專利名稱：：能夠調(diào)控植物分化/生長的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于植物分化和生長的調(diào)節(jié)基因以及利用這些基因調(diào)節(jié)植物分化和生長的方法。對植物分化和生長的調(diào)節(jié)可以應(yīng)用于植物育種等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：赤霉素(GA)是四環(huán)雙砲類的植物激素家族，它們是植物的不同發(fā)育過程(包括生長、開花、和結(jié)果)所必需的化合物(非專利文件1)。具體地，通過調(diào)節(jié)GA的活性可以調(diào)控不同植物的生長和分化。例如，農(nóng)作物產(chǎn)量的變化很大程度上取決于植物的類型，因此通過調(diào)節(jié)GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來改良植物類型可以增加農(nóng)作物產(chǎn)量。但是，至今為止還不知道植物是如何感知(perception)GA、如何傳導(dǎo)GA信號以及如何通過GA調(diào)節(jié)誘導(dǎo)植物生長。最近，本發(fā)明人已經(jīng)分離出水稻中兩種類型的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體。一種是組成型GA應(yīng)答突變體^e^^。'ce/GW)(非專利文件2和3);另一種是GA不敏感型矮小突變體^4-i"化"W/ve^ww^2(非專利文件4)。5ZJ7基因編碼一種蛋白質(zhì)，預(yù)計(jì)其為與擬南芥GAI(非專利文件5)和RGA(非專利文件6)、小麥Rht、玉米d8、和大麥SLN1(非專利文件7)定向進(jìn)化同源的轉(zhuǎn)錄因子。所有這些蛋白(包括上述擬南芥GAI及其后所提到的蛋白質(zhì))都被分組到GRAS家族的DELLA亞家族(非專利文件8)。G/D2基因編碼預(yù)計(jì)為SCFE3泛素連接酶的F-box亞基的蛋白質(zhì)，其與擬南芥SLY(非專利文件9)定向進(jìn)化同源。對這些突變體的分析已經(jīng)預(yù)測出水稻SLR1蛋白(GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻抑蛋白)是通過SCF^m-蛋白體途徑來降解的，該途徑誘導(dǎo)了GA的下游作用(非專利文件8)。但是，與DELLA蛋白所調(diào)節(jié)的過程相比較，我們對GA感知過程的了解還很少。至今為止，有一些經(jīng)生物化學(xué)方法研究GA結(jié)合蛋白的報(bào)道(非專利文件10和11)。但是，還沒有鑒定出直接參與GA感知的蛋白質(zhì)。非專利文件1:Davies,P.J"PlantHormones(KluwerAcademic,Dordrecht,Netherlands,1995)。非專利文件2:Ikeda，A."a/.，PlantCell.13，999-1010(2001)非專利文件3:Itoh，H.Wa/.，PlantCell14,57-70(2002)非專利文件4:Sasaki,A.Science299,1896-1898(2003)非專利文件5:Peng,J."a/.,GenesDev.11，3194-3205(1997)非專利文件6:Silverstone,A.L."a/.,PlantCell2,155-169(1998)非專利文件7:Gubler,F."a/.，PlantPhysiol.129，191-200(2002)非專利文件8:Itoh，H.""/.，TrendsPlantSci.8，492-497(2003)非專利文件9:McGinnis,K.M.a/.，PlantCell.15,1120-1130(2003)非專利文件10:Lovegrove，A."a/"PlantJ.15,311-320(1998)非專利文件11:Nakajima，M.a/"Biochem.Biophys.Res.Comm.241,782-786(1997)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明欲解決的問題本發(fā)明提供了參與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的赤霉素結(jié)合蛋白以及編碼所述蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明也提供了利用這些基因調(diào)節(jié)植物分化和生長的方法。解決問題的手段GA是疏水的和弱酸性的。因?yàn)檫@些生物化學(xué)性質(zhì)，GA以可溶性酸鹽的形式存在于植物細(xì)胞中和細(xì)胞間隙?；蛘?，GA可以是游離酸形式，并因此通過被動(dòng)擴(kuò)散透過生物膜(Hooley，R.Biochem.Soc.Trans.85-89(1992))。已經(jīng)假定存在著兩種類型的GA受體膜結(jié)合型和細(xì)胞質(zhì)型(Hooley，R.e/a/.,Biochem.Soc.Trans.85-89(1992))。但是，還沒有鑒定出這兩種GA受體中的任何一種。同時(shí)，本發(fā)明人成功地分離出了水稻的多個(gè)GA不敏感型矮小突變體(QAinsensitive^varf突變體)。為了鑒定出突變體的致病基因，本發(fā)明人通過定位克隆指出了突變的位置。因此，本發(fā)明人成功地鑒定出GA不敏感型矮小突變的致病基因(QAinsensitivedwarf突變體-l;GID1)。分析該基因發(fā)現(xiàn)GID1基因編碼了與激素敏感型脂肪酶家族相似的未知蛋白。重組GID1蛋白表現(xiàn)出與有生物學(xué)活性的GA如GA4、GA,、和GA3的高親和力，但是沒有表現(xiàn)出與無生物學(xué)活性GA如GA9、GA51、和3-epi-GA4的高親和力。另夕卜，具有對應(yīng)于三種g/W等位基因中每一種等位基因的突變的突變體GID1蛋白沒有表現(xiàn)出與GA的親和力。此外，GID1對GA4的IQ值為l(T7M級，這足以解釋所造成的枝條伸長。發(fā)現(xiàn)GID1和GA4的結(jié)合/解離率也是非常高的。此外，超產(chǎn)GID1的株系表現(xiàn)為GA高敏感型表型。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，GID1蛋白被確定為介導(dǎo)GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)型受體。本發(fā)明所提供的赤霉素結(jié)合蛋白基因?qū)τ谠黾映嗝顾孛舾行砸栽鲞M(jìn)植物生長是非常有用的。此外，當(dāng)通過抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)將高的農(nóng)作植物(例如谷類農(nóng)作物)修飾成矮小型時(shí)，可以減少植物的倒伏，提高產(chǎn)量。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于評價(jià)與有生物學(xué)活性的赤霉素的結(jié)合。通過使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)赤霉素對植物的作用的化合物的篩選和測試。具體而言，本發(fā)明涉及赤霉素結(jié)合蛋白、所述蛋白質(zhì)的基因及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及權(quán)利要求書中給出的每項(xiàng)發(fā)明。意于將包括一個(gè)或多個(gè)在引用相同的權(quán)利要求的權(quán)利要求書中給出的發(fā)明的組合的發(fā)明包含于權(quán)利要求書的發(fā)明內(nèi)。具體而言，本發(fā)明涉及[l]任何一種下面的蛋白質(zhì)(a)包含氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9的蛋白質(zhì)；7(b)包含具有氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和減插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性；(c)由在嚴(yán)格條件下與從包含核苷酸序列SEQIDNO:1、4、6、或8和/或其互補(bǔ)序列的核酸制備出的探針雜交的核酸編碼的蛋白，其具有結(jié)合赤霉素的活性；[2][1]的蛋白質(zhì)，其是任何一種下面的蛋白質(zhì)(a)包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)；(b)包含具有氨基酸序列SEQIDNO:2中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性；(c)由在嚴(yán)格條件下與從包含核苷酸序列SEQIDNO:l和/或與其互補(bǔ)序列的核酸制備出的探針雜交的核酸所編碼的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性；[3]包括氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9的[1]或[2]的蛋白質(zhì)；[4]包括氨基酸序列SEQIDNO:2的[2]的蛋白質(zhì)；[5][1]到[4]中的任一蛋白質(zhì)，其是單子葉植物的蛋白質(zhì)；[6]編碼[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的核酸；[7]攜帶[6]的核酸的載體；[8]具有被引入其中的[6]的核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；[9][8]的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其是具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性的植物細(xì)胞；[10]引入了[6]的核酸的轉(zhuǎn)化植物，其是具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性的植物；[11][10]的轉(zhuǎn)化植物，其是單子葉植物；[12][10]或[11]的轉(zhuǎn)化植物的育種材料；[13]包含結(jié)合[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的抗體的多肽或包含所述抗體的抗原結(jié)合片段的多肽；[14]用于抑制[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸的表達(dá)載體；[15]引入了[14]的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；[16][15]的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物細(xì)胞；[17]引入了[14]的載體的轉(zhuǎn)化植物，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物；[18][17]的轉(zhuǎn)化植物，其是單子葉植物；[19][17]或[18]的轉(zhuǎn)化植物的育種材料；[20]用于增強(qiáng)或降低赤霉素敏感性的方法，其包括增加或減少[l]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的步驟；[21]用于產(chǎn)生產(chǎn)對赤霉素高敏感或低敏感的植物的方法，其包括從其中增加或降低了[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物細(xì)胞再生出植物的步驟。[22]用于檢測對赤霉素的應(yīng)答的方法，其包括步驟使赤霉素接觸其中提高或降低了[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物細(xì)胞或植物，并檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答；[23]用于檢測對赤霉素的應(yīng)答的方法，其包括步驟使測試化合物接觸其中提高或降低了[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物細(xì)胞或植物，并檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答；[24][23]的方法，其還包括接觸赤霉素的步驟；[25]用于選擇調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答的化合物的方法，其包括步驟0)使其中增加或降低了[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物細(xì)胞或植物接觸測試化合物；(b)檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答；和(c)選擇提高或降低赤霉素應(yīng)答的化合物；[26][25]的方法，其中步驟(a)在存在赤霉素的情況下進(jìn)行；[27]用于結(jié)合[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和赤霉素的方法，其包括使所述蛋白質(zhì)接觸赤霉素的步驟；[28]用于檢測赤霉素結(jié)合的方法，其包括步驟使[l倒[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)接觸赤霉素，并檢測所述蛋白質(zhì)和赤霉素之間的結(jié)合；[29]用于檢測調(diào)節(jié)赤霉素和[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)之間的相互作用的化合物的方法，其包括步驟(a)使測試化合物、赤霉素和所述蛋白質(zhì)相接觸；和(b)檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合；[30]用于選擇抑制赤霉素和[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)之間的相互作用的化合物，其包括步驟(a)使測試化合物、赤霉素和所述蛋白質(zhì)相接觸；(b)檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合；禾口(c)選出抑制結(jié)合的化合物；[31]用于結(jié)合[1]到[5]中任一的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白的方法，其包括使這些蛋白質(zhì)相結(jié)合的步驟；[32]包含[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和赤霉素的復(fù)合物；[33]包含[1]到[5]中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白的復(fù)合物；[34][32]的復(fù)合物，其還包含DELLA蛋白。圖1由顯示GA不敏感型表型gidl的曲線圖和照片組成。a)組描述了在播種后3個(gè)月的野生型植株(左側(cè))和gidl-l植株(右側(cè))的總體形態(tài)(欄(bar)=10cm)。插入物是播種后4周的gidl-l的放大圖像的照片(欄4cm)。b)組描述了應(yīng)答于GA3處理的野生型(實(shí)心圈)和gidl-l(實(shí)心三角)的第二葉鞘的伸長。欄代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=10)。c)組描述了應(yīng)答于GA3處理所誘導(dǎo)出的野生型(實(shí)心圈)和gidl-l(實(shí)心三角)的去胚半粒種子中的oc-淀粉酶活性。給出了3次重復(fù)試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。d)組描述了DSl/OsGA20ox的RNA凝膠印跡分析。從存在(3、4、7、和8)或不存在(1、2、5、和6)l(T6M烯效唑(uniconazol，uni)(一種GA生物合成的抑制劑)的情況下培養(yǎng)2周并經(jīng)10-SMGA3處理(2、4、6、和8)或未處理過(1、3、5、和7)的野生型和gidl幼苗中提取總RNA。用作為加樣對照的溴化乙啶(EtBr)染色凝膠。e)組描述了gidl-l和野生型中水稻GA的代謝途徑和GA水平(ng/g鮮重)，給出了3次重復(fù)試驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)組。f)組描述了gidl-l中喪失了GA誘導(dǎo)的SLR1的降解。上方的組是SLRl蛋白的蛋白凝膠印跡分析。播種后2周的gidl-l和野生型幼苗在存在10-SM烯效唑的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，并按圖所示的每個(gè)時(shí)段用1(^MGA3處理幼苗。在每個(gè)泳道上加樣lOiig總蛋白。中間的組使用考馬斯亮藍(lán)(CBB)用作加樣對照進(jìn)行染色。下面的組是攜帶有SLR1啟動(dòng)子-SLRl-GFP的轉(zhuǎn)基因的野生型植株和gidl-l植株的幼葉部分的GFP熒光的共聚焦顯微照片。植物在存在10"M烯效唑的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，并用或不用10_4MGA3處理12小時(shí)。g)組描述了對gidl和slrl突變的上位性分析的結(jié)果。Slrl-l單突變、sld/gidl雙突變、gid-l單突變植株(根據(jù)每個(gè)基因的序列鑒定出其基因型)和野生型植株的總體形態(tài)(欄40cm)。slrl-l/gidl-l雙突變體表現(xiàn)為slrl-l表型。根據(jù)F2植株(總數(shù)=844)的分離比率[每個(gè)表型的分離為200(slrl-l)、493(WT)、或151(gidl-l)，其對應(yīng)于4:9:3(x2=0.124，p=0.940)]證實(shí)了這一點(diǎn)。圖2是顯示GID1基因的基因組構(gòu)造的圖。a)組顯示出gidl被作圖于水稻第5號染色體的約80-cM區(qū)域中分子標(biāo)記物c56-10和c57之間約38kb間隔內(nèi)。b)組描述了四種gidl突變體的突變位點(diǎn)和突變。圖3是顯示GID1結(jié)構(gòu)的圖。a)組描述了GID1的氨基酸序列。顯示了gidl-l、gidl-2、和gidl-3的突變位點(diǎn)。b)組是GID1和NCBI保守區(qū)搜索(ConservedDomainSearch)數(shù)據(jù)庫中HSL組的共有序列(SEQIDNO:3)之間的氨基酸序列比較。實(shí)心圈代表HSL家族的保守區(qū)。數(shù)值代表每個(gè)序列中距離第一個(gè)甲硫氨酸的位置。c)組描述了對攜帶有Actl啟動(dòng)子-GIDl-GFP的轉(zhuǎn)基因水稻植株的幼葉部分的GFP熒光的共聚物顯微照片的結(jié)果。用10^M烯效唑(+uni)或1(T5MGA3(+GA3)處理植物1周。左面的組，中間的組顯示了樣品的DAPI染色。圖4顯示了GIDl的GA結(jié)合性能以及超產(chǎn)GIDl植物的表型。a)組描述了GIDl的GA結(jié)合的飽和性。用氚標(biāo)記的GA4衍生物3H-16,17-二氫G&、以及用次序漸增濃度的未標(biāo)記的16，17-二氫GA4孵育重組體GID1。欄代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。b)組描述了a所示的結(jié)合數(shù)據(jù)的斯卡恰特作圖的結(jié)果。從三次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果中計(jì)算出Kd值(相關(guān)系數(shù)112=0.96)。c)組描述了3H-GA與GIDl的結(jié)合/解離速率。3&16，17-二氫GA4的總結(jié)合在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到了最大值的一半(實(shí)心圈)。當(dāng)向檢測混合物中加入未標(biāo)記的GA4(0.125mM)(箭頭)時(shí)，3H-GA結(jié)合在數(shù)分鐘內(nèi)減少到小于10%(實(shí)心三角)。欄代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。d)組描述了已經(jīng)喪失GA結(jié)合活性的突變體GID1蛋白。上面的組對應(yīng)于三種gidl等位基因的突變體GID1的三種重組蛋白(GID1-1、1-2、和1-3)都不與GA4相互作用。載體衍生的標(biāo)簽蛋白(Vec)也不相互作用。欄代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。下面的組對本試驗(yàn)所用的重組蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色。點(diǎn)代表SDS-PAGE譜中的GID或標(biāo)簽蛋白。在這個(gè)試驗(yàn)中，每種蛋白質(zhì)幾乎都使用了等量的蛋白質(zhì)(80pmd)。e)組描述了播種后3個(gè)月的超產(chǎn)GID-1植株(Actinl啟動(dòng)子-GID1，右側(cè))和野生型植株(對照，左側(cè))的總體形態(tài)。欄-50cm。f)超產(chǎn)GID1植株(實(shí)心三角)和野生型植株(實(shí)心圈)的第二葉鞘伸長的劑量依賴性GA應(yīng)答。欄代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=5)。圖5給出了擬南芥GID1(AtGIDl)和水稻GID1(OsGIDl)的氨基酸序列。三種AtGIDl和相關(guān)蛋白質(zhì)的比對。