本發(fā)明屬于工程菌改造
技術(shù)領(lǐng)域：
以及利用工程菌合成聚乳酸的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用細(xì)胞修飾后形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構(gòu)建方法、工程大腸桿菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：聚乳酸(polylacticacid)是乳酸分子脫水縮合的產(chǎn)物。相比傳統(tǒng)的石油基熱塑材料，聚乳酸制品具有可降解性，生物相容性，低毒性等突出的優(yōu)點；相比其他的生物可降解聚合物，聚乳酸熔點高，結(jié)晶度大，熱穩(wěn)定性好，有良好的抗溶劑性，能用多種方式進行加工。因此，聚乳酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥材料、食品工程、紡織工業(yè)等領(lǐng)域。作為可以代替石油基熱塑材料的可再生材料，聚乳酸具備越來越重要的商業(yè)價值。目前成熟的聚乳酸工業(yè)制備均采用發(fā)酵-化學(xué)聚合二步法：先通過微生物以可再生生物質(zhì)為原料發(fā)酵和分離乳酸，然后通過化學(xué)方法將乳酸聚合為均聚物或共聚物。其流程為含淀粉生物質(zhì)→糖化→乳酸發(fā)酵→乳酸單體的分離提純→化學(xué)聚合。乳酸單體的制備方法有發(fā)酵法、化學(xué)合成以及酶化法，其中發(fā)酵法因其工藝簡單，原料充足，食用安全而成為比較成熟的乳酸生產(chǎn)方法在世界范圍內(nèi)廣泛采用。聚乳酸通常由經(jīng)典的丙交酯開環(huán)聚合工藝制得，該工藝已經(jīng)成熟的應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)(Vinketal.,2004MacromolecularBioscience,4:551-564)。丙交酯開環(huán)聚合工藝雖然易于控制，但是也存在著很多缺陷：丙交酯的提純需要多次重結(jié)晶、流程長溶劑消耗多，最終產(chǎn)品的收率較低以及污染環(huán)境等。為了克服上述缺點，研究人員開發(fā)出很多替代的聚乳酸化學(xué)聚合方法，包括直接熔融縮聚法和不需要溶劑的固相縮聚法(Moonetal,2001HighPerformancePolymers,13(2):S189-S196；Maharanaetal.,2009ProgressinPolymerScience,34:99-124)，但這些方法多需要特殊的催化劑和極端的工藝條件，提高了生產(chǎn)成本并限制了它們的進一步應(yīng)用。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，繁殖周期短，最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。由于此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。對于它的培養(yǎng)和代謝可以很好地人為控制，因此常用作發(fā)酵菌。大腸桿菌的這些生理特點說明它在生物發(fā)酵領(lǐng)域有較強的應(yīng)用前景，已有研究通過對大腸桿菌的遺傳修飾來發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯，如將大腸桿菌XL1-Blue經(jīng)過遺傳修飾【敲除原有的乙酸激酶(ackA)基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因和乙醇脫氫酶(adhE)基因，用trc啟動子取代D-乳酸脫氫酶(ldhA)基因的啟動子acs】能夠以葡萄糖為唯一碳源，合成的聚乳酸可達細(xì)胞干重的11％(JungYKetal.,2009BiotechnologyBioengineering,105:161-170)。將大腸桿菌XL1-Blue經(jīng)過遺傳修飾【敲除原有的延胡索酸還原酶(frdB)基因，引入外源的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因】能夠以葡萄糖和木糖為碳源合成高濃度的目標(biāo)產(chǎn)物聚乳酸聚羥乙酸共聚物(PLGA)，發(fā)酵產(chǎn)量可達細(xì)胞干重的40％(ChoiSYetal.,2016NatureBiotechnology,34(4):435-442)。