本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，指一類18-22碳，包含兩個或兩個以上不飽和雙鍵的直鏈脂肪酸，在生物細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，例如，作為細(xì)胞膜重要組分，儲存油脂，信號傳導(dǎo)等功能。目前，PUFAs被分為n-6(或ω-6)和n-3(或ω-3)族兩類。在這兩類脂肪酸中，n-3族多不飽和脂肪酸包括亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)，n-6族多不飽和脂肪酸以花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)和亞麻油酸(Gamma-Linolenic Acid，GLA)為主。多不飽和脂肪酸，尤其是n-3族，作為生物活性物質(zhì)，是促進人類健康和動物生長必要營養(yǎng)物質(zhì)。
裂殖壺菌是多不飽和脂肪酸的重要生產(chǎn)菌株，目前已被工業(yè)化生產(chǎn)DHA，其細(xì)胞油脂含量高，生長繁殖快，更耐受機械攪拌，適宜發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)，并已被美國及歐洲有關(guān)食品權(quán)利機構(gòu)批準(zhǔn)添加至相關(guān)食物中使用(Regulation(EC)No 258/97 of European Parliament，2010)。已經(jīng)證明，裂殖壺菌具有PUFA合成酶途徑(類PKS途徑)大量合成多不飽和脂肪酸的能力(Science，2001，293(5528)：290-293；生物工程學(xué)報，2010，26(9)：1225-1231；Progress in lipid research，2014，56：19-35)，但是其PKS基因簇合成和調(diào)控多不飽和脂肪酸的機理仍然未有明確解釋。
羥基脂?；鵄CP脫氫異構(gòu)酶(beta-hydroxydecanoyl-acyl carrier protein(ACP)-dehydratase，F(xiàn)abA)在植物、動物和微生物中廣泛分布，與不飽和脂肪酸合成代謝密切相關(guān)的酶。FabA基因編碼有雙功能的3-羥基脂酰ACP脫水異構(gòu)酶，其異構(gòu)產(chǎn)物能被FabB基因編碼的3-酮基脂酰ACP合成酶I延伸，合成不飽和脂肪酸。該途徑被認(rèn)為是缺氧條件下不飽和脂肪酸合成的經(jīng)典途徑。該脫氫酶基因是多不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵基因之一，裂殖壺菌的PKS基因簇中包含多個脫氫酶(FabA)序列，F(xiàn)abA基因參與了多不飽和脂肪酸合成過程，然而其作用機制目前仍然不清楚。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述構(gòu)建的裂殖壺菌工程菌的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種脫氫異構(gòu)酶(FabA)基因敲除的裂殖壺菌工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
(1)以裂殖壺菌的基因組為DNA模板，用上游引物對和下游引物對分別PCR擴增FabA基因的上游片段UFabA和下游片段DFabA，上述上游引物對包括上游正向引物和上游反向引物，分別如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示，下游引物對包括下游正向引物和下游反向引物，分別如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；
(2)將上游片段UFabA和下游片段DFabA與敲除載體連接，構(gòu)建重組敲除質(zhì)粒；
(3)將上述重組敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化裂殖壺菌，用抗性平板篩選，并經(jīng)PCR抗性基因序列驗證，得轉(zhuǎn)化子，即所述脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌。
FabA基因是編碼羥基脂酰ACP脫水異構(gòu)酶的基因，可以催化葡3-羥基脂酰ACP脫水異構(gòu)，是合成多不飽和脂肪酸的重要步驟，裂殖壺菌的PKS基因中OrfC片段包含兩個FabA基因位點，參與了脂肪酸的合成?；谝陨侠碚摲治?，通過在裂殖壺菌中敲除PKS基因簇中OrfC片段中第二個FabA基因，能夠使其功能被屏障，并可以進一步的對生物體造成影響，進而推測出該基因在裂殖壺菌合成PUFAs過程中的作用，為探究裂殖壺菌中多不飽和脂肪酸合成的機理提供重要幫助。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述敲除載體為pBlu-Zeo。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述PCR擴增的程序包括如下：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重復(fù)(2)～(4)35個循環(huán)；(6)72℃，10min(7)4℃保存。
本發(fā)明的另一技術(shù)方案如下：
一種多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法，用權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述構(gòu)建方法構(gòu)建的裂殖壺菌工程菌進行發(fā)酵生產(chǎn)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包括如下步驟：