將AtGIDla(SEQIDNO:5)、AtGIDlb(SEQIDNO:7)、和AtGIDlc(SEQIDNO:9)的序列與OsGIDl(SEQIDNO:2)的序列進(jìn)行比較。ClustalW程序(ThompsonJDe"/.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-80;ChennaRd(2003)NucleicAcidsRes.31:3497-500;日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)的ClustalW網(wǎng)頁http:〃www.ddbip/search/dustalw-e.html)用于所述比對。7個(gè)克隆與OsGIDl定向進(jìn)化同源，其在BLAST搜索中被評級為第4到第10，并按該次序被命名為"D"到"J"。利用字母聯(lián)合來自AGI分組命名(AGI碼)的ORF名稱列表顯示出這些克隆。所點(diǎn)出的對應(yīng)于Gly-196和Arg-251的兩個(gè)氨基酸對于OsGIDl的GA結(jié)合活性是至關(guān)重要的；在水稻gidl-l和gidl-2突變體中，所述氨基酸已經(jīng)被其他的氨基酸殘基所取代。箭頭表示激素敏感型脂肪酶的三個(gè)催化中心(Ser(S)、Asp(D)、和His(H))。圖6涉及沒有GA結(jié)合活性的AtGIDl樣蛋白。A)組描述了利用大腸桿菌(Ea//)表達(dá)系統(tǒng)制備出四種AtGIDl樣蛋白中每種蛋白的重組蛋白(D，At5g23530;E，At5g06570;F，At5g62180;和G，At3g48700，用AGI碼(擬南芥基因組Initiative基因編碼)顯示出每種蛋白質(zhì))。與作為陽性對照(C)的重組AtGIDlc的量相比較，IO倍量的每種粗制蛋白被用于隨后的GA結(jié)合檢測。星號表示SDS-PAGE中的重組蛋白。B)組描述了利用標(biāo)準(zhǔn)方案評價(jià)AtGIDl樣蛋白(D到G)的GA結(jié)合活性。通過總結(jié)合活性(B)減去非特異性結(jié)合活性(UB:過量未標(biāo)記GA所不能置換的活性)可以計(jì)算出特異性GA結(jié)合活性(B-UB)。從3次獨(dú)立測量中確定出SD。C)組描述了重組AtGIDlc蛋白的粗制部分(Cr)及其經(jīng)Ni柱層析和凝膠過濾層析所獲得的純化部分(GE)的SDS-PAGE譜的結(jié)果。星號表示純化的重組AtGIDlc蛋白。D)組描述了重組AtGIDlc蛋白的粗制部分(Cr)和純化部分(GE)的GA結(jié)合活性。從3次獨(dú)立測量中確定出SD。圖7描述了對經(jīng)ClustalW程序比對的OsGIDl和10種類型的擬南芥蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果。圖8顯示了擬南芥種子中16,17-二氫-GA4的生理活性。根據(jù)Yamaguchi等(PlantCell,10,2115-2126，1988)的方法，測試了GA缺陷型gal-3種子在含16,17-二氫-GA4培養(yǎng)基中的發(fā)芽情況。每盤使用了約70到80粒種子。進(jìn)行3次獨(dú)立測量，并從這些測量中確定出標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。在4。C冷處理3天后，第4天在23。C評價(jià)種子的發(fā)芽情況。GA4用作參照。圖9顯示了AtGIDl的GA結(jié)合性能A)至C)組描述了對AtGIDl的GA結(jié)合的斯卡恰特作圖分析的結(jié)果。顯示了AtGIDla(A)、AtGIDlb(B)、禾QAtGIDlc(C)的結(jié)果。通過向檢測混合物中加入不同濃度的GA可以測定出16，17-二氫-G八4的Kd值。從這3次獨(dú)立的測量中確定出標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。插入物顯示了AtGIDl的GA結(jié)合的時(shí)間-過程特征和使用過量的未標(biāo)記的GA4(0.125M)的取代(箭頭)。D)到F)組描述了AtGIDl在不同pH條件下的GA結(jié)合活性。顯示了AtGIDla(D)、AtGIDlb(E)、和AtGIDlc(F)的結(jié)果。通過向檢測溶液中加入0.125mMGA4確定出非特異性結(jié)合活性(UB)，通過用總結(jié)合活性(B)減去UB可以確定出特異性結(jié)合活性(B-UB)。圖10顯示了體內(nèi)和體外的AtGIDl-AtDELLA相互作用。圖A)描述了酵母雙雜交(Y2H)檢測法中存在GA時(shí)的AtGIDl-AtDELLA相互作用。每種AtGIDl作為誘傅，而AtDELLA作為被捕獲物。向培養(yǎng)基中加AGA4(1(T5M)。當(dāng)鄰-硝基苯酚-(3-D-半乳糖吡喃糖苷作為底物時(shí)，欄表示P-半乳糖苷酶活性(檢測法B)。在每個(gè)條形圖下面顯示了每種轉(zhuǎn)化體在給定培養(yǎng)基中生長2天(檢測法A)。重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)4次。從三次測量中確定出圖中所示的SD值。B)組描述了Y2H檢測法B中的AtGID1-RGA相互作用的劑量應(yīng)答。向培養(yǎng)基中加入GA4(10-5到10-9M)。試驗(yàn)被重復(fù)進(jìn)行2次。從三次測量中確定出圖中所示的SD值。C)組描述了利用AtDELLA對AtGIDl的體外GA結(jié)合效力的評價(jià)結(jié)果。左面的組在混合AtGIDlc(C)、氚標(biāo)記的GA和過量的未標(biāo)記的GA(+)或沒有未標(biāo)記的GA(-)之后15分鐘。力口入GAI(G)或RGA(R)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測量每個(gè)反應(yīng)混合物中的GA結(jié)合活性。源自載體(v)的重組蛋白用作陰性對照。重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)2次。從3次測量中確定出SD值。右面的組利用抗His標(biāo)簽抗體的重組AtDELLA的Western印跡譜。G，GAI;R，RGA;v，載體；M，分子量標(biāo)記。圖11顯示了GA非依賴性的AtGIDlb-AtDELLA相互作用。A)組描述了對在不存在GA的情況下的兩種檢測法中AtGIDlb-RGLl陽性信號的檢測。下面的組檢測法A中每種轉(zhuǎn)化體的生長。AtGIDlb-GAI的轉(zhuǎn)化體在延長孵育4天后也形成克隆。上面的組檢測法B中每種轉(zhuǎn)化體的P-半乳糖苷酶活性。當(dāng)使用鄰-硝基苯酚-P-D-半乳糖吡喃糖苷時(shí)，沒有檢測到信號。只有當(dāng)使用非常敏感的底物氯酚紅-P-D-半乳糖吡喃糖苷時(shí)，才能檢測到陽性信號。B)組描述了當(dāng)使用非常敏感的底物氯酚紅-p-D-半乳糖吡喃糖苷，然后使用鄰-硝基苯酚-P-D-半乳糖吡喃糖苷時(shí)的檢測法B的譜。在570nm處測量每個(gè)孔的吸光度。圖12描述了AtGIDl在水稻gidl-l轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)以及在擬南芥中的器官特異性。A)組描述了表達(dá)pActl-AtGIDla(al和a2)、pActl-AtGIDlb(bl和b2)、或pActl-AtGIDlc(cl和c2)的轉(zhuǎn)化體的總體形態(tài)。與親代突變體(gidl-l)和野生型植物(T65)—起顯示了在水稻Actinl啟動(dòng)子的控制下過表達(dá)AtGIDl基因(pActl-AtGIDl)的gidl-l植株。欄表示5cm。B)組描述了通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)化體中的AtGIDlmRNA。從每個(gè)轉(zhuǎn)化體的葉片中獲得了約200mg總RNA。PCR循環(huán)數(shù)是25個(gè)(AtGIDl)或22個(gè)(OsActin)。C)組描述了擬南芥中表達(dá)AtGIDl的器官的分布。F:花；Si:長角果；St:莖；L:葉；R:根；和S:浸泡種子。PCR循環(huán)數(shù)是31個(gè)(AtGIDl)或22個(gè)(AtActin)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了赤霉素結(jié)合蛋白和編碼所述蛋白質(zhì)的核酸。所述核酸可以是DNA或RNA，并且其形式不受特別的限制。具體而言，所述核酸可以是基因組DNA、合成DNA、mRNA等，并且可以是單鏈的或雙鏈的。所述核酸可以是環(huán)形的或直鏈的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"蛋白質(zhì)"不限于全長蛋白質(zhì)鏈，也包括被稱作"寡肽"的短肽鏈。術(shù)語"蛋白質(zhì)"也包括多肽。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和基因包括分離的的蛋白質(zhì)和基因以及重組的蛋白質(zhì)和基因。術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)和基因"指的是從天然狀態(tài)中分離出的蛋白質(zhì)和基因，也包括純化的和人工生成的蛋白質(zhì)和基因。術(shù)語"重組體"指的是經(jīng)遺傳重組或合成生成或復(fù)制出的蛋白質(zhì)和基因。術(shù)語"重組核酸"指的是其中在其一端或兩端沒有和天然狀態(tài)一樣連接核苷酸的核酸。重組核酸包括合成的核酸以及克隆于質(zhì)粒或其他載體中的核酸。通過用核酸酶、超聲處理等切開天然核酸并用連接酶等將其重新連接起來可以生成重組核酸。本發(fā)明的重組核酸在此也包括合成的核酸和以質(zhì)?；蚴删w或通過PCR擴(kuò)增出的核酸?；蛘?，當(dāng)重組體是蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語"重組蛋白"包括合成的蛋白質(zhì)和重組核酸所表達(dá)出的蛋白質(zhì)。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以制備出基因組DNA或cDNA。例如，通過篩選用從所需植物中制備出的基因組DNA所構(gòu)建出的基因組文庫可以獲得基因組DNA。同樣，通過用由從所需植物制備出的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA制備出cDNA文庫并篩選文庫可以獲得cDNA?？梢赃m當(dāng)?shù)刂苽涑龊Y選探針，例如，基于核苷酸序列SEQIDNO:l、4、6、或8可以制備出標(biāo)記的探針?；蛘?，通過利用cDNA或基因組DNA作為模板的RT-PCR可以擴(kuò)增出目的DNA?；蛘?，利用市售的DNA合成裝置也可以制備出目的DNA。本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括具有氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9的蛋白質(zhì)和與所述蛋白功能等價(jià)的蛋白質(zhì)。術(shù)語"功能等價(jià)"指的是存在赤霉素結(jié)合活性。具體而言，本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有與至少其中一種有生物學(xué)活性的赤霉素的結(jié)合活性。有生物學(xué)活性的赤霉素包括GA4、16,17-二氫GA4、GA卜GA3、GA35、和GA37。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地具有針對一種(例如GA4)或多種赤霉素的結(jié)合活性，更優(yōu)選具有針對兩種或多種赤霉素的結(jié)合活性，甚至更優(yōu)選具有針對三種或多種選自GA4、16，17-二氫GA^GAi和GA3的赤霉素的結(jié)合活性，仍更優(yōu)選具有針對所有四種赤霉素的結(jié)合活性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與有生物學(xué)活性的赤霉素特異性結(jié)合。具體而言，優(yōu)選的是本物學(xué)活性的赤霉素(例如GA4、16，17-二氫GA4、GAJHGA3)的親和力低很多。例如，通過確定Kd值確定出結(jié)合親和力。術(shù)語"赤霉素"在此指的是有生物學(xué)活性的赤霉素，除非有其他說明。例如通過孵育標(biāo)記的赤霉素和溶解于結(jié)合緩沖液(20mMTris-HCl(pH7.6)、5mM2-巰基乙醇、和0.1MNaCl)中的蛋白質(zhì)可以檢測出本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合赤霉素的能力。通過量化結(jié)合于柱的赤霉素可以測量出兩者之間的結(jié)合(Nakajima，M."a/"Biochem.Biophys.Res.Comm.241,782-786(1997))。具體而言，根據(jù)實(shí)施例所述的方法可以檢測出所述蛋白質(zhì)與赤霉素的結(jié)合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸的來源不受特殊限制。例如，本發(fā)明蛋白和核酸可以來源的植物物種可以包括單子葉植物或雙子葉植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述物種是單子葉植物，更優(yōu)選的是禾本科的植物，包括大麥、小麥、和水稻，最優(yōu)選的是水稻。雙子葉植物的實(shí)例包括擬南芥。在上面的描述中，術(shù)語"來源"意味著所述蛋白質(zhì)和核酸(i)具有與那些從具體植物獲得的蛋白質(zhì)和核酸相同的結(jié)構(gòu)；(ii)來自對(i)的修飾；或(iii)基于來自(i)的結(jié)構(gòu)(序列)信息的修飾信息所生成的。例如，通過修飾天然基因以插入限制性酶識別序列或添加標(biāo)簽肽以制備融合蛋白已經(jīng)可以常規(guī)地制備出源自天然基因和蛋白質(zhì)的核酸和蛋白，而不喪失其活性(Sambrook，J.andDWRussell,2001,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。這些修飾形式(和類似物及衍生物)都包括在本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸中。特別地，本發(fā)明也涉及具有赤霉素結(jié)合活性以及高度同源于但排除了SEQIDNO:2、5、7、或9的序列的蛋白質(zhì)。此外，除了實(shí)施例所述的水稻和擬南芥GID1蛋白的多態(tài)性形式和變體外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包括水稻和擬南芥赤霉素結(jié)合(GID1)蛋白的其他植物同源物(相似物(counterpart))。可以用雜交技術(shù)(SouthernEM:J.Mol.Biol.98:503,1975)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(SaikiRK，"a/:Science230:1350，1985;SaikiRK,"a/:Science239:487,1988)從相同的或不同的植物物種中分離出編碼同源蛋白的核酸。例如，利用具有核苷酸序列SEQIDNs:1、4、6、或8或與之互補(bǔ)的序列或其一部分的核酸通過雜交可以分離出編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸。具體而言，當(dāng)基于核苷酸序列SEQIDNO:1、4、6、或8或其互補(bǔ)序列或其一部分制備出探針時(shí)，可以從水稻和其他植物中分離出在嚴(yán)格條件下與所述探針雜交的核酸?；蛘撸?dāng)基于核苷酸序列SEQIDNO:1、4、6、或8或其互補(bǔ)序列制備出引物時(shí)，用PCR可以從水稻和其他植物中擴(kuò)增出編碼目的蛋白的核酸。這些蛋白質(zhì)包括例如經(jīng)AGI碼(擬南芥基因組Initiative基因編碼)標(biāo)識的蛋白質(zhì)At3g05120(AtGIDla;SEQIDNOs:4和5)、At3g63010(AtGIDlb;SEQIDNOs:6和7)、和At5g27320(AtGIDlc;SEQIDNOs:8和9)。在MIPS(慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心)的公開數(shù)據(jù)庫MATDB中或者通過搜索國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)頁也可以找到這些蛋白質(zhì)和基因的結(jié)構(gòu)。通過從具有核苷酸序列SEQIDNO:1、4、6、或8或其互補(bǔ)序列的核酸中或從雜交所靶向的核酸中制備出探針，然后檢測該探針是否與其他的DNA雜交可以檢測出核酸是否彼此雜交。可以通過隨機(jī)引物法(Sambrook，J.andDWRussell,2001，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;RandomPrimerDNALabelingKitVer.2.0(Takara,Otsu,Japan))標(biāo)記探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選出合適的嚴(yán)格條件。嚴(yán)格條件的實(shí)例包括例如在含有5xSSC(lxSSC含150mMNaCl和15mM檸檬酸鈉)、7%(W/V)SDS、100pg/ml變性的鮭精DNA、5xDenhardt溶液(lxDenhardt溶液含0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0.2%牛血清白蛋白、禾B0.2%Ficoll)的溶液中，48。C下、優(yōu)選在52。C下、以及更優(yōu)選在60°C下進(jìn)行雜交，并在2xSSC中，與雜交相同的溫度下、更優(yōu)選在60。C下、甚至更優(yōu)選在65°C下震蕩的同時(shí)洗滌2小時(shí)。更優(yōu)選用lxSSC、甚至更優(yōu)選用0.5xSSC、以及仍更優(yōu)選用O.lxSSC進(jìn)行所述洗滌(Sambrook，J.andDWRussell,2001,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)序列的核酸分別與氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9和CDS核苷酸序列SEQIDNO:1、4、6、或8高度同源。高同源性指的是序列具有60%或更高、優(yōu)選65%或更高、更優(yōu)選70%或更高、甚至更優(yōu)選75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、仍更優(yōu)選95%或更高的相同性。例如用BLAST程序(Altschul，S.F."a/.,1990，J.Mol.Biol.215:403-410)可以確定出序列相同性。具體而言，可以用blastn程序確定出核苷酸序列相同性，而可以用blastp程序確定出氨基酸序列相同性。例如，在NCBI(國立生物技術(shù)信息中心)的BLAST網(wǎng)頁中，通過將所有過濾程序(filter)例如"低復(fù)雜性(Lowcomplexity)"都設(shè)定為"關(guān)閉(OFF)"然后使用缺省參數(shù)可以實(shí)施計(jì)算(Altschul,S.F.a/.(1993)NatureGenet.3:266-272;Madden,T.L."a/.(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F."(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402;Zhang,J.&Madden,T丄.(1997)GenomeRes.7:649-656)。例如，所述參數(shù)可以設(shè)定如下核苷酸的開放缺口補(bǔ)償(opengapcost)被設(shè)定為5，蛋白質(zhì)的為11;核苷酸的延伸缺口補(bǔ)償(extendgapcost)被設(shè)定為2，蛋白質(zhì)的為h核苷酸錯(cuò)配懲罰(mismatchpenalty)被設(shè)定為-3;核苷酸錯(cuò)配補(bǔ)償(rewardforanucleotidematch)被設(shè)定為1;期望值被設(shè)定為10;核苷酸的字長被設(shè)定為11，蛋白質(zhì)為2;Wast延伸(extension)的Dropoff(X)被設(shè)定為20位(blastn)和7位(其他程序)；在不同于blastn的程序中，缺口比對的Xdropoff值被設(shè)定為15位，缺口比對的終末Xdropoff值被設(shè)定為50位(Wastn)和25位(其他程序)。在氨基酸序列比較中，BLOSUM62可以用作計(jì)分矩陣(Henikoff，S.和Henikoff，J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)。可以用比較兩個(gè)序列的blast2序列程序(TatianaAa/.(1999)FEMSMicrobiolLett.174:247-250)準(zhǔn)備兩個(gè)序列的比對，并確定出其序列的相同性。通過將缺口處理為錯(cuò)配并忽略CDS外的缺口可以計(jì)算出編碼序列(CDS)SEQIDNO:l、4、6、或8、或SEQIDNO:2、5、7、或9的相同性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包括具有包含氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。制備編碼具有修飾氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括定點(diǎn)誘變(Gotoh，T."a/.