本發(fā)明涉及功能肽的制備以及農(nóng)產(chǎn)品精深加工的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種麥胚蛋白源鈣螯合肽的方法。

背景技術(shù)：

由于我國(guó)的飲食結(jié)構(gòu)中植物性食品所占的比例較高，經(jīng)常產(chǎn)生缺鈣現(xiàn)象，尤其是兒童、孕婦以及老人，因此補(bǔ)鈣成為國(guó)內(nèi)學(xué)者研究中的重要課題。目前，市面上的補(bǔ)鈣制劑主要為無(wú)機(jī)鈣、有機(jī)鈣、氨基酸鈣。無(wú)機(jī)鈣(如碳酸鈣、磷酸鈣、氯化鈣等)，這類補(bǔ)鈣劑在胃腸道中穩(wěn)定性和溶解性差，吸收利用率低，對(duì)胃有刺激作用；有機(jī)鈣(如乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣等)，這類補(bǔ)鈣劑鈣含量低，總體利用率不高；氨基酸鈣(如甘氨酸鈣、谷氨酸鈣等)，這類補(bǔ)鈣劑鈣吸收率顯著提高，但易被植酸沉淀，有促進(jìn)脂肪的氧化的不利影響；肽-鈣，作為新一代的補(bǔ)鈣產(chǎn)品有明顯的優(yōu)勢(shì)，鈣離子借助小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收機(jī)制以螯合物的形式被小腸吸收，不僅加速鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且耗能較少，顯著促進(jìn)鈣的利用率。目前，關(guān)于肽-鈣的研究主要集中于動(dòng)物蛋白，對(duì)植物蛋白的研究較少，但是，動(dòng)物蛋白成本高，存在潛在的過(guò)敏源，所以迫切需要開發(fā)植物源的蛋白用于肽-鈣的制備。

小麥胚芽是面粉加工業(yè)的副產(chǎn)物(蘊(yùn)藏量達(dá)到200～300萬(wàn)噸)，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪、維生素以及礦物元素，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“人類天然的營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”，其中蛋白質(zhì)含量占30％左右，是一種完全蛋白，必需氨基酸配比與WHO/FAO推薦的模式值基本接近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與雞蛋蛋白媲美。麥胚蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白。其中，球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的溶解性不好，在一定程度上限制了麥胚蛋白的綜合利用，造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染。為了節(jié)糧減損，增加麥胚的附加值，我們嘗試采用電子束輻照處理結(jié)合酶法以及分離純化的方法，制備高親和鈣的麥胚多肽?；诒景l(fā)明制備的麥胚多肽-鈣離子螯合物，不僅補(bǔ)充了鈣元素和氨基酸，而且對(duì)小麥胚芽進(jìn)行了精深加工有重要的經(jīng)濟(jì)和理論意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種電子束輻照聯(lián)合酶法分離純化高親和鈣的麥胚多肽的方法。本發(fā)明不僅能在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的活性肽，促進(jìn)了麥胚蛋白的綜合利用，而且，利用麥胚多肽制備的鈣螯合肽能借助小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收機(jī)制被小腸快速大量的吸收，顯著提高了鈣的利用率。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

(一)一種電子束輻照聯(lián)合酶法分離純化高親和鈣的麥胚多肽，多肽的氨基酸序列為Phe-Val-Asp-Val-Thr。

(二)一種電子束輻照聯(lián)合酶法分離純化高親和鈣的麥胚多肽，包括以下步驟：

(1)以脫脂麥胚為原料，參考?jí)A溶酸沉的方法提取麥胚分離蛋白，提取條件為：脫脂麥胚粉以料液比1:10分散于去離子水中，將分散液的pH調(diào)到pH為9.0～9.5，恒溫40～45℃攪拌2h，離心獲得上清液，將上清液pH調(diào)到pH為4.0～4.5來(lái)沉淀蛋白，將蛋白離心后調(diào)回pH為7.0，獲得麥胚分離蛋白并冷凍干燥備用。

(2)麥胚分離蛋白干粉與去離子水按料液比10～40％(w/v)混合均勻，形成懸濁液，添加堿液調(diào)成弱堿性(pH為7.5～8.5)，將懸濁液密封于透明、耐輻照的密封袋中，懸濁液的厚度控制在1～2cm。

(3)利用電子束輻照技術(shù)對(duì)上述的蛋白懸濁液進(jìn)行改性，改性條件為：輻照劑量為1～10kGy，輻照條件為1.5～5.0MeV/20～40mA。

(4)輻照過(guò)后的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解，得到麥胚蛋白酶解產(chǎn)物。水解條件為：蛋白濃度2～5％，酶解pH為8.0～8.5、溫度50～60℃、酶與蛋白的重量配比為1:50～1:100。

(5)酶解產(chǎn)物首先利用超濾過(guò)程進(jìn)行分離，截取<1kDa、1～3kDa、>3kDa的組分，分別收集各組分。

(6)收集超濾后的鈣螯合率最高的組分，通過(guò)DEAE-FF 16/10陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5M NaCI的Tris-HCl，流速為5mL/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測(cè)量，透析脫鹽。

(7)收集經(jīng)過(guò)陰離子交換色譜分離得到的鈣螯合率最高的組分，通過(guò)Superdex Peptide 10/300凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5mL/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測(cè)定。