(1)將所述裂殖壺菌工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得種子培養(yǎng)液；
(2)將步驟(1)所得的種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，得發(fā)酵液；
(3)將步驟(3)所得的發(fā)酵液中的菌體充分消化，加入正己烷混勻后靜置分層，獲得有機相，接著用正己烷清洗該有機相至無色，最后去除正己烷，即得所述多不飽和脂肪酸。
進一步優(yōu)選的，所述步驟(1)為：將所述裂殖壺菌工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，于27～29℃，180～220rpm培養(yǎng)24～48h，獲得種子培養(yǎng)液。
進一步優(yōu)選的，所述步驟(2)為：將步驟(1)所得的種子培養(yǎng)液以3～5％的體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于27～29℃，180～220rpm培養(yǎng)4～6d，以發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，得發(fā)酵液。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了裂殖壺菌敲除基因的工程菌的構(gòu)建方法構(gòu)，建了敲除FabA基因裂殖壺菌重組菌，該工程菌產(chǎn)多不飽和脂肪酸的能力比出發(fā)菌株中所占總油脂的比例減少了26％，而飽和脂肪酸的生產(chǎn)量增加16％。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例1中重組敲除質(zhì)粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA的PCR驗證結(jié)果圖，其中泳道1位陰性對照，泳道2位重組質(zhì)粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA。
具體實施方式
以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。
實施例1：敲除重組載體質(zhì)粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA的構(gòu)建
設(shè)計PCR引物，用于擴增FabA基因上游片段UFabA。
正反向引物分別為：
正向引物1：GGGGTACCCCTTGCCAGCGATCTTGGACAT(SEQ ID NO 01)
反向引物2：CGCACAAGGGTAAGCTCGTATGGTAGCTACC(SEQ ID NO 02)
設(shè)計PCR引物，用于擴增FabA基因下游片段DFabA。
正反向引物分別為：
正向引物3：CGGGATCCCGTGGAGGCCGAGCCAGAGCAT(SEQ ID NO 03)
反向引物4：GACCAAGAAGCAGGACATCACGCTCGAGC(SEQ ID NO 04)
以Schizochytrium limacinum ATCC 1381(來源于美國ATCC菌株保藏中心)基因組DNA為模板，進行如下PCR程序：(1)94℃，5min；(2)94℃，30s；(3)55℃，30s；(4)72℃，1min；(5)重復(fù)(2)～(4)35個循環(huán)；(6)72℃，10min；(7)4℃保存。
PCR反應(yīng)體系如下表：
將敲除載體pBlu-Zeo(參見公開文獻(xiàn)：
The metabolic burden of cellulase expression by recombinant Saccharomyces cerevisiae Y294in aerobic batch culture.《Applied Microbiology and Biotechnology》，2012，96(1)：197-209以及
Over-expression of native Saccharomyces cerevisiae exocytic SNARE genes increased heterolo gous cellulase secretion.《Applied Microbiology and Biotechnology》，2014，98(12)：5567-5578)用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Cla I雙酶切，回收后，與FabA基因上游片段UFabA以及DNA T4連接酶混合，在4℃下過夜連接反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：
將上述所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒pBlu-UFabA-Zeo，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I雙酶切，回收后，與FabA基因下游片段DFabA以及DNA T4連接酶混合，在4℃下過夜連接反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：
將上述所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，獲得敲除重組載體質(zhì)粒pBlu-UFabA-Zeo-DFabA。
實施例2：裂殖壺菌基因工程菌SchΔFabA的構(gòu)建
將pBlu-UFabA-Zeo-DFabA質(zhì)粒經(jīng)提取及濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化裂殖壺菌，28℃復(fù)蘇2-3h后，涂布博萊霉素抗性平板，再在28℃培養(yǎng)3～5d，篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒提取后，利用PCR進行驗證(如圖1所示)，從而獲得敲除FabA基因的裂殖壺菌重組菌株SchΔFabA。