(1995)Gene152,271-275;Zoller,MJ，andSmith,M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500;Kramer,W."a/.(1984)NucleicAcidsRes.12，9441-9456;KramerW,andFritzHJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367;Kunkel,TA(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492;Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85,2763-2766)。蛋白質(zhì)氨基酸序列中的突變也可以天然發(fā)生，來自編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列中的突變。因此，本發(fā)明包括具有赤霉素結(jié)合活性并具有編碼天然存在的赤霉素結(jié)合蛋白的氨基酸序列(例如SEQIDNO:2、5、7、或9)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、添加、和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。對少數(shù)氨基酸的修飾可能不會影響蛋白質(zhì)活性(Mark，D.F.e"/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666;Zoller，M.J.&Smith,M.NucleicAcidsResearch(1982)10,6487-6500;Wang,A."a/.,Science224,1431-1433;Dalbadie-McFarland，G"a/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,6409-6413;Bowieaa/.,Science(1990)247，1306-1310)。待修飾的氨基酸數(shù)目通常是50個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選的是30個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選的是25個(gè)氨基酸或更少、20個(gè)氨基酸或更少、15個(gè)氨基酸或更少、或10個(gè)氨基酸或更少(例如5個(gè)氨基酸或更少、或3個(gè)氨基酸或更少)。待突變的氨基酸殘基優(yōu)選地被另一個(gè)容許保留氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的氨基酸所取代。這些取代被稱作保守氨基酸取代。在同一組中可以進(jìn)行保守取代的氨基酸組包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、和V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、和T)、和具有以下側(cè)鏈的氨基酸脂肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、和P)、含羥基側(cè)鏈(S、T、和Y)、含硫原子側(cè)鏈(C和M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D、N、E、禾PQ)、堿性側(cè)鏈(R、K、禾卩H)、和含芳香環(huán)側(cè)鏈(H、F、Y和W)(簡寫字母代表單字母氨基酸編碼)。每個(gè)氨基酸修飾前后的親水指數(shù)(KyteandDoolittle，JMolBiol.May5，1982;157(1):105-32)和親水值(US4554101)優(yōu)選在土2、更優(yōu)選在士l、甚至更優(yōu)選在士0.5的范圍內(nèi)。當(dāng)修飾氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9時(shí)，應(yīng)當(dāng)保留HGG基序(SEQIDNO:2的120到122位)和GXSXG基序(SEQIDNO:2的1%到200位)，兩者都是激素敏感型脂肪酶(HSL)家族的共有序列(Osterlund,T.""/，Biochem.J.319，411-420(1996);Ma腦，G.d"/.,Arch.Biochem.Biophys.373,182-192(2000))。另外，被修飾的序列優(yōu)選地包含SEQIDNO:2的70到119位的區(qū)域或SEQIDNO:5、7、或9的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列(見圖5)。更優(yōu)選地，被修飾的序列包含SEQIDNO:2的148到160位以及258到331位的區(qū)域或SEQIDNOs:5、7、或9的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列。這些優(yōu)選的蛋白質(zhì)包括例如包含SEQIDNO:2的70到350位的區(qū)域或SEQIDNO:5、7、或9的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。當(dāng)修飾不同于SEQIDNO:2、5、7、或9的蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選的是首先對所述氨基酸序列和這些序列進(jìn)行比對，然后進(jìn)行修飾，以確保保留對應(yīng)于上面所述的區(qū)域的區(qū)域。利用BLAST2SEQUENCES(TatianaA."a/"1999,FEMSMicrobiolLett.174:247-250)、ClustalW程序(ThompsonJDWa/.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-80;ChennaR"(2003)NucleicAcidsRes.31:3497-500)等可以進(jìn)行這種比對。例如通過篩選已知的表達(dá)文庫可以進(jìn)行對編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸的植物cDNA文庫的篩選。擬南芥和水稻GID1的N末端約70個(gè)氨基酸的序列是高度保守的，并對赤霉素結(jié)合蛋白具有特異性。因此，可以使用與該區(qū)域的任一位置結(jié)合的抗體。因此，通過篩選編碼與該抗體結(jié)21合的蛋白質(zhì)的基因可以分離出本發(fā)明的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的抗體是那些與擬南芥或水稻GID1(SEQIDNO:2、5、7、或9)的1到70位、優(yōu)選1到60位、更優(yōu)選1到50位、以及甚至更優(yōu)選1到40位的氨基酸區(qū)域中的任一個(gè)相結(jié)合的抗體?；蛘撸綠ID1的250到289位的氨基酸也是高度保守的，并且對赤霉素具有特異性。因此，也可以優(yōu)選地使用與該區(qū)域的任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體。例如，利用所述抗體可以進(jìn)行篩選，所述抗體與水稻GID1(SEQIDNO:2)的250到289位、優(yōu)選250到280位、更優(yōu)選280到270位、甚至更優(yōu)選280到260位的氨基酸區(qū)域中的任一個(gè)或與對應(yīng)于擬南芥GID1的這些氨基酸區(qū)域的任一位點(diǎn)結(jié)合(見圖5)。本發(fā)明包括與上面所述的任一抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)和反過來與赤霉素結(jié)合的蛋白質(zhì)。此外，通過合適地與其他蛋白質(zhì)融合可以將這些蛋白制備成融合蛋白。通過在框內(nèi)連接編碼靶蛋白的DNA、將該連接序列插入表達(dá)載體、并在宿主中表達(dá)所述所述序列可以制備出融合蛋白。被融合的蛋白質(zhì)沒有特別限制，包括例如標(biāo)記物蛋白和標(biāo)簽肽。具有本發(fā)明的氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9的蛋白質(zhì)包括在氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9的一端或兩端具有如下序列的蛋白質(zhì)，所述序列包含構(gòu)成所需蛋白質(zhì)(例如標(biāo)簽蛋白和其他蛋白質(zhì))的附加氨基酸序列。與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相融合的蛋白質(zhì)包括例如已知的標(biāo)簽肽如FLAG(Hopp，T.P.e^/"BioTechnology(1988)6，1204-1210)、6xHis(其包含6個(gè)組氨酸(His)殘基)、10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、pl8fflV片段、T7-標(biāo)簽、HSV-標(biāo)簽、E-標(biāo)簽、SV40T抗原片段、lck標(biāo)簽、a-微管蛋白片段、B-標(biāo)簽、和蛋白C片段。所添加多肽的長度可以是例如50個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選的是30個(gè)氨基酸或更少、25個(gè)氨基酸或更少、20個(gè)氨基酸或更少、15個(gè)氨基酸或更少、或10個(gè)氨基酸或更少。其他也可以被融合的蛋白包括例如谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)、流感血凝素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、P-半乳糖苷酶、和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)。也常常用與GST或MBP的融合蛋白收集體外表達(dá)的蛋白質(zhì)(G猶,C."a/.(1987)Gene,67，21-30;Maina,C.V."a/.(1988)Gene,74，365-373;Riggs，P,D.(19卯)InExpressionandPurificationofMaltose-BindingProteinFusions.F.M.Ausebel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.SmithandK.Stmhl(Eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,pp.16.6.1-16.6.10;Bar-PeledandRaikhel(1996)Anal.Biochem.241:140-142;BrewK,a/.(1975)JBC250(4):1434-44;H.Youssoufian,(1998)BioTechniques24(2):198-202)。當(dāng)融合蛋白被設(shè)計(jì)成在其分界處(boundary)具有肽酶裂解序列時(shí)，通過在純化后切除GST或MBP部分可以收集到單獨(dú)的目的蛋白。本發(fā)明也涉及攜帶編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的插入核酸的載體。這些載體沒有特殊限制，包括例如質(zhì)粒、病毒載體、噬菌體、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、PAC(PI衍生的人工染色體)、和TAC(可轉(zhuǎn)化人工染色體)。本發(fā)明的載體包括上述蛋白質(zhì)的編碼序列和/或與之互補(bǔ)的序列。例如，當(dāng)所述載體是雙鏈DNA載體例如質(zhì)粒載體時(shí)，它可以攜帶本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼序列以及與之互補(bǔ)的序列。當(dāng)所述載體是包括單鏈基因組等的病毒載體例如具有正鏈基因組的病毒時(shí)，它可以包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼序列，對于具有負(fù)鏈基因組的病毒而言，它可以包含所述序列的互補(bǔ)序列。優(yōu)選的本發(fā)明的載體包括表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體可以用于重組蛋白的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化。通過向細(xì)胞內(nèi)引入上述的表達(dá)載體并收集表達(dá)的蛋白質(zhì)可以生成重組蛋白。宿主細(xì)胞沒有特殊限制，只要它們適合于表達(dá)重組蛋白；可以使用細(xì)菌(例如大腸桿菌)、酵母、各種動(dòng)植物細(xì)胞(包括昆蟲細(xì)胞)等。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法可以將載體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)。例如，用轉(zhuǎn)方法或電穿孔可以實(shí)現(xiàn)向大腸桿菌內(nèi)的引入(Mandel,M.&Higa,A.,JournalofMolecularBiology,1970，53，158-162;Hanahan,D.，JournalofMolecularBiology,1983,166,557-580);當(dāng)宿主是酵母時(shí)，可以使用醋酸鋰法(BDYeastmakerYeastTransformationSystem2,BDBiosderice/Clontech);當(dāng)宿主是高等真核細(xì)胞時(shí)，可以使用各種類型的轉(zhuǎn)染試劑(TransIT(R)轉(zhuǎn)染試劑，MinisBioCorporation)等。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法可以從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清液中收集并純化出在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白。如上所述，重組蛋白可以被表達(dá)成與其他蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)?？梢詫⑦@些蛋白質(zhì)制備為例如與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白(pMAL系列；NewEnglandBioLabs)、與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白(pGEX系列；AmershamPharmaciaBiotech);或者當(dāng)宿主為大腸桿菌時(shí)的具有附加的組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(pET系列;Ncwagen)。當(dāng)重組蛋白被表達(dá)為與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白時(shí)，利用直鏈淀粉柱等可以容易地實(shí)施親和純化。當(dāng)重組蛋白被表達(dá)為與GST的融合蛋白時(shí)，利用谷胱甘肽柱可以收集并純化所述蛋白質(zhì)。利用鎳柱可以收集并純化具有附加的His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及與本發(fā)明的赤霉素蛋白結(jié)合的抗體。用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其部分肽作為抗原可以制備出與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。在用本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)或其部分肽免疫接種一段時(shí)間后，在去除動(dòng)物(例如兔)的血液凝塊之后，可以從血清中制備出多克隆抗體。或者，通過融合骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)上述蛋白質(zhì)或肽免疫接種過的動(dòng)物的產(chǎn)抗體細(xì)胞、分離產(chǎn)生目的抗體的單克隆細(xì)胞(雜交瘤)并從細(xì)胞中制備出抗體，可以制備出單克隆抗體(Antibodies:ALaboratoryManual,E.HarlowandD.Lane,ed.,ColdSpringHarborLaboratory(ColdSpringHarbor,NY,1988))。所生成的抗體可以用于純化或檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)或者用于其他目的。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體、以及包含這些抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽(包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和單鏈Fv(scFv))。本發(fā)明也涉及包含上述抗體的組合物，例如抗血清。擬南芥和水稻GID1的N末端的頭70個(gè)氨基酸是高度保守的并對于赤霉素結(jié)合蛋白具有特異性。因此，預(yù)計(jì)與該區(qū)域內(nèi)任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體都具有非常突出的特征。或者，水稻GID1中250到289位的氨基酸也是高度保守的和并對赤霉素具有特異性。因此，預(yù)計(jì)與對應(yīng)于水稻或擬南芥區(qū)域的該區(qū)域內(nèi)的任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體也具有非常突出的特征。具體而言，例如本發(fā)明的抗體優(yōu)選地是與擬南芥或水稻GID1(SEQIDNO:2、5、7、或9)的1到70位、優(yōu)選1到60位、更優(yōu)選1到50位、甚至更優(yōu)選l到40位的區(qū)域內(nèi)的任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體；和與水稻GID1(SEQIDNO:2)的250到289位、優(yōu)選的250到280位、更優(yōu)選的280到270位、甚至更優(yōu)選的280到265位、仍更優(yōu)選的280到260位的氨基酸區(qū)域內(nèi)的任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體。與擬南芥GID1(見圖5)的相應(yīng)氨基酸區(qū)域內(nèi)的任一位點(diǎn)結(jié)合的抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明也涉及具有被引入其中的編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化植物。通過向植物細(xì)胞內(nèi)引入攜帶編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸的載體并從所獲得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中再生出植株可以生成這些轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化植物包括由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出的第一代植株以及它的含有引入核酸的植物子代和克隆。所述子代包括經(jīng)有性或無性繁殖(例如營養(yǎng)體繁殖等)生成的植物。所述子代也包括經(jīng)自花傳粉或異花傳粉獲得的子代。例如，通過與其他植物雜交生成的F1代和F2代植株以及它們的含有引入核酸的子代也被包括在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的范圍內(nèi)。用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體類型不受特殊限制，只要它能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所插入的基因。例如，可以使用其中編碼目的蛋白的序列與所需啟動(dòng)子下游相連接的載體。與編碼序列的下游相連接的終止子是優(yōu)選的。這些啟動(dòng)子包括例如組成型啟動(dòng)子如冠癭堿啟動(dòng)子(US5955646)、花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odellefa/.(1985)Nature313:810-812、US5352605、US5530196、US5858742、US6255560、EP131623B2)、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy"a/.(19卯)PlantCell2:163-171、US5684239、EP說明書5859331、EP651812B1、EP1179081A1、US5641876)、泛素啟動(dòng)子(Christensen(1989)PlantMol.Biol.12:619-632;Christensena/.