因此，目前對于提高發(fā)酵生產(chǎn)聚乳酸產(chǎn)量的方法都是在對工程菌的代謝途徑及關(guān)鍵酶的改造方面，并沒有涉及對細(xì)胞形態(tài)的改造。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種利用形態(tài)改變的工程菌合成聚乳酸的方法，在所述遺傳修飾的工程大腸桿菌中通過過表達抑制細(xì)胞分裂的基因使細(xì)胞內(nèi)體積變大，從而增加聚乳酸的產(chǎn)量。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，步驟為1)以質(zhì)粒PACYCDuet-1為出發(fā)質(zhì)粒，將用于合成聚乳酸的外源性丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶PCT基因和PHA合成酶基因引入質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌BL21；2)通過PCR的方法對合成乳酸酯的乳酸脫氫酶LDH基因引入突變位點，提高酶的活性；以質(zhì)粒pTrcHis2B為出發(fā)質(zhì)粒，將遺傳修飾后的LDH基因引入質(zhì)粒并轉(zhuǎn)導(dǎo)到大腸桿菌BL21中，得到pTrcHis2B-LDH，使其表達的乳酸酯高于未遺傳修飾的對照宿主菌；3)對SOS細(xì)胞分裂抑制sulA基因進行突變，以質(zhì)粒pTrcHis2B-LDH為出發(fā)質(zhì)粒，通過同源重組的方法將突變后的sulA基因引入質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，通過過表達突變后的sulA基因，抑制細(xì)胞分裂，增大細(xì)胞內(nèi)體積，得到工程大腸桿菌。由于微生物包涵體的積累總是受到微生物細(xì)胞大小的限制，本發(fā)明所述的工程大腸桿菌經(jīng)過遺傳修飾抑制細(xì)胞分裂FtsZ環(huán)的裝配，改變細(xì)胞形態(tài)，使棒狀大腸桿菌變成纖維狀，增大了細(xì)胞體積，因此增加了細(xì)胞包涵體的產(chǎn)量。進一步，步驟1)中對轉(zhuǎn)移酶PCT基因進行優(yōu)化，得到PCTcp，序列為SEQIDNO:1。進一步，步驟1)中對PHA合成酶基因進行優(yōu)化，得到PHApse，序列為SEQIDNO:2。進一步，步驟2)遺傳修飾后的LDH基因的序列為SEQIDNO:3。進一步，步驟3)突變后的sulA基因的序列為SEQIDNO:4。本發(fā)明還保護經(jīng)上述構(gòu)建方法得到的工程大腸桿菌。本發(fā)明的工程大腸桿菌應(yīng)用于合成乳酸、聚乳酸或3羥基丙酸共聚物；具體是以葡萄糖為底物合成聚乳酸，轉(zhuǎn)化時溫度為35-37℃，是在溫和的條件下進行。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明構(gòu)建了遺傳修飾的大腸桿菌，使之適用于將葡萄糖底物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為聚乳酸，并增加了聚乳酸的產(chǎn)量。采用的技術(shù)手段是，在工程大腸桿菌中過表達乳酸脫氫酶(LDH)基因，大大增加了乳酸酯的形成。同時引入外源性丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因，丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因能顯著增加聚乳酸前體乳酰輔酶A的產(chǎn)量，PHA合成酶基因能促進乳酰輔酶A的聚合。然后通過過表達sulA基因進行遺傳修飾，抑制細(xì)胞分裂，使得大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)由棒狀變成纖維狀，增大了細(xì)胞內(nèi)體積，使得聚乳酸的產(chǎn)量高于現(xiàn)有的傳統(tǒng)棒狀大腸桿菌的發(fā)酵產(chǎn)量。同時，相互纏繞的纖維狀細(xì)胞比單一的棒狀細(xì)胞重，更容易從發(fā)酵液中沉淀出來，降低下游分離成本，使整體的生產(chǎn)成本得到降低，經(jīng)濟性得到提高。