本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病是我國(guó)及全球面臨的最嚴(yán)重、最危急的健康問(wèn)題之一。糖尿病患病人數(shù)逐年遞增，并產(chǎn)生影響終生的并發(fā)癥。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計(jì)，2015年全球約4.15億糖尿病患者，占世界人口比例的8.8％，另有3.18億成年人處于糖耐量受損狀態(tài)，而糖耐量受損是未來(lái)糖尿病發(fā)生的高危因素。中國(guó)人群糖尿病患病率為9.8％，患病人數(shù)約1.10億，未診斷糖尿病患者約0.57億，高居世界首位。值得關(guān)注的是，糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥是致殘、降低生活質(zhì)量和導(dǎo)致早亡的主要原因。2015年我國(guó)死于糖尿病患者高達(dá)129.97萬(wàn)人，用于糖尿病及其并發(fā)癥的醫(yī)療費(fèi)用占總醫(yī)療費(fèi)用的13％，其中糖尿病血管并發(fā)癥是致死及高額醫(yī)療支出的首要原因。Tribblespseudo-kinase3(TRIB3)是一個(gè)假激酶，能與Akt結(jié)合并抑制胰島素介導(dǎo)的Akt磷酸化激活誘導(dǎo)葡萄糖穩(wěn)態(tài)水平的損傷。臨床研究表明TRIB3過(guò)度激活或TRIB3(rs2295490,A>G)基因突變與2型糖尿病患者胰島耐受及其心血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明纈沙坦(降壓藥物)能夠顯著下調(diào)糖尿病心肌肥厚小鼠TRIB3mRNA水平及改善心肌功能。體外研究表明TRIB3(rs2295490,A>G)基因多態(tài)性不影響胰島素介導(dǎo)IR，TIS.1的激活，也不影響TRIB3蛋白水平，但影響Akt(Thr308,Ser473)和eNOS(Ser1177)磷酸激活，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素刺激HUVEC細(xì)胞一氧化氮生成降低3倍左右。近期，我們的大樣本5年隨訪(fǎng)臨床研究表明，TRIB3(rs2295490,A>G)G等位基因頻率為17.1％。對(duì)年齡大于55歲，接受標(biāo)準(zhǔn)糖化血糖控制(遵醫(yī)囑治療，HbA1c約為7.3％)的2型糖尿病患者，AG/GG基因型攜帶者主要大血管及微血管事件患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。相反，接受強(qiáng)化血糖控制(HbA1c≤6.5％)的2型糖尿病患者，主要大血管及微血管事件患病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(IntensivevsStandard*AG/GG:HR＝0.58(0.42–0.79),P＝0.001)。而對(duì)AA基因攜帶者，強(qiáng)化血糖控制并無(wú)顯著心血管疾病獲益(IntensivevsStandard*AA:HR＝1.04(0.83-1.31),P＝0.72)。提示對(duì)該突變位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)2型糖尿病個(gè)體化治療方案制定，心血管疾病獲益預(yù)測(cè)及降低低血糖事件發(fā)生具有重要臨床意義。綜上所述，TRIB3基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)主要大血管及微血管事件顯著相關(guān)，開(kāi)發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性的試劑盒將為2型糖尿病個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：TRIB3基因多態(tài)性是與2型糖尿病并發(fā)主要大血管及微血管事件顯著相關(guān)。本發(fā)明提供一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因TRIB3基因多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：所述焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性的試劑盒包括如下引物：(1)擴(kuò)增引物：TRIB3(rs2295490)上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′(SEQIDNO.1)；TRIB3(rs2295490)下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′(SEQIDNO.2)；其中，下游引物的5'-進(jìn)行生物素標(biāo)記；(2)測(cè)序引物：TRIB3(rs2295490)測(cè)序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′(SEQIDNO.3)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑。所述應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：(1)DNA提??；(2)聚合酶鏈反應(yīng)：配制50μlPCR擴(kuò)增體系，包含：2×Premix25μl，ddH2O23μl，模板2μl，其中，所述2×Premix中含有TRIB3(rs2295490)上游引物和TRIB3(rs2295490)下游引物；然后依次在95℃30S，55℃30S，72℃30S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再在72℃保持5min，最終保持在18℃，得擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；(4)對(duì)經(jīng)步驟(3)處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對(duì)TRIB3(rs2295490)目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測(cè)。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)TRIB3基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床上2型糖尿病并發(fā)癥關(guān)聯(lián)基因TRIB3基因檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。本發(fā)明所述試劑盒可用于制備2型糖尿病心血管并發(fā)癥的預(yù)后判斷試劑。具體實(shí)施方式1、確定TRIB3需要檢測(cè)的具體突變類(lèi)型，通過(guò)檢索獲取突變位點(diǎn)及其附近的堿基序列；2、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)每一個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物，如下：TRIB3(rs2295490)上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′(SEQIDNO.1)；TRIB3(rs2295490)下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′(SEQIDNO.2)；其中，下游引物的5'-進(jìn)行生物素標(biāo)記；TRIB3(rs2295490)測(cè)序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′(SEQIDNO.3)；3、提取待測(cè)血液樣本的DNA并進(jìn)行濃度和純度的質(zhì)檢；4、通過(guò)質(zhì)檢的DNA樣本使用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟如下：(1)操作人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要從冰箱中拿取適量的TRIB3PCR-焦磷酸測(cè)序2×Premix預(yù)混液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求準(zhǔn)備好無(wú)菌的200uL離心管并做好唯一性標(biāo)記；(2)每個(gè)反應(yīng)管按表1所列加入需求的試劑，其中ddH2O可以根據(jù)模板的實(shí)際需要量進(jìn)行調(diào)整：表1將配制好的反應(yīng)管于Eppendorf微量離心機(jī)上短暫離心10秒。(3)將上述反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至核酸制備間內(nèi)。在的專(zhuān)用生物安全柜中往上述反應(yīng)管中添加模板或ddH2O，加樣內(nèi)容參見(jiàn)表2：表2序號(hào)反應(yīng)管名稱(chēng)添加物添加量(uL)1日期-PC陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(100ng/ul)22日期-NTCddH2O23樣品1唯一性編號(hào)樣品1DNA模板2N樣品N唯一性編號(hào)樣品NDNA模板2(3)在擴(kuò)增區(qū)按表3條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：表35、擴(kuò)增后的產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控；6、通過(guò)質(zhì)控的產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，步驟如下：(1)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈樣本純化和與TRIB3測(cè)序引物退火結(jié)合處理。純化后的單鏈模板調(diào)用檢測(cè)程序進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)；(2)依據(jù)軟件給出的Histograms圖，人工對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行基因型判斷，也可以利用軟件自動(dòng)判斷樣本多態(tài)位點(diǎn)的基因型結(jié)果；7、結(jié)果分析：檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4：表4注：在中國(guó)人群中rs2295490的A堿基為野生型推薦治療方案見(jiàn)表5：表5綜上，本發(fā)明所選取的靶序列，以及應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)TRIB3(rs2295490)基因多態(tài)性，能夠滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的要求，利于2型糖尿病個(gè)體化治療方案的制定。SEQUENCELISTING<110>張偉<120>焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)TRIB3基因多態(tài)性的試劑盒及方法<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1gatcgtgcaactgctgtgg19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2tcccaggcctcctgtggt18<210>3<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>3gggcgggcgggccta15當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3