(1992)PlantMol.Biol,18:675-689;US5510474、US5614399、US6020190、US6054574)、乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(CA1338858、EP278658B1、US5001060、EP459643B1、US52卯，924)、以及US5608149、US5608144、US5604121、US5569597、US5466785、US5399680、US5268463和US5608142所述的其他啟動(dòng)子。已知的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如受乙醇、四環(huán)素、類固醇、金屬離子或其他化合物或環(huán)境刺激物調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子系統(tǒng)。這些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如熱休克啟動(dòng)子(AinleyWM,KeyJL(1990)PlantMolBiol14:949-967;HoltorfS,"<a/.(1995)PlantMolBiol29:637-646)、病原體應(yīng)答型啟動(dòng)子(PRl-a;WilliamsS,"a/.(1992)Biotechnology10:540-543;GatzC(1997)A畫RevPlantPhysiolPlantMolBiol48:89-108)、除草劑安全劑應(yīng)答型啟動(dòng)子(In2-2、GST陽27、DeVeylderL，"a/.(1997)PlantCellPhysiol38:568-577)、光應(yīng)答型啟動(dòng)子(KuhlemeierC，"a/.(1989)PlantCell1:471-478)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(FirekS,a/.(1993)PlantMolBiol22:129-142)、乙醇應(yīng)答型啟動(dòng)子(SalterMG,"a/.(1998)PlantJ16:127-132)、植物激素應(yīng)答型啟動(dòng)子(LiY,"a/.(1991)PlantCell3:1167-1175)、類固醇應(yīng)答型啟動(dòng)子(AoyamaT，"a/.(1997)PlantJ11:605-612)、四環(huán)素應(yīng)答型啟動(dòng)子(GatzC,"a/.(1992)PlantJ2:397-404;WeinmannP,e/a/.(1994)PlantJ5:559-569;So讓erS,"a/.(1998)PlantCellRep17:891-896)、以及EP637339B1、US5851796、US5464758、US5589362、US5654168、US5789156、US5512483、US6379945、EP828829A1、EP1112360A1、WO01/62780、US4940661、US4579821、US4601978、US5654414、US5689044、US5789214、AU708850B2、US6429362、US5447858、EP159884Bl、CA1338010A1、EP922110A2、US6084089、EP812917A1、US6184443、US5847102、US5750385、US5639952和US5656496所述的其他啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子包括Yamamoto"a/.(1997)PlantJ.12(2):255-265;KawamataWa/.(1997)PlantCellPhysiol,38(7):792-803;Hansen"a/.(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343;Russell"a/,(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehart"a/.(1996)PlantPhysiol.U2(3):1331-1341;VanCampda/.(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535;Canevascini"a/.(1996)PlantPhysiol.12(2):513-524;Yamamoto"a/.(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196;Orozco"a/.(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138;Matsuoka"a/.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590;Guevara-Garcia"a/.(1993)PlantJ4(3):495-505等所述的啟動(dòng)子。終止子包括例如源自花椰菜花葉病毒的終止子和源自章魚堿合酶基因、膽脂堿合酶基因等的終止子，但并不限于這些終止子(Guerineau"a/.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon&a/.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen"a/.(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe"a/.(1990)Gene91:151-158;Ballas"a/.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903;Joshia/.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639)。例如，可以優(yōu)化所用的密碼子，以便提高基因表達(dá)。優(yōu)化方法見于以下文獻(xiàn)US5380831、US5436391、Murray"a/.(1989)NucleicAcidsRes.17:477-498。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以將載體引入到植物細(xì)胞內(nèi)。用于基因轉(zhuǎn)移的植物細(xì)胞包括例如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、植物細(xì)胞(例如種子胚鱗細(xì)胞、葉盤細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞)等。具體而言，所述方法包括例如土壤桿菌介導(dǎo)的利用Ti質(zhì)粒載體的基因轉(zhuǎn)移(EP270355、EP0116718、Nucl.AcidsRes.12(22):8711-8721(1984)、Townsenda/.,US5563055)、基因槍(US5100792、EP444882Bl、EP434616Bl、Sanfordda/"US4945050、Tomes"a/.(1995)"DirectDNATransferintoIntact27PlantCellsviaMicroprojectileBombardment"inPlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe"a/.(1988)Biotechnology6:923-926)、微注射(WO92/09696、WO94/00583、EP331083、EP175966、Green&a/.(1987)PlantTissueandCellCulture,AcademicPress;Crossway(1986)Biotechniques4:320-334)、電穿孔(EP290395、WO8706614、Riggs"a/.(1986)Proc.Natl,Acad.Sci,USA83:5602-5606;D，Halluinda/.(1992)PlantCell4:1495-1505)、以及DNA的直接整合(DE4005152、WO9012096、US4684611、Paszkowski"a/.(1984)EMBOJ.3:2717-2722)、脂質(zhì)體法(FreemanWa/.(1984)PlantCellPhysiol.29:1353)、voltex法(Kindle(1990)Proc.NatAcad.Sci.U.S.A.87:1228)、和聚乙二醇法。向植物細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移也見于以下文獻(xiàn)Oard(1991)Biotech.Adv.9:1-11;Weissinger"a/.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477;Sanforda/.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27-37;Christoua/.(1988)PlantPhysiol.87:671-674;McCabe"(1988)Bio/Technology6:923-926;FinerandMcMullen(1991)/"附raCellDev.Biol.27P:175-1S2;Singh"a/.(1998)Theor.Appl,Genet.96:319-324;Dattada/.(1990)Biotechnology8:736-740;Klein"a/.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309;Klein&a/.(1988)Biotechnology6:559-563;Tomes,US5240855;Buising自/"US5322783、US5324646;KleineM/.(1988)PlantPhysiol.91:440-444;F讓m"(1990)Biotechnology8:833-839;Hooykaas-VanSlogtereno/.(1984)Nature311:763-764;Bytebierda/.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349;DeWetW(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues,ed.Chapmana/,(Longman,N.Y.)，pp.197-209;KaepplerW(1990)PlantCellReports9:415-418;Kaeppler"a/.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566;Li"a/.(1993)PlantCellReports12:250-255;ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407-413;Osjoda"a/.(1996)NatureBiotechnology14:745-750。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化也見于以下文獻(xiàn)Toriyama"a/.(1988)Bio/Technology6:1072-1074;Zhang,a/.(1988)PlantCellRep.7:379-384;ZhangW(1988)Theor.Appl.Genet.76:835-840;Shimamoto"a/.(1989)Nature338:274-276;Datta(19卯)Bio/Technology8:736-740;Christou"a/.(1991)Bio/Technology9:957-962;PengWa/.(1991)InternationalRiceResearchInstitute,Manila,Philippines,pp.563-574;Caoa/.(1992)PlantCellRep.11:585-591;Lie/a/.(1993)PlantCellRep.12:250-255;Rathorea/.(1993)PlantMol.Biol.21:871-884;Fromm"a/.(1990)Bio/Technology8:833-839;Tomeswa/.(1995)"DirectDNATransferintoIntactPantCellsviaMicroprojectileBombardment"inPlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin);D，Halluin&a/.(1992)PlantCell4:1495-1505;Walters"a/.(1992)PlantMol.Biol.18:189-200;KozieUfa/.(1993)Biotechnology11:194-200;Vasil，I.K.(1994)PlantMol.Biol.25:925-937;Weeks"a/.(1993)PlantPhysiol.102:1077-1084;Somers"a/,(1992)Bio/Technology10:1589-1594;WO92/14828;Hiei，&a/.(1994)ThePlantJournal6:271-282);Shimamoto,K.(1994)CurrentOpinioninBiotechnology5:158-162;Vasil,a/.(1992)Bio/Technology10:667-674;Vain,"a/.(1995)BiotechnologyAdvances13(4):653-671;Vasil，"a/.(1996)NatureBiotechnology14:702。通過使用兩種或多種上述基因轉(zhuǎn)移方法的組合可以提高基因轉(zhuǎn)移的效率。例如，已知方法包括那些將經(jīng)涂有土壤桿菌的微粒投射(project)到植物組織或?qū)⑽⒘Ｅc土壤桿菌共培養(yǎng)后，用基因槍破壞植物組織的方法(EP486234、EP486233)。用于制備水稻轉(zhuǎn)化植物的己知方法的更具體的實(shí)例包括以下方法聚乙二醇法(Datta，S.K.(1995)InGeneTransferToPlants(PotiykusIandSpangenbergEds.)pp66-74)、基因槍法(ChristouWa/.(1991)Bio/technology,9:957-962)、利用愈傷組織的土壤桿菌法(Hiei,Y."a/.，PlantJ.6，270-282(1994))、和利用種子的土壤桿菌法(JP2001-029075)。這些方法可以被優(yōu)選地用于本發(fā)明。此外，所述載體可以攜帶合適的選擇標(biāo)記基因，或者可以將含有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體共引入到植物細(xì)胞內(nèi)，以便有效地選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可以用于此目的的選擇標(biāo)記基因包括例如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，這些基因賦予了對除草劑草胺膦(phosphinothricin)的耐藥性。根據(jù)植物細(xì)胞的類型，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以實(shí)現(xiàn)由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物(R.Abdullah""/.，Bio/Technology，4:1087-1090(1986);K.Toriyama"a/,,Theor.Appl.Genet.,73:16-19(1986);Y.YamadaWa/.,PlantCellReports,5:85-88(1986))。植物再生也見于以下文獻(xiàn)Vasilda/.(1984)inCellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants,Vols.I,II，III，LaboratoryProceduresandTheirApplications(AcademicPress);Weissbacha/.(1989)MethodsForPlantMol.Biol。利用相同的轉(zhuǎn)化株系或其他株系通過自花傳粉或異花傳粉可以由轉(zhuǎn)化植物獲得子代。通過異花傳粉也可以制備出其中已經(jīng)引入了所需表型的雜交體。通過有性或無性繁殖可以由轉(zhuǎn)化植物獲得子代。當(dāng)從所述植物、其子代或克隆中制備出育種材料時(shí)，可以從這些材料大量地生成植物。術(shù)語"育種材料"指的是具有生長成整個(gè)植物體的能力的植物器官和組織,包括種子、插條以及營養(yǎng)器官和組織。具體而言，營養(yǎng)器官包括樹樁、插條、根莖、塊莖、鱗莖、地下莖如球根、在土壤中擴(kuò)展的匍匐根樣根莖、在土壤表面水平生長的匍匐莖、和在地面上方形成的鱗芽。本發(fā)明可以適用于所需植物，所述植物包括例如選自禾本科、豆科、茄科、十字花科、葫蘆科、藜科、傘形科、紫菀科、薔薇科、和百合科的植物。具體而言，所述植物包括例如玉米(ZeflmGw)、蕓苔(5mm'o"qpws禾口Bross/cara/assp.)、苜蓿(Mec^cagos加'va)、7JC稻(O拜s如Va)、黑麥(&ca/ecerea/e)、高粱(iSorg/zwwZn.co/or禾口5brg/z"mv"/ga/'e)、向曰奏(//e/Zam/^sa"wwz^)、大麥(//orcfewwvw/gare)、^、麥(7WHcwmae"/vwm)、大豆(G7yc/"ew<3x)、煙草(A7co"a"ato6acw,"禾口tV/coW"""6e"/Zz"w/""")、馬鈴薯(So/a"訓(xùn)勵(lì)ems訓(xùn))、花生"rac/n》/^pogaea)、棉花(Gw卿/薩/由W畫)、番薯(&柳固6a她s)、咖啡(Co,aspp.)、椰子(Cocowwcz/era)、疲蘿(^4wawascowcmw)、相橘(C"rasspp.)、可可(77zeoZ)ramacacao)、茶樹(C鵬e腸w'"e肌'"、香蕉(Mwsaspp.)、鍔梨(Pe麼a函eWama)、番石榴(尸sW謂g呵'ava)、芒果(她wg^razW/cfl)、橄欖((9/eaewra/(3e(3)、番木瓜(Ca"'ca;a/aja)、腰果(/l"fitcaW騰occ/cfewto/e)、^奧洲堅(jiān)果(il/ac^/am/a/"/egr^/b/Za)、杏4二(iV"wz^yam_ygda/M)、甜菜(&tovw/gan's)、野生燕麥(oat)、擬南芥、和其它農(nóng)作物、蔬菜及觀賞植物。本發(fā)明優(yōu)選地適用于單子葉植物和農(nóng)作物植物。具體而言，這些植物包括禾本科植物、豆科植物和寥科植物。更優(yōu)選地，適用本發(fā)明的植物包括禾本科植物如水稻、大麥、小麥、黑麥、小米(millet)、稗(Japanesemillet)、粟(foxtailmillet)、甘蔗、高粱、薏苡(adlay)、玉米、日本草坪草、和燕麥，甚至更優(yōu)選地包括水稻(稻屬)。所生成的植物優(yōu)選地具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性。赤霉素敏感性的增強(qiáng)表示與引入本發(fā)明的核酸之前的親代株系比較，增強(qiáng)了至少一種赤霉素活性。通過測定植株高度、葉片長度、分蘗數(shù)、死亡率、葉鞘伸長率、種子中a-淀粉酶誘導(dǎo)作用等可以檢測出赤霉素敏感性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，與引入本發(fā)明核酸前的親代株系相比較，增強(qiáng)了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中的兩種或多種、更優(yōu)選3種或多種、或4種或多種赤霉素活性。赤霉素活性包括增加植物高度、葉片長度、和葉鞘伸長率；減少分蘗數(shù)目和死亡率；增加發(fā)芽和開花；抑制落葉；增加細(xì)胞分裂；誘導(dǎo)糊粉細(xì)胞中的淀粉酶以及水解酶的合成；以及活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(包括誘導(dǎo)GA應(yīng)答基因的表達(dá))的活性。當(dāng)植物具有這些特征中的其中一種或多種、優(yōu)選地兩種或多種、三種或多種、或四種或多種特征時(shí)，則判定植物中赤霉素敏感性增強(qiáng)。通過測試赤霉素轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體之間的作用是否不同或者作用是否依賴于赤霉素的劑量而變化，可以證實(shí)這些赤霉素活性的特異性。胞內(nèi)GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢測也見于以下文獻(xiàn)YazakiJ，""/.，DNARes.，2003,10(6):249-61;YazakiJ，"a/"PhysiolGenomics"2004，17(2):87-100;Margis-PinheiroM，"a/.，PlantCellRep"2005,23(12):819-33;ThomasSG,SunTP"PlantPhysiol"2004，135(2):668-76;OgawaM,da/.，PlantCell"2003，15(7):1591-604;Gomez-MaldonadoJ,"a/.,Planta"2004,218(6):1036-45;SkadsenRW"PlantPhysiol"1993，102(1):195-203;DillA,"。/"ProcNatlAcadSciUSA.，2001,98(24):14162-7;BouquinT,"a/"PlantPhysiol"2001，127(2):450-8;WashioK.，BiochimBiophysActa"2001,1520(1):54-62;OgawaM，a/.，PlantMolBiol.,1999，40(4):645-57;ChonoM,a/"PlantCellPhysiol.,1998，39(9):958-67;VishnevetskyM，"。/，JBiolChem.，1997，272(40):24747-50;ToyomasuT，a/"BiosciBiotechnolBiochem.，1995,59(10):1846-9;CejudoFJ，aa/.