附圖說明圖1.實施例3中核磁共振氫譜圖；圖2.實施例3中核磁共振碳譜圖；圖3.實施例3中紅外譜圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細(xì)的說明。實施例1步驟1)含外源性丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因和PHA合成酶基因的表達載體的構(gòu)建。根據(jù)已公布的丙酸桿菌(Clostridumpropionicum)丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(PCT)基因(ChoiSYetal.,2016NatureBiotechnology,34(4):435-442)和假單胞菌(Pseudomonassp.)MBEL6-19的PHA合成酶基因(YangTHetal.,2011ApplMicrobiolBiotechnol,90:603-614)的全長序列信息，對兩個序列進行優(yōu)化使之適用于在大腸桿菌中進行表達，優(yōu)化后得到PCTcp(序列為SEQIDNO:1)和PHApse(序列為SEQIDNO:2)。根據(jù)PHApse進行化學(xué)合成，合成時分別在序列的兩端加上NdeI和XhoI酶切位點的序列。分別用NdeI和XhoI酶切通用表達質(zhì)粒PACYCDuet-1和合成的線性DNA片段并連接為新表達載體PACYC-PHApse。根據(jù)PCTcp進行化學(xué)合成，并用同源重組的方法無縫克隆到表達質(zhì)粒PACYC-PHApse中，構(gòu)建表達載體PACYC-PHApse-PCTcp。步驟2)乳酸脫氫酶(LDH)基因和SOS細(xì)胞分裂抑制(sulA)基因的過表達。設(shè)計引物(見表1)從大腸桿菌BL21(DE3)中克隆出乳酸脫氫酶(LDH)基因和SOS細(xì)胞分裂抑制(sulA)基因。分別在基因的上游和下游設(shè)計15bp的同源臂，用同源重組的方法克隆到通用表達質(zhì)粒pTrcHis2B中構(gòu)建表達載體pTrcHis2B-LDH-sulA。其中LDH優(yōu)化基因的序列為SEQIDNO:3。本實施例還對sulA基因的幾個位點進行了突變，具體是L23E,I80E,F106A,C69G,A360G,T495C，突變后的sulA基因的序列為SEQIDNO:4，使其更適應(yīng)大腸桿菌，能在大腸桿菌中穩(wěn)定表達，而且有利于增加底物特異性，提高表達量，加強對FtsZ環(huán)的抑制作用，使細(xì)胞增大，增加聚乳酸產(chǎn)量。表1擴增目的基因的引物序列步驟3)工程大腸桿菌的構(gòu)建。將表達載體PACYC-PHApse-PCTcp和pTrcHis2B-LDH-sulA通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，構(gòu)建生產(chǎn)聚乳酸的工程大腸桿菌。實施例2利用實施例1中構(gòu)建的工程大腸桿菌以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)聚乳酸。使用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)聚乳酸的條件為：在1L發(fā)酵體系中(上海百侖，1L生物反應(yīng)器)使用400mL裝液量，接種量5％，發(fā)酵溫度37℃，pH值控制在6.95，培養(yǎng)基組分見表2，初始葡萄糖添加量為20g/L，攪拌速度為300至600rap/min，溶氧控制在體積濃度為10％-30％，發(fā)酵72h后，離心培養(yǎng)液收集菌體。菌體沉淀用乙醇洗一次，蒸餾水洗兩次，然后再烘干。烘干后的菌體用索氏提取法提取聚乳酸。表2實驗用培養(yǎng)基組成以不同遺傳修飾的工程大腸桿菌(見表3)發(fā)酵聚乳酸的產(chǎn)量見表4。產(chǎn)物用核磁共振氫譜、核磁共振碳譜和紅外分析，1HNMR和13CNMR分別在500MHz和125MHz由BrukerAM-500MHz光譜儀檢測，條件及結(jié)果見圖1-3。