電轉(zhuǎn)化具體步驟如下：
裂殖壺菌感受態(tài)的制備：
(1)在20mL種子培養(yǎng)基中接種一環(huán)Schizochytrium limacinum，28℃，200rpm過夜培養(yǎng)48h；
(2)取培養(yǎng)液1mL接入20mL種子培養(yǎng)基中，于28℃，200rpm培養(yǎng)至對數(shù)中后期24h；
(3)取5mL培養(yǎng)液于4℃以4200rpm離心收獲細(xì)胞，棄上清；
(4)加入25mL的預(yù)處理劑(20Mm pH 5.8磷酸緩沖液配置25mM的DTT)重懸浮細(xì)胞，于28℃，200rpm震蕩30min；
(5)將處理后的培養(yǎng)液于4℃以4200rpm離心收獲細(xì)胞，棄上清；加入15-20mL預(yù)冷的滅菌水(0℃冰上)水洗兩遍；
(6)再加入15-20mL的1M的山梨醇洗兩遍
(7)最終加入一定量的1M山梨醇重懸，控制細(xì)胞的濃度在106cell/mL。裂殖壺菌感受態(tài)細(xì)胞需要現(xiàn)用現(xiàn)制備，制備好的感受態(tài)細(xì)胞需在1h內(nèi)完成電轉(zhuǎn)。
裂殖壺菌的電轉(zhuǎn)：
(1)將感受態(tài)細(xì)胞和1～5ug質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)移到冰冷的0.1cm間隙的電擊池中；
(2)以2100V、5ms脈沖轉(zhuǎn)化；
(3)迅速往電擊池中加入1mL復(fù)蘇培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)，將菌懸液回收到5mL離心管中，于28℃，200rpm培養(yǎng)3h；
(4)將菌液涂布在抗性平板上，于28℃培養(yǎng)直到平板上出現(xiàn)菌落。
實施例3利用裂殖壺菌及其基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)多不飽和脂肪酸
將裂殖壺菌ATCC1381出發(fā)菌株和實施例2所述的工程菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)24h，制備種子培養(yǎng)液，以4％(V/V)的接種量接種于不飽和脂肪酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，200rpm培養(yǎng)，進行發(fā)酵產(chǎn)多不飽和脂肪酸。5d后分別測定發(fā)酵液總油脂及多不飽和脂肪酸組成(如表1所示)。本發(fā)明構(gòu)建的裂殖壺菌工程菌SchΔFabA產(chǎn)多不飽和脂肪酸的能力比出發(fā)菌株中所占總油脂的比例減少了26％，而飽和脂肪酸的生產(chǎn)量增加16％(如表1所示)。
表1：裂殖壺菌ATCC 1381及其重組菌SchΔFabA總油脂產(chǎn)量和不飽和脂肪酸組分比較表(占總油脂％)，DHA：二十二碳六烯酸，DPA：二十二碳五烯酸
裂殖壺菌總油脂提取純化方法：
(1)準(zhǔn)確吸取3mL發(fā)酵液于10mL具塞試管中，混勻后再加入4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38％的濃鹽酸。于60～70℃水浴加熱40～50min至菌體消化完全。
(2)再加入3～5mL正己烷，加塞充分搖勻，靜置分層，取上層有機相置于已恒重的磨口錐形瓶中。用正己烷重復(fù)洗滌3～5次，直至上層有機相無色。
(3)通過氮吹的方法除去有機溶劑至恒重，計算總油脂(TotaL fatty acid，TFA)產(chǎn)量。
多不飽和脂肪酸鑒定方法：
(1)準(zhǔn)確稱取一定量(約0.1g)的油脂，置于50mL磨口錐形瓶中，加入5mL的0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液于65℃水浴回流至油滴消失(大約10min)，從冷凝管頂部加入5mL 30％的三氟化硼乙醚反應(yīng)30min。
(2)冷卻后加入5mL正己烷振蕩，加入適量內(nèi)標(biāo)物(如十七烷酸甲酯)然后加入足量的飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，過濾，所得樣品即可進行氣象色譜分析。
氣象色譜條件：選用SP2560色譜柱(AvondaLe，PennsyLvania)(30m*0.25mm*0.25m)。采用程序升溫：初始溫度100℃，然后按20℃/min升溫到180℃，再按15℃/min升溫至220℃，保持20min；柱壓13.582psi，進樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測器溫度260℃。
以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
<110> 廈門大學(xué)
<120> 一種脫氫異構(gòu)酶基因敲除的裂殖壺菌工程菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggtacccc ttgccagcga tcttggacat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgcacaaggg taagctcgta tggtagctac c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgggatcccg tggaggccga gccagagcat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaagaag caggacatca cgctcgagc 29