，PlantMolBiol"1992，20(5):849-56;GublerF，JacobsenJV"PlantCell"1992，4(11):1435-41;BaulcombeDC，"a/.，JBiolChem.,1987,262(28):13726-35;GaleMD，SpencerD.,BiochemGenet.,1977，15(l-2):47-57;GopalakrishnanB"a/"PlantMolBiol"1991，16(3):463-7;Cho,H.T.,andH.Kende.，1997,PlantCell9:1661-1671)。優(yōu)選地根據(jù)第二葉鞘的伸長和/或去胚半粒種子中a-淀粉酶的誘導(dǎo)確定出赤霉素敏感性(Ueguchi-Tanaka,M."a/.，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,97,11638-11643(2000);Yamaguchi，J,(1998)BreedingSci.48,365-370;Chrispeels，M丄andVarner,J.E.(1967)PlantPhysiol.42:398-406;KashemMAefa/.(1998)Planta，205(3):319-26)。更多的細(xì)節(jié)見實(shí)施例。本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)赤霉素敏感性的方法，其包括增加本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)的步驟。所述方法也包括用于通過增強(qiáng)赤霉素敏感性而改變表型(例如增強(qiáng)生長或增加植物高度)的方法。例如，可以提高本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)水平，以便獲得至少其中一種赤霉素高敏感表型，例如增加生長率。此外，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)赤霉素敏感性的方法，其包括向植物細(xì)胞內(nèi)引入編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸并用這些核酸增強(qiáng)赤霉素敏感性的步驟。這些也包括用于通過增強(qiáng)赤霉素敏感性而改變表型(例如增強(qiáng)生長或增加植物高度)的方法和用途。本發(fā)明也涉及用于生成具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性的植物的方法，其包括生成引入了編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸的植物并利用這些核酸生成所述植物的步驟。這些方法和用途也包括用于生成已經(jīng)通過增強(qiáng)赤霉素敏感性改變了其表型(具體而言，增強(qiáng)了所述植物的生長或者增加了所述植物的高度)的植物的方法以及這些植物的用途。本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸，其被單獨(dú)地用于增強(qiáng)赤霉素敏感性。被用于增強(qiáng)赤霉素敏感性的核酸指的是被唯一地用于增強(qiáng)赤霉素敏感性的核酸。本發(fā)明也涉及被唯一地用于通過增強(qiáng)赤霉素敏感性來改變表型(具體而言，即增強(qiáng)生長或增加植物高度)的核酸。預(yù)計(jì)在增強(qiáng)植物的赤霉素敏感性時(shí)發(fā)生了生長增強(qiáng)。例如，給農(nóng)作物例如食用植物應(yīng)用這些核酸可以增加產(chǎn)量。此外，可以自由地控制植物高度。本發(fā)明也涉及其中本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)受到了抑制的植物。減少了這些植物內(nèi)源包含的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。抑制蛋白質(zhì)表達(dá)表示減少或消除了目的蛋白或編碼所述蛋白的mRNA的表達(dá)量。所述抑制可以是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄抑制、翻譯抑制、和/或降低mRNA或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等等。依據(jù)由于植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)或mRNA水平或蛋白質(zhì)活性的降低造成的表型改變可以證實(shí)表達(dá)的抑制?？梢栽谥参飪?nèi)表達(dá)抑制本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的核酸，以抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些核酸包括在表達(dá)時(shí)抑制了編碼所述蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸。具體而言，利用反義作用和RNAi。Ecker等利用瞬時(shí)基因表達(dá)法證實(shí)了植物細(xì)胞中的反義作用(J.R.EckerandR.W.Davis,(1986)Proc.Natl.Acad.USA.83:5372)。隨后，已經(jīng)報(bào)道反義RNA的表達(dá)造成了很多植物(包括煙草和矮牽牛花)中靶基因的表達(dá)的降低(A.R.vanderKrolaa/.,(1988)Nature333:866)?，F(xiàn)在，反義RNA是一種明確的用于抑制植物中基因表達(dá)的方法。如下所示，反義核酸抑制靶基因表達(dá)的作用涉及以下多個(gè)因素通過形成三聚體抑制轉(zhuǎn)錄，通過與一部分RNA聚合酶生成的局部開放環(huán)結(jié)構(gòu)形成雜合體抑制轉(zhuǎn)錄，通過在合成過程中與RNA形成雜合體抑制轉(zhuǎn)錄，通過在內(nèi)含子-外顯子交界處形成雜合體抑制剪切，通過與剪切體形成部分形成雜合體抑制剪切，通過與mRNA形成雜合體抑制核到細(xì)胞質(zhì)的易位，通過與加帽位點(diǎn)或多(A)位點(diǎn)形成雜合體抑制剪切，通過與翻譯起始因子的結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體抑制翻譯起始，通過與鄰近起始密碼子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體抑制翻譯，通過與mRNA的翻譯區(qū)或多核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體抑制肽鏈的延伸，通過與核酸-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)形成雜合體抑制基因表達(dá)，RNA沉默介導(dǎo)的mRNA降解等等。這些因素抑制了轉(zhuǎn)錄、剪切、或翻譯的過程或降解了mRNA，并因此抑制了革巴基因表達(dá)(HirashimaandInoue，ShinSeikagakuJikkenKoza(NewCoursesinExperimentalBiochemistry)2，Kakusan(NucleicAcid)IV:"IdenshinoFukuseitoHatsugen(Replicationandexpressionofgenes)",Ed.TheJapaneseBiochemicalSociety,TokyoKagakudojin,pp.319-347，1993;Serioda/.，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6506-6510)。用于本發(fā)明的反義序列可以通過上面所述的任一作用抑制其耙基因的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，被設(shè)計(jì)成與基因的mRNA的5'末端鄰近的非翻譯區(qū)互補(bǔ)的反義序列能有效地抑制基因的翻譯。或者，也可以使用與編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)的序列。因此，用于本發(fā)明的反義核酸不僅包括那些包含與基因的翻譯區(qū)反義的序列的核酸，也包括那些包含與非翻譯區(qū)反義的序列的核酸。所用的反義核酸與合適啟動(dòng)子的下游相連接，含轉(zhuǎn)錄終止信號的序列優(yōu)選地與3'末端相連接。利用己知的方法可以用如上制備到的這些DNA轉(zhuǎn)化所需的植物。反義核酸的序列優(yōu)選地互補(bǔ)于植物的內(nèi)源基因或其一部分；但是，序列不必是完全互補(bǔ)的，只要它們能有效地抑制基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄RNA具有至少18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，優(yōu)選地具有20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及甚至更優(yōu)選地具有22、25、30、35、40、50、100、200、或500個(gè)核苷酸的序列，其與靶基因轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)序列的相同性優(yōu)選地是90%或更高，最優(yōu)選地是95%。所用的反義核酸的長度一般不到5kb，優(yōu)選地不到2.5kb。利用編碼核酶的DNA也可以抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。核酶是具有催化活性的RNA分子。存在各種具有不同活性的核酶。其中，根據(jù)對作為RNA裂解酶的核酶的研究，已經(jīng)可以設(shè)計(jì)出進(jìn)行位點(diǎn)特異性RNA裂解的核酶。本發(fā)明的核酶包括那些由400個(gè)或更多個(gè)核苷酸組成的大核酶，例如I組內(nèi)含子型核酶和含MlRNA的RNAseP核酶、以及具有約40個(gè)核苷酸的活性區(qū)域的核酶(稱作錘頭或發(fā)夾型核酶)(MakotoKoizumiandEikoOtsuka,(1990)Tanpakushitu,Kakusan,Koso(Protein,NucleicacidandEnzyme),35:2191)。例如，錘頭型核酶的自裂解區(qū)在3'末端的C"處裂解G'W5。U14與9位的A的堿基配對對于該活性是重要的，甚至在15位的核苷酸是A或U而不是C時(shí)，仍能發(fā)生裂解(M.Koizumi"a/.,(1988)FEBSLett.228:225)。當(dāng)核酶的底物結(jié)合位點(diǎn)被設(shè)計(jì)成與鄰近靶位點(diǎn)的RNA序列互補(bǔ)時(shí)，可以生成能夠識別靶RNA中序列UC、UU、或UA的限制性內(nèi)切酶樣RNA裂解核酶(M.Koizumi"a/.,(1988)FEBSLett.239:285;MakotoKoizumiandEikoOtsuka，(1990)Tanpakushitu,Kakusan，Koso(Protein,NucleicacidandEnzyme),35:2191;M.Koizumi"a/"(1989)NucleicAcidsRes.17:7059)。例如，在編碼序列SEQIDNO:1、4、6、和8中有很多潛在的靶位點(diǎn)。發(fā)夾型核酶也可用于抑制基因表達(dá)。在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈中可以找到發(fā)夾型核酶(J.M.BuzayanNature323:349,1986)。已經(jīng)顯示出，也可以根據(jù)這種類型的核酶設(shè)計(jì)出靶點(diǎn)特異性RNA裂解核酶(Y.KikuchiandN.Sasaki(1992)NucleicAcidsRes.19:6751;KikuchiY.KagakutoSeibutsu(ChemistryandBiology)1992,30，112)。所設(shè)計(jì)的能夠裂解其靶點(diǎn)的核酶與啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子相連，使得其可以在植物細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄。但是，當(dāng)向轉(zhuǎn)錄RNA的5'或3'末端添加額外的序列時(shí)，核酶可能喪失其活性。在這種情況中，順式發(fā)揮修剪作用的修剪核酶(trimmingribozyme)可以被排列于核酶部分(moiety)的5'或3，端，以便僅僅從核酶的轉(zhuǎn)錄RNA中精確地切割出核酶部分(K.Tairada/.,(1990)ProteinEng.3:733;A.M.DzianottandJ.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:4823;C.A.GrosshansandR.T.Cech(991)NucleicAcidsRes.19:3875:K,Taira"a/.，(1991)NucleicAcidsRes.19:5125)。此外，通過前后(intandem)排列這些組成單元以容許靶基因內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)的裂解可以進(jìn)一步地增強(qiáng)作用(N.Yuyama""/.,Biochem.Bi叩hys.Res.Commun.186:1271,1992)。通過用這種核酶特異性地裂解耙基因的轉(zhuǎn)錄本可以抑制靶基因表達(dá)?；蛘?，通過經(jīng)具有與靶基因序列相同的或相似的序列的DNA的轉(zhuǎn)化作用形成的共抑制作用可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)的抑制。存在兩種已知類型的共抑制轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。兩者指的都是當(dāng)經(jīng)轉(zhuǎn)化向植物內(nèi)引入具有與靶向內(nèi)源基因相同或相似的序列的基因時(shí)，抑制了靶向內(nèi)源基因的表達(dá)的現(xiàn)象，在植物中常?？梢钥吹竭@種現(xiàn)象(Curr.Biol.7:R793,1997，Curr.Biol.6:810，1996)。這種現(xiàn)象也被稱作同源基因沉默(HGS)。例如通過用所制備的載體轉(zhuǎn)換靶植物，可以獲得其中本發(fā)明的核酸表達(dá)受到共抑制的植物，使得本發(fā)明的DNA或具有與所述DNA相似序列的DNA可以得到表達(dá)，然后從所生成的植物中選出其中與野生型植物相比其靶基因的表達(dá)受到抑制的植物。用于共抑制的這些基因不必一定要與靶基因(例如，SEQIDNO:l、4、6、或8)完全相同，但是所述基因優(yōu)選地具有至少70%或更高的、優(yōu)選地80。/o或更高的、更優(yōu)選地90%或更高的(例如95%、96%、97%、98%、或99%或更高的)序列相同性。被轉(zhuǎn)錄的這些核酸不編碼任一具有赤霉素結(jié)合活性的蛋白是優(yōu)選的。例如，為了阻止功能蛋白的表達(dá)，優(yōu)選地使用其蛋白編碼序列有著核苷酸缺失、插入、或取代的核酸。RNA干擾(RNAi)或微RNA(miRNA)介導(dǎo)的表達(dá)抑制的部分機(jī)制被認(rèn)為是涉及到PTGS和HGS的共抑制作用(vanderKrolAR，"a/.，PlantCell,1990，2(4):291-9;JorgensenRA，da/"PlantMolBiol,1996,31(5):957-73;VanceandVaucheret(2001)Science292:2277-2280;Kerschen,A."a/"2004,FEBSLetters566:223-228;Jorgensen,R.A.,2003,Sensecosuppressioninplants:past,presentandfuture.In:RNAi:aGuidetoGeneSilencing(ed.G.J.Hannon),ColdSpringHarborLaboratoryPress,pp.5-21)。RNAi是一種現(xiàn)象，由此當(dāng)向細(xì)胞內(nèi)引入具有與靶基因序列相同或相似的序列的雙鏈RNA(此后簡稱為dsRNA)時(shí)，抑制了靶基因的表達(dá)。當(dāng)向細(xì)胞內(nèi)引入約40到數(shù)百個(gè)堿基對的dsRNA時(shí)，RNaseIII樣核酸酶Dicer從3'末端切下一段約21到23個(gè)堿基對dsRNA，形成siRNA(短干擾RNA或小干擾RNA)。特異性蛋白質(zhì)與該siRNA的結(jié)合形成了核酸酶復(fù)合物(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC))。該復(fù)合物識別并結(jié)合與siRNA的序列相同的序歹i」，并且通過RNaseIII樣酶活性在對應(yīng)于siRNA中心的位點(diǎn)裂解靶基因的mRNA。除此途徑外，siRNA的反義鏈與mRNA結(jié)合，并作為RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的引物，以合成dsRNA。該dsRNA再次成為Dicer的底物，這就形成了新的siRNA，并放大了其作用。在多種真核細(xì)胞中都已經(jīng)觀察到了RNAi。目前，RNAi已經(jīng)被廣泛地作為有效抑制靶基因表達(dá)的方法(Fire,A.RNA-triggeredgenesilencing.TrendsGenet.15,358-363(1999);Sharp,RA.RNAinterference2001.GenesDev.15，485-4卯(2001);Hammond,S.M.,Caudy，A.A.&Hannon,G.J.Post-transcriptionalgenesilencingbydouble-strandedRNA.NatureRev.Genet.2,110-1119(2001);Zamore，P.D.RNAinterference:listeningtothesoundofsilence.NatStructBiol.8，746-750(2001))。如上所述，尤其是植物中RNAi長期都被認(rèn)為是共抑制的。利用RNAi抑制基因表達(dá)常常被用作制備所需基因的敲除植物的方法(ChuangCF&MeyerowitzEM:Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985,2000;Tomita，R."/"FEBSLett.573:117-120)。用于轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)抗編碼所述蛋白質(zhì)的基因的RNAi的RNA(RNA-RNAi)的載體也可以被優(yōu)選地用于本發(fā)明，以生成其中本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)受到了抑制的植物。例如，包括由靶基因的編碼序列的一部分組成的有義鏈及其互補(bǔ)鏈的雙鏈RNA(dsRNA)可以被用作RNAi-RNA。例如，優(yōu)選地表達(dá)由短雙鏈區(qū)組成的siRNA。約21到23個(gè)堿基對的siRNA是優(yōu)選的，但是所述長度并不受特殊限制，只要它在所述siRNA不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的長度范圍內(nèi)。例如，siRNA長度可以是15到49個(gè)堿基對，優(yōu)選的是15到35個(gè)堿基對，以及更優(yōu)選的是21到30個(gè)堿基對。通過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄可以適當(dāng)?shù)厣蓅iRNA。所用的啟動(dòng)子包括例如RNA聚合酶III啟動(dòng)子(McManus"a/.(2002)RNA8:842-850)。siRNA的表達(dá)載體可以轉(zhuǎn)錄出如下的siRNA。例如，由耙蛋白的編碼序列構(gòu)成的RNA和另一個(gè)具有其互補(bǔ)鏈的RNA可以被轉(zhuǎn)錄為單個(gè)RNA分子；或者它們可以轉(zhuǎn)錄為其中兩個(gè)RNA分子經(jīng)間隔物(spacer)連接在一起的RNA分子。轉(zhuǎn)錄為單鏈的RNA可以轉(zhuǎn)換成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA(自我互補(bǔ)的發(fā)夾RNA(hpRNA))，并通過RNAi抑制了耙基因的表達(dá)(Smith,N.A."a/.Nature,407:319,2000;Wesley,S.V.a/.PlantJ.27:581，2001;Piccin,A."a/.NucleicAcidsRes.29:E55，2001)。RNAi-RNA的雙鏈區(qū)的序列不必與耙基因完全相同，但是序列相同性優(yōu)選地是90%或更高(例如95%、96%、97%、98%、99%或更高)。通過dsRNA中RNA-RNA配對形成的雙鏈RNA部分不限于配對的雙鏈體，也包括由于錯(cuò)配(相應(yīng)的核苷酸是不互補(bǔ)的)和/或凸出(缺少相應(yīng)核苷酸的一條鏈)所造成的不配對的部分。錯(cuò)配和凸出的數(shù)目通常是1到6，優(yōu)選地是1到3。與上述所述非常相似的是，miRNA(微RNA)也可以被用于抑制靶基因表達(dá)。miRNA可以被表達(dá)為前體RNA的一部分(Reinharte"/.(2002)Genes&Development16:1616-1626;Llave"a/.(2002)PlantCell14:1605-1619)。miRNA的大小一般是約15到30個(gè)核苷酸，以及miRNA具有與其耙向mRNA互補(bǔ)的序列。miRNA前體的構(gòu)建以及miRNA對靶基因表達(dá)的抑制見先前發(fā)表的文獻(xiàn)McManus"a/.