表3外源基因的遺傳修飾外源基因氨基酸取代PCTcpV193APHApseE130D,S325T,S477G,Q481K表4不同遺傳修飾下的聚乳酸產(chǎn)量從以上結(jié)果可以看出，丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和PHA合成酶存在的情況下可以合成可提取量的聚乳酸。僅過表達乳酸脫氫酶基因沒有聚合物產(chǎn)生，而與丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和PHA合成酶共同存在的情況下聚乳酸產(chǎn)量大大增加，說明前體乳酸酯的量是決定聚乳酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。過表達sulA基因后，聚乳酸產(chǎn)量明顯增加，說明所構(gòu)建的纖維狀大腸桿菌增大了細(xì)胞內(nèi)空間，從而能增加聚乳酸的產(chǎn)量。以上實施例僅是本發(fā)明若干種優(yōu)選實施方式中的幾種，應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明不限于上述實施例；對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>青島科技大學(xué)<120>一種形態(tài)改變的工程大腸桿菌的構(gòu)建方法、工程大腸桿菌及應(yīng)用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1572<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGCGCAAAGTGCCGATTATTACCGCGGATGAAGCGGCGAAACTGATTAAAGATGGCGAT60ACCGTGACCACCTCAGGCTTTGTGGGCAATGCGATTCCGGAAGCGCTGGATCGCGCGGTG120GAAAAACGCTTTCTGGAAACCGGCGAACCGAAAAATATTACCTATGTTTATTGTGGTAGC180CAGGGTAATCGTGATGGTCGTGGTGCAGAACATTTTGCCCATGAAGGTCTGCTGAAACGT240TATATTGCCGGTCATTGGGCCACCGTTCCGGCCCTGGGTAAAATGGCAATGGAAAATAAA300ATGGAAGCATATAATGTTAGCCAGGGTGCACTGTGTCATCTGTTTCGTGATATTGCAAGC360CATAAACCGGGTGTTTTTACCAAAGTTGGTATTGGTACCTTTATTGATCCGCGTAATGGT420GGCGGCAAAGTGAATGATATTACCAAAGAAGATATTGTGGAACTGGTGGAAATTAAAGGT480CAGGAATATCTGTTTTATCCGGCCTTTCCGATTCATGTGGCGCTGATTCGCGGCACCTAT540GCGGATGAATCAGGCAATATTACCTTTGAAAAAGAAGCCGCCCCGCTGGAAGGTACCAGT600GTTTGTCAGGCTGTGAAAAATTCTGGCGGCATTGTGGTGGTTCAGGTTGAACGTGTTGTT660AAAGCAGGTACCCTGGATCCGCGCCATGTGAAAGTGCCGGGCATTTATGTGGATTATGTG720GTGGTGGCTGATCCGGAAGATCATCAGCAGTCACTGGATTGCGAATATGATCCGGCGCTG780AGCGGTGAACATCGTCGTCCGGAAGTTGTTGGTGAACCGCTGCCGCTGAGTGCCAAAAAA840GTGATTGGCCGCCGCGGCGCGATTGAACTGGAAAAAGATGTGGCGGTGAATCTGGGCGTG900GGCGCCCCGGAATATGTTGCCTCAGTGGCGGATGAAGAAGGCATTGTTGATTTTATGACC960CTGACCGCTGAATCTGGCGCTATTGGTGGTGTTCCGGCAGGCGGCGTGCGCTTTGGCGCC1020AGTTATAATGCCGATGCCCTGATTGATCAGGGTTATCAGTTTGATTATTATGATGGTGGT1080GGTCTGGATCTGTGTTATCTGGGCCTGGCTGAATGCGATGAAAAAGGCAATATTAATGTG1140TCACGCTTTGGCCCGCGTATTGCCGGTTGCGGCGGCTTTATTAATATTACCCAGAATACC1200CCGAAAGTGTTTTTTTGCGGCACCTTTACCGCTGGCGGCCTGAAAGTGAAAATTGAAGAT1260GGTAAAGTTATTATTGTGCAGGAAGGTAAACAGAAAAAATTTCTGAAAGCGGTGGAACAG1320ATTACCTTTAATGGCGATGTGGCCCTGGCCAATAAACAGCAGGTGACCTATATTACCGAA1380CGTTGCGTGTTTCTGCTGAAAGAAGATGGTCTGCATCTGTCAGAAATTGCCCCGGGCATT1440GATCTGCAGACCCAGATTCTGGATGTTATGGATTTTGCTCCGATTATTGATCGCGATGCG1500AATGGCCAGATTAAACTGATGGATGCAGCACTGTTTGCAGAAGGTCTGATGGGCCTGAAA1560GAAATGAAATCA1572<210>2<211>1680<212>DNA<213>人工序列<400>2ATGTCAAATAAAAGCAATGATGAACTGAAATATCAGGCGTCAGAAAATACCCTGGGCCTG60AATCCGGTGGTGGGCCTGCGCGGCAAAGATCTGCTGGCGTCAGCGCGTATGGTGCTGCGC120CAGGCGATTAAACAGCCGGTGCATTCAGTGAAACATGTGGCGCATTTTGGCCTGGAACTG180AAAAATGTGCTGCTGGGCAAATCAGGCCTGCAGCCGACCTCAGATGATCGCCGCTTTGCG240GATCCGGCGTGGTCACAGAATCCGCTGTATAAACGCTATCTGCAGACCTATCTGGCGTGG300CGCAAAGAACTGCATGATTGGATTGATGAATCAAATCTGGCGCCGAAAGATGTGGCGCGC360GGCCATTTTGTGATTAATCTGATGACCGATGCGATGGCGCCGACCAATACCGCGGCCAAT420CCGGCCGCTGTGAAACGCTTTTTTGAAACCGGCGGCAAATCTCTGCTGGATGGCCTGTCT480CATCTGGCTAAAGATCTGGTGCATAATGGCGGTATGCCGAGCCAGGTTAATATGGGTGCA540TTTGAAGTTGGTAAAAGTCTGGGTGTTACCGAAGGTGCCGTTGTTTTTCGTAATGATGTT600CTGGAACTGATTCAGTATAAACCGACCACCGAACAGGTTTATGAACGTCCGCTGCTGGTG660GTGCCGCCGCAGATTAATAAATTTTATGTGTTTGATCTGTCACCGGATAAAAGCCTGGCT720CGCTTTTGCCTGCGCAATAATGTGCAGACCTTTATTGTGTCTTGGCGCAATCCGACCAAA780GAACAGCGTGAATGGGGTCTGAGCACCTATATTGAAGCACTGAAAGAAGCCGTGGATGTG840GTGACCGCCATTACCGGCAGTAAAGATGTTAATATGCTGGGTGCCTGTAGTGGTGGTATT900ACCTGCACCGCTCTGCTGGGCCATTATGCTGCTATTGGCGAAAATAAAGTGAATGCCCTG960ACCCTGCTGGTGACCGTTCTGGATACCACCCTGGATAGCGATGTTGCACTGTTTGTTAAT1020GAACAGACCCTGGAAGCAGCAAAACGTCATAGCTATCAGGCCGGTGTTCTGGAAGGTCGT1080GATATGGCTAAAGTTTTTGCTTGGATGCGTCCGAATGATCTGATTTGGAATTATTGGGTT1140AATAATTATCTGCTGGGTAATGAACCGCCGGTTTTTGATATTCTGTTTTGGAATAATGAT1200ACCACCCGTCTGCCGGCCGCCTTTCATGGCGATCTGGTTGAACTGTTTAAAAATAATCCG1260CTGATTCGTCCGAATGCACTGGAAGTTTGTGGTACCCCGATTGATCTGAAACAGGTTACC1320GCAGATATTTTTAGCCTGGCAGGTACCAATGATCATATTACCCCGTGGAAATCTTGCTAT1380AAATCTGCTCAGCTGTTTGGCGGCAATGTTGAATTTGTTCTGAGTAGTGGTGGTCATATT1440AAAAGCATTCTGAATCCGCCGGGCAATCCGAAAAGTCGTTATATGACCTCTACCGAAGTT1500GCAGAAAATGCAGATGAATGGCAGGCAAATGCCACCAAACATACCGATTCTTGGTGGCTG1560CATTGGCAGGCCTGGCAGGCTCAGCGTTCTGGTGAACTGAAAAAAAGCCCGACCAAACTG1620GGTAGTAAAGCATATCCGGCTGGTGAAGCTGCACCGGGTACCTATGTTCATGAACGTTAA1680<210>3<211>990<212>DNA<213>人工序列<400>3ATGAAGCTGGCGGTGTACAGCACCAAACAGTACGACAAGAAATATCTGCAGCAAGTTAAC60GAGAGCTTCGGTTTTGAGCTGGAATTCTTTGATTTCCTGCTGACCGAGAAGACCGCGAAA120ACCGCGAACGGTTGCGAAGCGGTGTGCATCTTTGTTAACGACGATGGCAGCCGTCCGGTG180CTGGAGGAACTGAAGAAACACGGTGTTAAGTACATTGCGCTGCGTTGCGCGGGCTTCAAC240AACGTGGACCTGGATGCGGCGAAGGAGCTGGGTCTGAAAGTGGTTCGTGTGCCGGCGTAT300GACCCGGAGGCGGTTGCGGAACACGCGATCGGCATGATGATGACCCTGAACCGTCGTATT360CACCGTGCGTACCAGCGTACCCGTGATGCGAACTTCAGCCTGGAAGGTCTGACCGGCTTT420ACCATGTATGGCAAGACCGCGGGCGTGATCGGTACCGGCAAAATTGGTGTTGCGATGCTG480CGTATCCTGAAAGGTTTCGGCATGCGTCTGCTGGCGTTTGACCCGTACCCGAGCGCGGCG540GCGCTGGAGCTGGGCGTGGAATATGTTGACCTGCCGACCCTGTTCAGCGAAAGCGATGTT600ATTAGCCTGCACTGCCCGCTGACCCCGGAGAACTACCACCTGCTGAACGAAGCGGCGTTT660GACCAAATGAAGAACGGTGTGATGATCGTTAACACCAGCCGTGGTGCGCTGATCGACAGC720CAGGCGGCGATTGAGGCGCTGAAGAACCAAAAAATTGGTAGCCTGGGCATGGACGTGTAT780GAGAACGAACGTGACCTGTTCTTCGAAGACAAAAGCAACGATGTGATCCAGGACGATGTT840TTTCGTCGTCTGAGCGCGTGCCACAACGTTCTGTTCACCGGTCACCAAGCGTTTCTGACC900GCGGAGGCGCTGACCAGCATTAGCCAGACCACCCTGCAAAACCTGAGCAACCTGGAGAAG960GGCGAAACCTGCCCGAACGAACTGGTGTAA990<210>4<211>510<212>DNA<213>人工序列<400>4ATGTACACCAGCGGTTATGCGCACCGTAGCAGCAGCTTCAGCAGCGCGGCGAGCAAGATC60GCGCGTGTGAGCACCGAAAACACCACCGCGGGCCTGATTAGCGAAGTGGTTTACCGTGAG120GACCAGCCGATGATGACCCAACTGCTGCTGCTGCCGCTGCTGCAGCAACTGGGTCAGCAA180AGCCGTTGGCAGCTGTGGCTGACCCCGCAGCAAAAGCTGAGCCGTGAATGGGTGCAAGCG240AGCGGTCTGCCGCTGACCAAAGTTATGCAGATCAGCCAACTGAGCCCGTGCCACACCGTG300GAGAGCATGGTTCGTGCGCTGCGTACCGGTAACTACAGCGTGGTTATTGGCTGGCTGGCG360GACGATCTGACCGAGGAAGAGCACGCGGAACTGGTGGATGCGGCGAACGAGGGTAACGCG420ATGGGCTTTATCATGCGTCCGGTTAGCGCGAGCAGCCACGCGACCCGTCAGCTGAGCGGT480CTGAAAATTCACAGCAACCTGTATCACTAA510當(dāng)前第1頁1 2 3