S65)加A尾

配制如下所示的實驗體系：

然后在37℃下孵育30min。隨后加入28μL AMPure XP beads和14μL乙醇進行純化并用10μL Nuclease Free H₂O洗脫，得到加了A尾的dsDNA。

(S66)Y型Adapter連接：

在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系放入PCR儀中并在20℃下孵育20min，隨后與24μL“12P XP”beads混合并在室溫下孵育6min，之后保留上清液并將其與12μL AMPure XP beads和5μL 40wt％PEG8000混合，再在室溫下孵育6min，隨后用10μL Nuclease Free H₂O洗脫兩次，得到洗脫液，之后將洗脫液與12μL AMPure XP混合，再次在室溫下孵育6min，然后使用30μL Qiagen EB洗脫1次，得到產(chǎn)物。

(S67)第二鏈消化和文庫擴增

將15μL上述產(chǎn)物與1μL Uracil DNA Glycosylase混合并在37℃下孵育30min，得到UNG digested DNA。然后在0℃下配制如下所示的實驗體系：

將上述實驗體系近PCR擴增，循環(huán)條件為：94℃30s；(98℃10s；65℃30s；72℃30s)循環(huán)15個循環(huán)；72℃5min；然后將實驗體系的溫度保持在4℃。隨后加入43μL AMPure XP beads進行純化并利用12μL Qiagen EB進行洗脫，得到文庫。

(S68)質(zhì)檢及準備標引文庫

先用Qubit熒光計檢測文庫濃度，結(jié)果為5.24ng/μL。然后使用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫質(zhì)量，檢測結(jié)果見圖2，插入片段大小合格，峰型單一，峰值在200-500bp左右。隨后根據(jù)檢測濃度，將不同的標引文庫混合。用Qubit熒光計檢測文庫濃度后開始續(xù)上機測序工作。

測序?qū)嵤├镄畔W分析測序數(shù)據(jù)

將實施例1-3構建的環(huán)狀RNA高通量測序文庫及文獻報道方法(參見Molecular Cell 56,55–66,October 2,2014)構建的環(huán)狀RNA高通量測序文庫在Illumina測序平臺進行測序。結(jié)果示于表1中。

表1本發(fā)明方法與文獻報道方法測序結(jié)果生物信息學分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學分析之后的結(jié)果見表1，對比之下，本發(fā)明實施例提供的方法能夠?qū)悠分械膔RNA進一步去除，數(shù)據(jù)中rRNA殘留比例<0.1％，而文獻報道方法中rRNA殘留為5％，對于FFPE等降解嚴重的RNA樣品更是高達37％，嚴重浪費數(shù)據(jù)量，本發(fā)明方法使得環(huán)狀RNA的有效測序數(shù)據(jù)量顯著提高。在環(huán)狀RNA檢測數(shù)量方面，RNA完整性好的樣品(細胞樣品)用文獻報道方法檢出的環(huán)狀RNA較多，但是RNA質(zhì)量差的樣品，尤其是FFPE樣品本發(fā)明方法顯著優(yōu)于文獻報道方法。此外，使用本發(fā)明方法進行環(huán)狀RNA高通量測序文庫構建，有標準的操作流程，條件優(yōu)化，結(jié)果穩(wěn)定，成本僅為文獻報道方法的1/3。從測序結(jié)果中隨機挑選20個環(huán)狀RNA進行QPCR驗證，驗證結(jié)果陽性率100％(圖3)，有力證實了本發(fā)明方法的可靠性。

由此可證明本發(fā)明實施例所用的方法能顯著的將樣品中的環(huán)狀RNA進一步富集，大幅度降低環(huán)狀RNA測序數(shù)據(jù)量，降低成本，減少人力物力的浪費。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導，本發(fā)明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對發(fā)明的一些修改和變更也應當落入本發(fā)明的權利要求的保護范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構成任何限制。