(2002)RNA8:842-850;Reinhart"a/,Llave"a/.(2002)，ra。當(dāng)由表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄出miRNA時(shí)，可以使用例如RNA聚合酶III啟動(dòng)子(McManus"a/.(2002)RNA8:842-850)。通過向植物細(xì)胞內(nèi)引入含有核酸的表達(dá)載體并從細(xì)胞再生出植物可以生成其中本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)受到抑制的植物，所述核酸例如是如上所述的反義核酸、核酶、共抑制核酸、siRNA、或miRNA，它們都能抑制本發(fā)明蛋白的表達(dá)。本發(fā)明提供了攜帶有抑制本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)的核酸的載體，具體而言，所述核酸是針對編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的RNA的反義RNA、裂解編碼所述蛋白質(zhì)的RNA的核酶、經(jīng)共抑制作用抑制所述蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)共抑制作用的RNA、編碼抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的siRNA或miRNA的核酸，以及攜帶所述核酸的載體。本發(fā)明也涉及引入了核酸的植物細(xì)胞以及包含所述細(xì)胞的植物。通過上述方法可以實(shí)現(xiàn)載體引入和植物再生。本發(fā)明涉及用于降低赤霉素敏感性的方法，其包括抑制本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)的步驟。對本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制包括通過向所述蛋白質(zhì)內(nèi)引入突變來降低或消除所述蛋白質(zhì)的活性。具體而言，通過向基因內(nèi)引入突變、缺失或插入破壞(disruption)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因來抑制功能蛋白的表達(dá)，可以抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)。所述方法也包括通過降低赤霉素敏感性來改變表型的方法，特別是用于抑制生長、縮短植物高度、或誘導(dǎo)矮小癥的方法。例如，本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)水平可以被降低到容許獲得至少一種低赤霉素敏感性表型，例如矮小癥。本發(fā)明也涉及降低赤霉素敏感性的方法，其包括向植物細(xì)胞內(nèi)引入抑制本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白表達(dá)的核酸的步驟，和所述核酸降低赤霉素敏感性的用途。這些包括用于通過降低赤霉素敏感性來改變表型的方法和用途，例如抑制生長、縮短植物高度和誘導(dǎo)矮小的方法。本發(fā)明也涉及抑制本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)的核酸，所述核酸用于降低赤霉素敏感性。用于降低赤霉素敏感性的核酸指的是被唯一地用于降低赤霉素敏感性的核酸。本發(fā)明也涉及被唯一地用于通過降低赤霉素敏感性改變表型(特別是抑制生長、縮短植物高度、或誘導(dǎo)矮小癥)的核酸。本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)具有降低的赤霉素敏感性的植物的方法，其包括生成被引入了抑制赤霉素結(jié)合蛋白表達(dá)的核酸的植物的步驟，以及所述核酸在生產(chǎn)具有降低了的赤霉素敏感性的植物中的用途。這些方法和用途也包括用于生產(chǎn)通過降低赤霉素敏感性已經(jīng)改變了其表型(即已經(jīng)抑制了其生長、已經(jīng)縮短了其高度、或者已經(jīng)誘導(dǎo)了矮小癥)的植物的方法和用途。當(dāng)植物具有多個(gè)(2、3或更多個(gè))編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因時(shí)，通過抑制2個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選3個(gè)或多個(gè)、或更優(yōu)選所有基因的表達(dá)可以有效地降低對赤霉素的敏感性。其中已經(jīng)引入了抑制赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)的核酸的轉(zhuǎn)化植物包括從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中再生出的第一代植物、以及作為其子代或克隆的攜帶所述核酸的植物?？梢酝ㄟ^有性或無性繁殖由轉(zhuǎn)化植物獲得子代。此外，可以從所述植物、其子代或克隆中獲得育種材料(例如種子、果實(shí)、插條、根莖、塊莖、和樹樁)。當(dāng)通過有性繁殖生成子代時(shí)，可以使用自花傳粉以及與其他植物的異花傳粉。與親代株系或野生型植物相比，經(jīng)上述方法生成的植物中的赤霉素敏感性是降低的。例如依據(jù)是否存在一種或多種、優(yōu)選2種或多種、3種或多種、4種或多種赤霉素作用的特征例如植物高度和葉片長度的縮短、分蘗數(shù)和死亡率的增加、葉鞘伸長率的降低、以及淀粉酶誘導(dǎo)程度的降低可以證實(shí)赤霉素敏感性的降低。例如，可以提高植物中SD7mRNA的水平(Sasaki,A."a/"Nature416，701-702(2002))(例如1.5倍以上、優(yōu)選2倍以上、3倍以上、或5倍以上)，其中與對照植物(抑制前的親代株系)相比，所述植物中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)受到了抑制?；蛘撸梢蕴岣咧参镏蠫A1的水平(例如2倍以上、優(yōu)選5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、或100倍以上)，其中與對照植物相比，所述植物中本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)受到了抑制。此外，可以顯著地抑制赤霉素引起的SLR1蛋白的降解，其中與對照植物相比，所述植物中本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)受到了抑制。上面描述了赤霉素活性的細(xì)節(jié)。優(yōu)選地依據(jù)第二葉鞘的伸長和/或去胚半粒種子中淀粉酶的誘導(dǎo)確定出赤霉素敏感性(Ueguchi-Tanaka,M.efa/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,11638-11643(2000))。具體而言，與親代株系或野生型相比，降低了赤霉素敏感性降低的植物中的第二葉鞘伸長的程度和/或a-淀粉酶的誘導(dǎo)程度。根據(jù)本發(fā)明，可以通過如上所述的降低植物的赤霉素敏感性來修飾植物，形成矮小表型。具體地，當(dāng)高的植物被修飾成短莖矮小型植物時(shí)，可以提高它們對倒伏的耐受性。預(yù)計(jì)可以增加短莖農(nóng)作物植物的產(chǎn)量。事實(shí)上，通過在編碼GA20氧化酶(其是一種參與赤霉素生物合成的酶)的基因中引入突變己經(jīng)開發(fā)出了短莖高產(chǎn)水稻變體(IR8)(Sasaki，A."a/.，Nature,2002,416,701-702)。提高農(nóng)業(yè)重要農(nóng)作物的產(chǎn)量是世界范圍內(nèi)的重要目標(biāo)。具體地，對開發(fā)出高產(chǎn)的農(nóng)作物植物(例如水稻、小麥、大麥、野生燕麥、黑麥、玉米、和栗樹)的變體有著強(qiáng)烈的需要。通過將農(nóng)作物植物改造成本發(fā)明的短莖型可以生成預(yù)期具有更高產(chǎn)量的農(nóng)作物。或者，非農(nóng)作物植物例如觀賞植物也可以被制成矮小型，以便賦予新的美學(xué)價(jià)值。本發(fā)明提供了例如觀賞性的矮小盆景水稻植物，其中抑制了本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的表達(dá)。本發(fā)明也涉及用于結(jié)合赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，其包括使赤霉素和所述蛋白質(zhì)接觸的步驟。所述赤霉素可以是任一有生物學(xué)活性的赤霉素。另外，本發(fā)明也涉及用于結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白的方法，其包括使本發(fā)明的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白接觸的步驟。此外，本發(fā)明也涉及將赤霉素、DELLA蛋白和本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的方法，其包括容許它們共存的步驟。如下所述，這些方法可以用于檢測調(diào)節(jié)結(jié)合的化合物或者用于篩選調(diào)節(jié)結(jié)合的化合物。經(jīng)這種篩選獲得的化合物可以用于調(diào)節(jié)赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。利用生理溶液可以合適地實(shí)施結(jié)合反應(yīng)。這些溶液包括例如結(jié)合緩沖液[20mMTris-HCl(pH7.6)、5mM2-巰基乙醇、禾G(UMNaCl]，但不限于此。本發(fā)明也涉及由赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)組成的分離的復(fù)合物，以及由DELLA蛋白和本發(fā)明的蛋白質(zhì)組成的分離的復(fù)合物。此外，本發(fā)明也涉及由赤霉素、DELLA蛋白和本發(fā)明的蛋白質(zhì)組成的分離的化合物。DELLA蛋白指的是分組在植物GRAS家族的DELLA亞家族中的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(PengJaa/,(1999)Nature400:256-261;Itoh,H.a/.,TrendsPlantSci.8，492-497(2003))。已知DELLA蛋白具有抑制赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。存在多種已知的DELLA蛋白，包括例如擬南芥RGA、GAI、RGL1、RGL2和RGL3、水稻SLR1、大麥SLN1、玉米D8、和小麥RHT(Fleet,C.M"andSun,T,P.(2005)Curr.Opin.PlantBiol"8，77-85;Dili,A.，andSun，T.(2001)Genetics,159,777-785;Ueguchi-Tanaka,M."a/.(2005)Nature,437,693-698;ChandlerPMa/.(2002)PlantPhysiol129:181-190;GublerF"a/.(2002)PlantPhysiol129:191-200;PengJ"(1999)Nature400:256-261)。更具體而言，DELLA蛋白包括例如RGA(位置At2g01570、登陸號；NM—126218、CDS:207..1967、蛋白質(zhì)ID:NP—178266)、GAI(位置Atlgl4920、登陸號；NM—101361、CDS:189..1787、蛋白質(zhì)ID:NP—172945)、RGL1(位置Atlg66350、登陸號；NM—105306、CDS:133..1665、蛋白質(zhì)ID:NP—176809)、RGL2(位置At3g03450、登陸號；NM—111216、CDS:128..1768、蛋白質(zhì)ID:NP—186995)、RGL3(位置At5gl7490、登陸號；AK117226、CDS:191..1759、蛋白質(zhì)ID:BAC4湧2)、水稻SLR1(登陸號;AB030956、42CDS:216..2090、蛋白質(zhì)ID:BAA卯749)、大麥SLNK登陸號；AF460219、CDS:1765..3618、蛋白質(zhì)ID:AAL66734、Q8W127)、玉米D8(登陸號；AJ242530、CDS:1..1890、蛋白質(zhì)ID:CAB51557)、和小麥RHT(登陸號；AJ242531、CDS:1..1869、蛋白質(zhì)ID:CAB51555，Q9ST59)。例如通過如雜交的方法可以分離出其他植物的DELLA蛋白，所述雜交使用從上面所列的DELLA基因的編碼序列(CDS)或其互補(bǔ)序列制備出的探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇雜交條件。這些條件例如是在含有5xSSC(lxSSC含150mMNaCl和15mM檸檬酸鈉)、7%(W/V)SDS、lOOpg/ml變性鮭精DNA、5xDenhardt溶液(lxDenhardt溶液含有0.2%聚乙烯吡咯垸酮、0.2%牛血清白蛋白、禾B0.2%Ficoll)的溶液中在48°C、優(yōu)選52°C、以及更優(yōu)選60°C下進(jìn)行雜交，隨后在與雜交所用溫度相同的溫度、優(yōu)選60。C、更優(yōu)選65°C搖晃下用2xSSC洗滌2小時(shí)。更優(yōu)選地在1xSSC、甚至更優(yōu)選地在0.5xSSC、以及仍更優(yōu)選地在O.lxSSC中進(jìn)行洗滌(Sambrook，J.andDWRussell,2001，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。DELLA蛋白的氨基酸序列或編碼序列因此優(yōu)選地分別具有與任一上述的擬南芥或水稻DELLA蛋白或核酸高度同源的序列。高度同源性指的是60%以上、優(yōu)選65%以上、更優(yōu)選70%以上、甚至更優(yōu)選75%以上、80%以上、85%以上、90%以上，以及仍更優(yōu)選95%以上的相同性。用在此所述的方法確定出序列相同性。本發(fā)明提供了用于赤霉素應(yīng)答檢測(評價(jià))的方法，其包括使赤霉素接觸植物或植物細(xì)胞的以及檢測所述植物或植物細(xì)胞中赤霉素應(yīng)答的步驟，在所述植物或植物細(xì)胞中已經(jīng)提高或降低了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)。術(shù)語"赤霉素應(yīng)答檢測"指的是赤霉素應(yīng)答的定性和/或定量檢測，以及可以是檢測是否存在赤霉素應(yīng)答、確定赤霉素應(yīng)答的程度等等。這些赤霉素應(yīng)答也包括赤霉素引起的表型變化，例如植物高度和生長速度的變化。這些其中提高或降低了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物和植物細(xì)胞也包括所需的其中已知增加或降低(或消除)了所述蛋白質(zhì)或mRNA的量的植物和植物細(xì)胞。這些植物和植物細(xì)胞可以是例如其中已經(jīng)被描述的或已知的增加或降低了所述蛋白質(zhì)或mRNA的量的植物和植物細(xì)胞。所述檢測可以利用引入了編碼本發(fā)明的赤霉素結(jié)合蛋白的載體或編碼抑制所述蛋白質(zhì)的表達(dá)的核酸(反義核酸、siRNA等)的載體的植物或植物細(xì)胞進(jìn)行實(shí)施。例如，可以使引入了編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸的植物或植物細(xì)胞接觸有生物學(xué)活性的赤霉素，然后可以檢測赤霉素應(yīng)答。這些檢測使得能夠確定出引入編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸所引起的赤霉素應(yīng)答的增強(qiáng)或增強(qiáng)的程度?；蛘?，提供使引入了核酸例如反義核酸或siRNA的植物或植物細(xì)胞接觸赤霉素然后檢測赤霉素應(yīng)答可以確定出赤霉素應(yīng)答的降低以及降低的程度，所述核酸抑制了編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)。用已知的方法可以檢測出赤霉素應(yīng)答。本發(fā)明也提供了用于赤霉素應(yīng)答檢測的方法，其包括使其中已經(jīng)提高或降低了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物或植物細(xì)胞接觸測試化合物以及檢測所述植物或細(xì)胞中的赤霉素應(yīng)答的步驟。所述赤霉素應(yīng)答檢測指的是赤霉素應(yīng)答的定性和/或定量測量，包括檢測是否存在赤霉素應(yīng)答以及確定赤霉素應(yīng)答的程度。例如，因?yàn)橐呀?jīng)增強(qiáng)了其中已經(jīng)提高了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物的赤霉素敏感性，可以清楚地檢測出測試化合物對赤霉素應(yīng)答的作用。此外，通過比較所述結(jié)果和用測試化合物處理野生型植物所獲得的結(jié)果可以測試出所述作用的特異性?；蛘?，利用其中已經(jīng)降低了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物，通過測試化合物的檢測可以測定出以獨(dú)立于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方式誘導(dǎo)赤霉素應(yīng)答的作用。這些檢測法可以評價(jià)不包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)或其他化合物。利用測試化合物的上述檢測還可以包括接觸赤霉素的步驟。具體而言，本發(fā)明提供了赤霉素應(yīng)答的檢測方法，其包括步驟(a)在存在赤霉素時(shí)，使其中已經(jīng)提高了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)的植物或植物細(xì)胞接觸測試化合物；和(b)檢測存在或不存在所述測試化合物時(shí)所述植物或細(xì)胞中的赤霉素應(yīng)答。這些赤霉素包括所需的有生物學(xué)活性的化合物。這些方法能夠檢測調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答的化合物。這些檢測可以用于評價(jià)測試化合物是否能夠調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答或者評價(jià)其調(diào)節(jié)的程度。在這些檢測方法的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于選擇調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答的化合物的方法。具體而言，可以在存在測試化合物的情況下實(shí)施上述檢測方法，可以檢測出赤霉素應(yīng)答。然后，選擇增強(qiáng)或降低赤霉素應(yīng)答的測試化合物。該方法能夠篩選新的赤霉素衍生物或抑制赤霉素作用的化合物。作為比較的對照物，在沒有(或低劑量)測試化合物或存在其他化合物時(shí)實(shí)施所述檢測?？梢赃x出與對照的赤霉素應(yīng)答相比增強(qiáng)或降低了赤霉素應(yīng)答的測試化合物。另外，本發(fā)明也提供了用于檢測赤霉素結(jié)合的方法，其包括使本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸赤霉素以及檢測赤霉素與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合的步驟。本發(fā)明也涉及用作赤霉素結(jié)合蛋白的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。用作赤霉素結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)指的是被唯一地用于赤霉素結(jié)合的蛋白質(zhì)。這些赤霉素包括所需的有生物學(xué)活性赤霉素。通過在此所述的方法可以檢測赤霉素結(jié)合。此外，在檢測方法的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的相互作用的化合物的檢測方法。具體而言，通過使測試化合物、赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)相接觸以及通過檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)的結(jié)合可以評價(jià)測試化合物是否增強(qiáng)或抑制了赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合或者增強(qiáng)或抑制的程度。作為對照，在沒有(或低劑量)測試化合物或存在其他化合物的情況下檢測赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合并且可以比較結(jié)果。此外，該檢測方法的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選擇增強(qiáng)或抑制赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的化合物的方法。具體而言，在使測試化合物、赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)相接觸之后，檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。通過選擇增強(qiáng)或抑制所述結(jié)合的化合物，獲得了增強(qiáng)或抑制赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合的化合物。作為對照，可以在沒有(或低劑量)測試化合物或存在其他化合物的情況下檢測赤霉素和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，并且可以比較結(jié)果。這些方法能夠篩選調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答的新的化合物。實(shí)施例下面將參照實(shí)施例具體地描述本發(fā)明，但是所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)作為對本發(fā)明的限制。通過引用將在此引用的所有先前技術(shù)的參考文獻(xiàn)并入本說明書。植物材料和生長條件在下面的實(shí)施例中，7JC稻變體L.cv.Taichung65、japonica(突變體來源的原始株系)、4個(gè)g/W突變體等位基因(g/W-7到g/W一)、和^"^n.ce7"/W-7)(Ikeda，A."a/"PlantCell.13,999-1010(2001))用作示例。G/W突變體等位基因是由下面的誘變劑引起的N-甲基-N-亞硝基脲(g/W-7)、細(xì)胞培養(yǎng)物(g^-2和g/W-4)、和Y射線(gW-"。所有水稻植株都在30。C(白天)和24。C(夜間)的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。GA應(yīng)答檢測利用Ueguchi-Tanaka，M.""/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,11638-11643(2000)所述的方法實(shí)施針對第二葉鞘的伸長和水稻去胚半粒種子的oc-淀粉酶的誘導(dǎo)作用的GA應(yīng)答檢測。質(zhì)粒構(gòu)建用PCR擴(kuò)增對應(yīng)于野生型和突變體G/D7的全長cDNA的DNA序列，以生成重組水稻GID1蛋白。將有和沒有突變的G/Z)/cDNA序列插入到pGEX-4T(Pharmacia)內(nèi)。對于互補(bǔ)檢測，用Pstl消化來自BAC克隆的水稻基因組DNA，分離出覆蓋整個(gè)G/Z)J序列的6.7-kbDNA片段，并將其克隆到pBluescript(R)內(nèi)。將該片段平截(blunt)并插入到耐潮霉素的二元載體pGI-Hm12的Sma/位點(diǎn)內(nèi)(Hm-2被修飾；Sato，Y."a/.,PlantMol.Biol.,1998,38:983-998)。先前已經(jīng)描述了SLR1啟動(dòng)子-SLRl-GFP的構(gòu)建(Itoh，H.Wa/"PlantCell14,57-70(2002))。如Hiei,Y.a/.，PlantJ.6，270-282(1994)所述，通過根癌農(nóng)桿菌"gra^cten'wm^ne/ac/em)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將這些構(gòu)建體引入到水稻細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)源性GA的測量和其他分析用如先前所述的氣相色譜選擇性離子監(jiān)測法(Kobayashi，M.Wa/.,Biosci.Biotechnol.Biochem.59，1969-1970(1995))實(shí)施對水稻內(nèi)源性GA的定量分析。如先前所述進(jìn)行RNA凝膠印跡分析和Western印跡分析(Itoh,H.a/.,PlantCell14,57-70(2002))。赤霉素結(jié)合檢測在赤霉素結(jié)合檢測中，[1,2,16，17陽3H4]16，17-二氫-GA4用作標(biāo)記的GA4。利用具有一些改變的先前方法實(shí)施體外GA結(jié)合檢測(Nakajima,M.Biochem.Biophys.Res.Comm.241,782-786(1997))。將純化的重組GID1蛋白(400pmol)溶解于300jal結(jié)合緩沖液[20mMTris-HCl(pH7.6)、5mM2-巰基乙醇、和0.1MNaCl]內(nèi)，并在25。C下與100|_il3H-16，17-:氫GA4(6pmo1)孵育2個(gè)小時(shí)，不存在未標(biāo)記的GA4(非特異性結(jié)合)或存在833倍過量的未標(biāo)記的GA4(總結(jié)合)。然后，將0.1ml反應(yīng)混合物加樣到NAP-5柱(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)上。舍棄結(jié)合緩沖液的洗脫物(0.6ml)，收集隨后的洗脫物(0.2ml)，并測定放射性。通過從總結(jié)合的量減去非特異性結(jié)合的量可以計(jì)算出反映出可置換GA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目的特異性結(jié)合活性。對其他的GA也可以實(shí)施與上相同的方法。實(shí)施例1:鑒定赤霉素不敏感型矮小突變體為了分離出參與赤霉素感知的基因，篩選水稻的GA不敏感型矮小突變體(g^)，并鑒定出不同基因座上的數(shù)個(gè)gW突變。其中一種突變體g/W-/表現(xiàn)出嚴(yán)重的矮小癥和深綠色的變大了的葉片，這是已知的水稻GA相關(guān)突變體的典型表型(Sasaki,A."a/.,Science299,1896-1898(2003);Itoh,H^a/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，8909-8914(2001);Sakamoto,T."a/.，PlantPhysiol.134，1642-1653(2004))(圖la)。該突變是隱性遺傳的，因?yàn)闆]有孕性花發(fā)育，所以所述突變體被保持為雜合植物。在所進(jìn)行的測試范圍內(nèi)，該植物都沒有顯示出任一類型的GA應(yīng)答性。1(T8M以上的GAs促進(jìn)了野生型植物(WT)的第二葉鞘的伸長，但是第二葉鞘的伸長在^'^-/植物根本沒有得到促進(jìn)(圖lb)。此外，io-9M以上的GA3誘導(dǎo)了野生型種子的cc-淀粉酶活性，但是在種子沒有誘導(dǎo)作用(圖lc)。在野生型中觀察到了GA3對S忉/ayO420oxXSasaki,A.d<a/.，Nature416，701-702(2002))(—種GA生物合成基因)(Thornton,T.M.aa/.,TrendsPlantSci.4,424-428(1999))表達(dá)的負(fù)反饋?zhàn)饔?，但是這在植物中沒有觀察到，以及SD7mRNA累積到高水平(圖ld)。此外，測量了內(nèi)源性GA的水平，結(jié)果表明g^/J比野生型蓄積了約120倍多的GA,(圖le)。這些結(jié)果都證明^'^-/是0八不敏感型突變體。接下來，進(jìn)行g(shù)/W和的上位性分析。雙突變體表現(xiàn)出表型(圖lg)。這表明GID1和SLR1作用于相同的GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且SLR1上位性地作用于GIDl。GA依賴性SLR1降解對于GA作用是至關(guān)重要的，已知當(dāng)降解受到抑制時(shí)，植物會表現(xiàn)出g^表型(Sasaki,A."a/.,Science299，1896-1898(2003))。進(jìn)行SLR1的免疫印跡分析，以檢測gW/-7中的SLR1降解是否受到了抑制。對于野生型植物，在用GA3處理后30分鐘內(nèi)誘導(dǎo)SLR1完全降解；但是，對于g^-7，無論是否進(jìn)行GA3處理(甚至處理2個(gè)小時(shí)后)，SLR1蛋白仍保持相同水平(圖lf中上面的組)。在其中已經(jīng)被引入SLR1啟動(dòng)子-SLRl-GFP的轉(zhuǎn)基因植物中也觀察到了gW中SLR1對GA3應(yīng)答的穩(wěn)定性增加；在gW7-7中甚至在GA3處理后的也觀察到了GFP信號，而在野生型的核中沒有觀察到信號(圖lf中下面的組)。這些結(jié)果證明GID1對于SLR1降解是至關(guān)重要的。實(shí)施例2:赤霉素受體基因的克隆用定位克隆分離出G7"/基因，確定出四種類型的突變體等位基因中的突變位點(diǎn)，以闡明GID1的分子功能(圖2)。預(yù)計(jì)GID基因是由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成的，并編碼354個(gè)氨基酸殘基的多肽(圖2b和3a)。對該基因全長cDNA序列的分析證實(shí)所預(yù)計(jì)的外顯子區(qū)域是正確的，以及該基因的確被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)覆蓋GID基因的整個(gè)區(qū)域的6.7-kb尸W/片段被引入到g/W-J中時(shí)，發(fā)現(xiàn)表型恢復(fù)成正常表型。分析GID1蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)GID1包含激素敏感型脂肪酶(HSL)家族的共有序列(圖3b)。事實(shí)上，GID具有GXSXG禾PHGG基序(圖3b中的點(diǎn))，其是HSL家族中最保守的基序(Osterhmd,T."a/.，Biochem.J.319,411-420(1996);Manco,GWArch.Biochem.Biophys.373，182-192(2000))。等位基因中GXSXG基序的第一個(gè)位點(diǎn)的D對G的單氨基酸取代造成了嚴(yán)重表型(圖3a)。因此，表明GXSXG基序?qū)τ贕ID1功能是重要的。GID1和HSL蛋白家族之間的結(jié)構(gòu)相似性表明水稻GID1具有HSL樣功能。通過觀察表達(dá)Actl啟動(dòng)子-GIDl-GFP的轉(zhuǎn)基因植物中的GFP信號研究了GID1的細(xì)胞定位。GID1-GFP蛋白主要位于細(xì)胞核，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢測到弱信號。在GA3處理前后不會改變該細(xì)胞定位(圖3c)。實(shí)施例3:赤霉素受體的分子分析C7/W中不會出現(xiàn)GA引起的SLRl降解(圖lf)。因此，假定GID1與GID2—樣也參與了SLRl的降解，或者GID1作用于GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中SLRl的上游。GW/和其它GA相關(guān)突變體之間的表型精確比較發(fā)現(xiàn)，與GA不敏感型突變體例如gzW2(Sasaki,A,Wa/"Science299,1896-1898(2003))和ADELLA型顯性的GA不敏感型矮小突變體(Itoh,H.PlantCell14,57-70(2002))相比，g/W表型與GA缺陷型突變體的嚴(yán)重等位基因例如c戸(Sakamoto,T."a/.,PlantPhysiol.134，1642-1653(2004))和too(Sakamoto,T.aa/.,PlantPhysiol.134，1642-1653(2004))的表型更為相似。根據(jù)g/W的這個(gè)表型特征，預(yù)計(jì)GIDl參與了GA感知。為了驗(yàn)證這種可能性，利用非平衡凝膠過濾(Nakajima,M.Biochem.Biophys.Res.Comm.241,782-786(1997))直接檢查了GIDl和放射性同位素標(biāo)記的GA之間的相互作用。和預(yù)期的一樣，GIDl表現(xiàn)出與氚標(biāo)記的GA4衍生物(SRrl6,17-二氫-GA4)的結(jié)合活性，利用過量的未標(biāo)記的GA4可以取代大多數(shù)結(jié)合。結(jié)合是可取代的事實(shí)表明結(jié)合是GA特異性的。相反地，熱變性的GID1、重組GID2、水稻GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的其他成員沒有表現(xiàn)出任何特異性的結(jié)合活性。接下來，通過利用氣標(biāo)記的GA4衍生物和各種GA之間的競爭作用測試了GIDl的配體特異性。表1顯示了每種GA的濃度，這是50%抑制氚標(biāo)記GA4的衍生物與GIDl的結(jié)合所需的濃度(IC5。)。GID1表現(xiàn)出對有生物學(xué)活性的GA例如GA4、16,17-二氫-GA4、GA!、禾nGA3的高親和力，但是沒有顯示出或幾乎沒有顯示出與無生物學(xué)活性的GA的親和力。每種GA的IC5o值都與其生理學(xué)活性非常一致。表1:各種GA在^-GA4衍生物與GIDl蛋白結(jié)合中的競爭作用ICS0**(Rel%)GA42X107M(100)H2-GA41X10《M(20)GA,4X106IVI(5)GA34X106M(5)GA3S1X10sM(2)GA372X105M0)GA4-Me3X1(T5M(0.6)GA92X104M(0.1)GAS1M(<?！?3-ep/"GA4》2X1(T4M(<?！?IGA4Ic。。hiGA37l'。(!。oh&ooh|GA9|cooh|g;A3|6oohl"A511"coohGAMI3誦印/t00H50[測試了有生物學(xué)活性的GA(GA4、16,17-二氫-GA4、GA,、和GA》、具有弱活性的GA(GA35和GA37)、以及無活性的GA(GA4甲酯、3-epi-G八4、GA"和GA51);**:IC5。表示50。/。抑制所需的濃度。Rd。/。表示相對值(％)]接下來，分析GID1與GA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。為了計(jì)算出GID1與GA結(jié)合的Kd值，利用各種濃度的GA4衍生物測量GA結(jié)合的飽和性(圖4a)。依據(jù)兩種GA的競爭效率，斯卡恰特作圖分析發(fā)現(xiàn)16,17-二氫-GA4和GA4的Kd值分別是1.4xl(T6M和2.8x1(T7M(圖4b和表l)。這些Kd值可以合理地解釋應(yīng)答于所施用的有生物學(xué)活性的GA的水稻枝條伸長的原因(圖lc)。此外，也檢査了所述結(jié)合的結(jié)合速率和解離速率。GID1和GA4衍生物之間的結(jié)合/解離所需的半衰期(half-time)是數(shù)分鐘或更短(圖4c)，說明這些反應(yīng)發(fā)生得非?？?。這種GA結(jié)合的快速動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為是有利于起到細(xì)胞質(zhì)受體的作用。然后研究了源自三種g/W等位基因g^/-/、g/W-2和g^7-3的突變體蛋白的GA結(jié)合活性，所述等位基因表現(xiàn)出嚴(yán)重的矮小表型。突變體GID1蛋白完全喪失了其與GA的結(jié)合活性(圖4d)。這表明GID1-1和GID1-2中單個(gè)氨基酸取代造成了GA結(jié)合活性的喪失，并因此引起水稻植株的完全的GA不敏感性。綜合這些結(jié)果，可以推論出GID1符合GA受體所需的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)(Kende,H.&Gardner,Annu.Rev.Plant,Physiol.27,267-290(1976))，所述標(biāo)準(zhǔn)是(i)可逆性；(ii)高配體特異性；GiO合理的與生物學(xué)活性的配體的親和力；和(h0GA結(jié)合特性的飽和性。實(shí)施例4:赤霉素受體基因的轉(zhuǎn)基因植物如果GIDl起到GA受體的作用，預(yù)計(jì)過表達(dá)GIDl的植物會表現(xiàn)為GA高敏感型表型。因此，生成了在水稻肌動(dòng)蛋白基因的強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控下過表達(dá)GID1的轉(zhuǎn)基因水稻植株。與野生型相比較，過表達(dá)GID1的植物表現(xiàn)為高的植物高度、長的淺綠色葉片、減少的分蘗數(shù)和降低的死亡率。在過度施用GA后，所有這些植物與獲得的表型相匹配(圖4e)。過表達(dá)GID1植物的第二葉鞘伸長的GA應(yīng)答性比野生型高出約100倍(圖4f)。如上所述，GID1對GA4的Kd值對于水稻枝條的伸長是合適的。但是，該值比糊粉細(xì)胞中GA介導(dǎo)的應(yīng)答例如ot-淀粉酶誘導(dǎo)作用高出約10倍(圖lc)。假定三聚體G蛋白的a-亞基參與了糊粉細(xì)胞的高敏感的GA應(yīng)答(Ueguchi-Tanaka,M.Proc.Natl.Acad.Sci,USA,97，11638-11643(2000))。具體而言，聯(lián)合三聚體G蛋白介導(dǎo)的膜受體系統(tǒng)促進(jìn)GID1的GA感知是可能的，這可以作為糊粉細(xì)胞中GA受體系統(tǒng)的另一個(gè)元件(Hooley,R."a/"Planta183，274-280(1991);Jones，H.D.PlantCell10，245-254(1998))。G/D7編碼一種既往未知的蛋白質(zhì)，并共有HSL家族的保守序列。HSL是哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞中脂解作用的激素調(diào)節(jié)方面的主要酶(Yeaman,S.J.，BiochemJ.379,11-22(2004))。在接收到來自激素(例如去甲腎上腺素和胰島素)的信號之后，HSL水解三甘油。盡管植物中沒有體外受體活性的遺傳學(xué)證據(jù)，但是Kumar和Klessig已經(jīng)報(bào)道了水楊酸(SA)結(jié)合蛋白2(SABP2)是具有脂肪酶活性的HSL家族成員，其可以與SA相互作用(Kumar,D.&Klessig，D.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100,16101-16106(2003))。本發(fā)明已經(jīng)證實(shí)GID1是參與植物信號感知系統(tǒng)的HSL家族成員，并通過作為細(xì)胞質(zhì)GA受體來調(diào)節(jié)GA信號。實(shí)施例5:擬南芥赤霉素受體的鑒定通過基因序列數(shù)據(jù)庫搜索找到了多個(gè)編碼與如上所述鑒定的水稻GID1(OsGIDl)蛋白的氨基酸序列相似的蛋白質(zhì)的擬南芥基因。圖5顯示了OsGIDl的氨基酸序列和10個(gè)與OsGIDl高度相似的擬南芥基因編碼的推定氨基酸序列的比對。來自兩個(gè)水稻g/W突變體(圖2b和3a)的兩個(gè)氨基酸殘基Gly-196和Arg-251被認(rèn)為對于GA相互作用至關(guān)重要。這兩個(gè)殘基中，Gly殘基存在于圖5所列的所有基因，而Arg殘基只存在于頭三個(gè)基因。這說明這三個(gè)候選物具有與OsGIDl相似的GA結(jié)合活性，但是其他候選物卻并非如此。利用大腸桿菌由頭7個(gè)表現(xiàn)出與OsGIDl的高度相似性的基因生成了重組蛋白，并通過利用氚標(biāo)記的G衍生物16,17-二氫-GA4的非平衡凝膠過濾法檢查了它們的GA結(jié)合活性。具體而言，利用依據(jù)AtGIDl的全長cDNA序列設(shè)計(jì)的以及在其每個(gè)末端都具有合適的限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物，用PCR擴(kuò)增出AG/D7基因的編碼區(qū)。在經(jīng)序列分析確認(rèn)之后，將每個(gè)cDNA片段連接到pET32a載體(Novagen/MerckBiosciences,Madison，WI，USA)或pGEX-4T-2載體(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ，USA;currently,apartofGEHealthcare)內(nèi)。用SDS-PAGE驗(yàn)證重組蛋白的生成；載體框作(cassette)為陰性對照。利用[l，2，16，17畫3H4]-16，17-二氫-GA4(4.55TBq/mmol)(由DuPont/NEN(Boston,MA,USA)定制)，與如上所述相似地實(shí)施GA結(jié)合檢測。用未標(biāo)記的GA4(1.25mM)測量非特異性結(jié)合。利用10種25到1500nM濃度范圍內(nèi)的濃度的16，17-二氫-GA4實(shí)施動(dòng)力學(xué)分析的飽和實(shí)驗(yàn)。用15nM[1,2,16,17JH4]-16，17-二氫-GA4和5種濃度的未標(biāo)記競爭物進(jìn)行競爭檢測。通過先前所述的方法用pET32a制備出重組的RGA和GAI蛋白。如一級結(jié)構(gòu)所預(yù)計(jì)的那樣，頭3個(gè)基因的產(chǎn)物表現(xiàn)出可逆的GA結(jié)合活性，其他4個(gè)基因的產(chǎn)物卻沒有類似表現(xiàn)(圖6)。這3種基因被命名為AG/Z)"(At3g05120)、^GiD"(At3g63010)、和力G7D/c(At5g27320)。這3種AtGIDl的氨基酸序列表明這些基因分別編碼345個(gè)氨基酸的多肽(39kDa、pl=6.6、AtGIDla)、358個(gè)氨基酸的多肽(40kDa、pl=7.4、AtGIDlb)、和344個(gè)氨基酸的多肽(38kDa、pl=7.2、AtGIDlc)。AtGIDl的氨基酸序列表現(xiàn)出彼此之間67%到85%的相同性，以及與OsGID160。/。到63%的相同性。系統(tǒng)進(jìn)化分析確認(rèn)了這三種AtGIDl都被分類到與OsGIDl相同的組中，并且被分類到獨(dú)立于其它基因的組中(圖7)。雖然AtGIDla和AtGIDlc可以被分類到相同的亞組內(nèi)，而AtGIDlb屬于獨(dú)立的亞組，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明AtGIDlb的生物學(xué)功能不同于其他AtGIDl。實(shí)施例6:擬南芥GID1的GA結(jié)合性能利用氚標(biāo)記的GA4衍生物16,17-二氫-GA4檢查如上鑒定出的3種AtGIDl的GA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)、配體選擇性、和pH依賴性。16，17-二氫-GA4有兩種化學(xué)異構(gòu)體，取決于C-16的位置，但是兩種異構(gòu)體都能與AtGIDl同樣地結(jié)合。16，17-二氫-GA4對0八缺陷型擬南芥突變體^。/-3萌發(fā)的生理學(xué)作用約為GA4的1/10(圖8)。首先，通過不同地變化孵育時(shí)間和解離時(shí)間研究了在加入過量的未標(biāo)記的GA4后，氚標(biāo)記的16,17-二氫-GA4和每種AtGIDl的結(jié)合隨著時(shí)間變化的特點(diǎn)。如圖9A到C的插入物所示，GA從AtGIDla復(fù)合物的解離要比其從AtGIDlb復(fù)合物的解離慢，而AtGIDlb與GA的結(jié)合要比AtGIDla快。相反地，AtGIDlc與GA的結(jié)合要比AtGIDlb慢，但是GA從AtGIDlc復(fù)合物的解離以及其從AtGIDlb復(fù)合物的解離之間沒有明顯差異。此外，在各種濃度GA的平衡條件下，分析了每種AtGIDl的GA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AtGIDlb與16,17-二氫-GA4的親和力(Kd=4.8xl(T7M)比AtGIDla與16，17-二氫-GA4的親和力(Kd=2.0x10-6M)和AtGIDlc與16，17-二氫-GA4的親和力(Kd=1.9xl(T6M)高4倍(圖9A到9c)。通過觀察向檢測混合物中加入GA后對重組蛋白和氚標(biāo)記的16,17-二氫-GA4之間的結(jié)合的競爭性抑制來檢查每種AtGIDl的配體選擇性(表2)。表1顯示了在此檢測法中所檢查的每種GA的結(jié)構(gòu)。利用抑制50%的示蹤劑(15nM)結(jié)合的GA濃度(ICso值)評價(jià)了配體選擇性。所有的AtGIDl都顯示出非常相似的配體選擇性。在所測試的GA中，GA4具有最強(qiáng)的抑制作用，而也被分類為活性GA的G&和GA,具有中等作用。同時(shí)，無生理學(xué)活性的GA沒有作用，說明它們不與AtGIDl相互作用。表2:GA在AtGIDl-GA結(jié)合中的競爭能力<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>[用ICs。值(M)評價(jià)每種GA的作用。每個(gè)數(shù)值都表示至少兩次測量的平均值。取GA4的數(shù)值作為100(%)，括弧中顯示了每種GA的相對值。H2.GA4:16,17-二氫-GA4;GA4-Me:GA4甲酯]從氨基酸序列預(yù)計(jì)的AtGIDla的pH值要明顯低于其他兩種AtGIDl的值。因此，研究了pH值對每種AtGIDl的GA結(jié)合的作用。雖然所有的AtGIDl都表現(xiàn)出在中性pH環(huán)境中具有最強(qiáng)的GA結(jié)合活性，但是它們在其他pH條件下的GA結(jié)合行為是不同的。雖然AtGIDlb表現(xiàn)出最強(qiáng)的pH依賴性，AtGIDla和AtGIDlc更能容許非中性pH的其他pH條件(AtGIDlb的GA結(jié)合的最佳pH范圍是6.4到7.5;AtGIDla的GA結(jié)合的最佳pH范圍是6.4到9.0;AtGIDlc的GA結(jié)合的最佳pH范圍為5.7到8.3;圖9D到9F)。這些生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了所有3種AtGIDl都具有合理的GA結(jié)合活性，AtGIDlb在GA結(jié)合親和力和pH依賴性方面的性能不同于其他兩種AtGIDl。實(shí)施例7:體內(nèi)和體外的AtGIDl-AtDELLA相互作用擬南芥有5種DELLA蛋白(RGA、GAI、RGL1、RGL2、禾卩RGL3;統(tǒng)稱為AtDELLA;Fleet,C.M,andSun,T,R(2005)Curr.Opin.PlantBiol"8，77-85;Dill，A.，andSun,T.(2001)Genetics,159，777-785);因此，有著15種可能的GID1/DELLA蛋白的組合。為了驗(yàn)證AtGIDl-AtDELLA之間的正相互作用，利用酵母雙雜交(Y2H)系統(tǒng)進(jìn)行兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)(檢測A)中，利用其中只有陽性克隆才能存活的給定培養(yǎng)基進(jìn)行可存活集落的檢測。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)(檢測B)中，測量了作為AtGIDl-AtDELL相互作用的報(bào)告基因產(chǎn)物的p-半乳糖苷酶活性。在Y2H實(shí)驗(yàn)中使用了BDMatchmaker雙雜交系統(tǒng)3(Clontech，PaloAlto，CA，USA;TakamBio的新部分)。在通過測序確認(rèn)了AG7D/基因的PCR產(chǎn)物之后，將PCR產(chǎn)物克隆到pGBKT7DNA-BD穿梭載體內(nèi)，以構(gòu)建出誘餌質(zhì)粒。同樣，將每種AZ^Z^4基因(GAI末端包括EcoRI和Iol位點(diǎn)、RGA末端包括BamHI和lol位點(diǎn)、RGL1末端包括Swal和&d位點(diǎn)、RGL2末端包括Swdt和C/al位點(diǎn)、RGL3末端包括Swal和^7/oI位點(diǎn))的整個(gè)編碼區(qū)都克隆到pGADT7AD載體內(nèi)。使用釀酒酵母(S.cereWs/ae)AH109(MATa)菌株或Y187(MATa)菌株，以及DNA-BD和AD載體框被用作陰性對照。在產(chǎn)品說明書(YeastProtocolsHandbook#PT3024-1;http:〃www.clontech.com/)中描述了酵母檢測所用方法的詳細(xì)內(nèi)容。獨(dú)立地實(shí)施試驗(yàn)4次。每次都獲得了相似的結(jié)果。GA4在GA結(jié)合檢測中表現(xiàn)出對所有AtGIDl中最強(qiáng)的親和力(表2)。因此，使用GA4(1(T5M)，并將其加入到培養(yǎng)基中。如圖10A所示，在檢測A中，在存在GA的情況下，所有AtGIDl-AtDELLA對的酵母轉(zhuǎn)化體都形成了集落，而在其他的陰性對照的情況下都有形成集落。在檢測B中，還檢測了所有15對的p-半乳糖苷酶活性。如上所述，可以檢測到所有GA依賴性方式的AtGIDl-AtDELLA相互作用；但是，在沒有GA時(shí)也能檢測到AtGIDlb和一些AtDELLA之間的相互作用，盡管較弱(圖11)。這些觀察說明AtGIDl和AtDELLA之間的相互作用可以GA依賴性方式發(fā)生在植物中，但是AtGIDlb-RGLl相互作用可以GA非依賴性方式發(fā)生。如圖IOA所示，AtGIDl-RGA對中(3-半乳糖苷酶的酶活性水平是相對中等的，因此這適合于比較目的；因此，用檢測B測試了AtGIDl-RGA相互作用對不同濃度GA4的劑量應(yīng)答。只有在GA4超過10^M時(shí)，才能檢測到AtGIDla-RGA和AtGIDlc-RGA相互作用，但是即使當(dāng)GA4為10'8M時(shí)，AtGIDl也可以與RGA相互作用(圖10B)。如上所述，通過使用Y2H系統(tǒng)，表明所有的AtGIDl都清楚地與AtDELLA蛋白相互作用。接下來，在體外檢查了AtDELLA是否對AtGIDl的GA結(jié)合活性產(chǎn)生某種影響。在結(jié)合了標(biāo)記的16，17-二氫-GA4和AtGIDl之后，向溶液中加入AtDELLA，并測量GA結(jié)合活性。圖10c清楚地顯示了在加入AtDELLA之后AtGIDl的結(jié)合活性提高。AtDELLA的體外作用看起來獨(dú)立于DELLA的類型，RGA和GAI都顯示出對AtGIDlc的GA結(jié)合的相似作用(圖lOc)。另外，檢查了在向反應(yīng)混合物添加DELLA蛋白之后AtGIDlc-GA相互作用的結(jié)合親和力。斯卡恰特作圖法顯示存在RGA時(shí)AtGIDlc和16，17-二氫-GA4之間的結(jié)合的Kd值為1.2xl(T8M，而在存在GAI時(shí)的值為4.6xl(T8M;因此，值比沒有AtDELLA時(shí)的值(圖9c所示，Kd=1.9xl(T6M)降低至約1/100。因此，AtDELLA的存在增強(qiáng)了AtGIDl-GA結(jié)合。實(shí)施例8:AtGIDl對水稻gW/-/表型的互補(bǔ)作用為了證明AtGIDl在體內(nèi)具有與水稻GID1(OsGIDl)相同的功能，用水稻g^7-7背景生成了在組成型啟動(dòng)子Actl的調(diào)控下過表達(dá)各種AG/D7基因的轉(zhuǎn)化體。具體而言，用PCR制備出其每個(gè)末端都包含合適的限制性酶切位點(diǎn)(AtGIDla/c為5WI位點(diǎn)；AtGIDlb為和Smal位點(diǎn))的AtGIDl的全長cDNA，并將其插入到攜帶有水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(pActl)和NOS終止子的二元載體內(nèi)(Sentoku，N."a/.(2000)Develop.Biol.,220,358-364)。在確認(rèn)插入之后，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將pActl-AtGIDl片段引入到水稻g/W-7植株內(nèi)。獲得了AtGIDla和AtGIDlb的各8個(gè)株系，并獲得了AtGIDlc的14個(gè)株系。在所有攜帶AG/D7克隆的轉(zhuǎn)基因植物中都挽救了g/W-/矮小表型(圖12A)。這說明AtGIDl在水稻中起到GA受體的作用。AG/Z)k植物的高度比其他轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物的高度稍矮(圖12A)。在幾乎所有的AG/Z)/"植物中都可以看到這種趨勢。這些轉(zhuǎn)基因植物中力G/DkmRNA表達(dá)水平與其他的AtGIDl相同(圖12B)。因此，認(rèn)為AtGIDla的GA受體功能要比AtGIDlb和AtGIDlc的GA受體功能弱，至少在水稻中如此。此外，通過GA3的外源性處理還測試了這些攜帶AG/D7的轉(zhuǎn)化體的GA應(yīng)答。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每株分蘗植物都被分成了兩株幼苗植物。每天給一株幼苗植物施用GA3—次，施用5天，同時(shí)給另一株幼苗植物施用不含GA3的模擬溶液。這些植物被證實(shí)為正常地應(yīng)答于所添加的GA，與野生型植物的應(yīng)答相^U從兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得了非常相似的結(jié)果。實(shí)施例9:AGZD7在各種器官中的表達(dá)用半定量RT-PCR分析了AG7D/基因在各種擬南芥器官(特別是約10cm高植物(萌發(fā)后40到45天)的莖、花、長角果、葉、根、和浸泡的種子中的表達(dá)。根據(jù)Kim等(Kim,Y,C."a/.(2005)PlantCellPhysiol.，46，1317-1325)，用表3所列的特異性引物進(jìn)行總RNA制備和RT-PCR。已經(jīng)確認(rèn)了所述引物對上述表達(dá)載體的特異性。通過2個(gè)循環(huán)間隔的不同數(shù)目PCR循環(huán)的試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)確定出了每個(gè)基因的合適的PCR循環(huán)數(shù)目，使得每種可視產(chǎn)物的量都在特定的動(dòng)態(tài)范圍之內(nèi)。獨(dú)立地實(shí)施實(shí)驗(yàn)至少2次。每次都獲得了相似的結(jié)果。表3:RT-PCR所用的引物_<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>(GeneAtlas)(Zi薩e腿nnP"o入，PlantPhysiol.136:2621-2632,2004;https:〃www.genevestigator.ethz.ch/at/index.php)的支持。這說明三禾中AtGID在不同的擬南芥器官中發(fā)揮作用。工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了介導(dǎo)赤霉素應(yīng)答信號的赤霉素結(jié)合蛋白以及編碼所述蛋白質(zhì)的基因。通過調(diào)控本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以調(diào)節(jié)植物分化和生長。例如，通過提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以提高生長速率，反之，通過降低本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以縮短植物高度和提高它們的倒伏耐受性。本發(fā)明因此可以用于提高農(nóng)作物產(chǎn)量以及生成具有新的美學(xué)價(jià)值的觀賞植物。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)，其為以下蛋白質(zhì)中的任一種(a)包含氨基酸序列SEQIDNO2、5、7、或9的蛋白質(zhì)；(b)包含具有氨基酸序列SEQIDNO2、5、7、或9中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性；(c)由在嚴(yán)格條件下與從包含核苷酸序列SEQIDNO1、4、6、或8和/或其互補(bǔ)序列的核酸制備出的探針雜交的核酸編碼的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性。2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其是以下蛋白質(zhì)中的任一種-(a)包含氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)；(b)包含具有氨基酸序列SEQIDNO:2中一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性；(c)由在嚴(yán)格條件下與從包含核苷酸序列SEQIDNO:1和/或其互補(bǔ)序列的核酸制備出的探針雜交的核酸編碼的蛋白質(zhì)，其具有結(jié)合赤霉素的活性。3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其包括氨基酸序列SEQIDNO:2、5、7、或9。4.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其包括氨基酸序列SEQIDNO:2。5.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其是單子葉植物的蛋白質(zhì)。6.編碼權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的核酸。7.攜帶權(quán)利要求6的核酸的載體。8.其中引入權(quán)利要求6的核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其是具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性的植物細(xì)胞。10.—種轉(zhuǎn)化植物，其引入了權(quán)利要求6的核酸，所述植物是具有增強(qiáng)的赤霉素敏感性的植物。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化植物，其是單子葉植物。12.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化植物的育種材料。13.—種多肽，其包括與權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或者包括所述抗體的抗原結(jié)合片段。14.一種核酸的表達(dá)載體，所述核酸抑制權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的表達(dá)。15.—種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其引入了權(quán)利要求14的載體。16.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其是具有降低的赤霉素敏感性的植物細(xì)胞。17.—種轉(zhuǎn)化植物，其引入了權(quán)利要求14的載體，所述植物是具有降低的赤霉素敏感性的植物。18.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化植物，其是單子葉植物。19.權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)化植物的育種材料。20.用于增強(qiáng)或降低赤霉素敏感性的方法，其包括增加或降低權(quán)利要求l的蛋白質(zhì)表達(dá)的步驟。21.用于產(chǎn)生對赤霉素的高敏感性或低敏感性的植物的方法，其包括從其中提高或降低了權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)表達(dá)的植物細(xì)胞再生植物的步驟。22.用于檢測對赤霉素的應(yīng)答的方法，其包括使赤霉素接觸植物細(xì)胞或植物以及檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答的步驟，所述植物細(xì)胞或植物中權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的表達(dá)被提高或降低。23.用于檢測對赤霉素的應(yīng)答的方法，其包括使測試化合物接觸植物細(xì)胞或植物以及檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答的步驟，所述植物細(xì)胞或植物中權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的表達(dá)被提高或降低。24.權(quán)利要求23的方法，還包括接觸赤霉素的步驟。25.用于選擇調(diào)節(jié)赤霉素應(yīng)答的化合物的方法，其包括步驟(a)使測試化合物接觸植物細(xì)胞或植物，所述植物細(xì)胞或植物中權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的表達(dá)被提高或降低；(b)檢測所述細(xì)胞或植物對赤霉素的應(yīng)答；和(C)選擇提高或降低赤霉素應(yīng)答的化合物。26.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(a)在存在赤霉素時(shí)實(shí)施。27.用于結(jié)合權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和赤霉素的方法，其包括使所述蛋白質(zhì)接觸赤霉素的步驟。28.用于檢測赤霉素結(jié)合的方法，其包括步驟使赤霉素接觸權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)以及檢測所述蛋白質(zhì)和赤霉素之間的結(jié)合。29.用于檢測調(diào)節(jié)赤霉素和權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物的方法，其包括步驟(a)使測試化合物、赤霉素和所述蛋白質(zhì)相接觸；和(b)檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。30.用于選擇抑制赤霉素和權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物的方法，其包括步驟(a)使測試化合物、赤霉素和所述蛋白質(zhì)相接觸；(b)檢測赤霉素和所述蛋白質(zhì)之間的結(jié)合；和(c)選擇抑制結(jié)合的化合物。31.用于結(jié)合權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白的方法，其包括使這些蛋白質(zhì)結(jié)合的步驟。32.包含權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和赤霉素的復(fù)合物。33.包含權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和DELLA蛋白的復(fù)合物。34.權(quán)利要求32的復(fù)合物，其還包括DELLA蛋白。全文摘要本發(fā)明的目的是提供赤霉素結(jié)合蛋白、編碼這些蛋白質(zhì)的基因、及其應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)起到赤霉素的細(xì)胞質(zhì)受體的作用，并介導(dǎo)植物中的赤霉素應(yīng)答。過表達(dá)這些基因的植物表現(xiàn)為赤霉素高敏感型表型，例如增加的植物高度。反之，其中基因發(fā)生突變的植物表現(xiàn)為赤霉素不敏感型表型，并因此變得矮小。因此，通過引入本發(fā)明的赤霉素結(jié)合基因或通過抑制所述基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)植物分化和生長。文檔編號A01H5/00GK101248178SQ20068002123公開日2008年8月20日申請日期2006年3月28日優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日發(fā)明者上口美彌子,中島正敏,北野英己,山口五十磨,松岡信,蘆刈基行申請人:國立大學(xué)法人名古屋大學(xué)