(8)收集經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾色譜分離獲得的鈣螯合率最高的組分，通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離，分離條件是用5-30％乙睛溶液作為梯度洗脫液，流速lmL/min，洗脫液自含體積比為5％乙睛和95％水的混合液開始，至體積比為30％乙睛和70％水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：當(dāng)用電子束輻照技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)懸濁液進(jìn)行改性時(shí)，電子束會(huì)誘導(dǎo)其中的水分子發(fā)生裂解，生成自由基、離子、激發(fā)分子等大量活性粒子。這些活性粒子往往具有一個(gè)或者幾個(gè)不配對(duì)電子，因此化學(xué)性質(zhì)非常不穩(wěn)定，容易攻擊蛋白質(zhì)等其他生物大分子，促使蛋白分子發(fā)生脫氨、脫羧、氨基酸氧化、二硫鍵的斷裂或重建、肽鏈的降解或交聯(lián)、疏水集團(tuán)外露等一系列反應(yīng)，使得蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白分子間的聚集方式發(fā)生變化。改性后的蛋白質(zhì)在粘度、溶解度等方面上都會(huì)產(chǎn)生很大的變化，這些改變都將在一定程度上有利于生物酶的作用，加快酶的水解，縮短酶解時(shí)間，提高蛋白的水解度，進(jìn)而產(chǎn)生大量的功能肽。這些功能肽進(jìn)一步分離純化可以獲得螯合率顯著提高的親鈣的麥胚多肽。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中DEAE-FF 16/10陰離子交換色譜的分析圖譜；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中Superdex Peptide 10/300凝膠過(guò)濾色譜的分析圖譜；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中RP-HPLC的分離圖譜。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中Phe-Val-Asp-Val-Thr的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1

(1)麥胚分離蛋白提?。好撝溑叻?購(gòu)于河南安陽(yáng)漫天雪有限公司)以料液比1:10(w/v)分散于去離子水中，將分散液的酸堿度恒定在pH9.5，恒溫40℃攪拌2h，5000rpm離心10min獲得上清液，上清液調(diào)到pH4.0沉淀蛋白，蛋白水洗2次并將pH調(diào)到中性，冷凍干燥后得麥胚分離蛋白。

(2)麥胚分離蛋白粉與去離子水按料液比40％(w/v)混合，添加堿液，形成弱堿性的懸濁液(pH8.0)，懸濁液密封于透明的密封袋中，厚度控制在1～2cm。

(3)蛋白懸濁液置于傳送帶上，于電子加速器下輻照，輻照劑量1kGy，輻照條件5.0MeV/20mA。

(4)輻照過(guò)后的蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解，得到麥胚多肽混合物。水解條件為：蛋白濃度5％(w/v)，酶解pH8.0，溫度50℃，酶與蛋白的重量配比為1:100，水解3h。水解完成后，酶解液于沸水中煮10min，冷卻后5000rpm離心10min，收集上清液冷凍干燥備用。

(5)將(4)中酶解產(chǎn)物通過(guò)超濾過(guò)程分離，超濾過(guò)程為：酶解產(chǎn)物重新溶解后制成10mg/ml的多肽溶液，選取1kDa、3kDa的濾膜用PALL超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾，收集<1kDa、1～3kDa、>3kDa的組分。

(6)將(5)中鈣螯合率最高的組分置于DEAE-FF 16/10陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5M NaCI的20mM Tris-HCl(pH7.5)，流速為5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)量。

(7)將(6)中鈣螯合率最高的組分置于Superdex Peptide 10/300凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)定。

(8)將(7)中鈣螯合率最高的組分通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離，分離條件是用5-30％乙睛溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液由5％乙睛和95％水的混合液開始，到30％乙睛和70％水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集鈣螯合率最高的組分，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析儀得出多肽序列。

實(shí)施例2

(1)麥胚分離蛋白提?。好撝溑叻?購(gòu)于河南安陽(yáng)漫天雪有限公司)以料液比1:10(w/v)分散于去離子水中，將分散液的酸堿度恒定在pH9.5，恒溫40℃攪拌2h，5000rpm離心10min獲得上清液，上清液調(diào)到pH4.0沉淀蛋白，蛋白水洗2次并將pH調(diào)到中性，冷凍干燥后得麥胚分離蛋白。

(2)麥胚分離蛋白粉與去離子水按料液比10％(w/v)混合，添加堿液，形成弱堿性的懸濁液(pH8.5)，懸濁液密封于透明的密封袋中，厚度控制在1～2cm。

(3)蛋白懸濁液置于傳送帶上，于電子加速器下輻照，輻照劑量5kGy，輻照條件5.0MeV/20mA。

(4)輻照過(guò)后的蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解，得到麥胚多肽混合物。水解條件為：蛋白濃度2％(w/v)，酶解pH8.5，溫度60℃，酶與蛋白的重量配比為1:80，水解3h。水解完成后，酶解液于沸水中煮10min，冷卻后5000rpm離心10min，收集上清液冷凍干燥備用。

(5)將(4)中酶解產(chǎn)物通過(guò)超濾過(guò)程分離，超濾過(guò)程為：酶解產(chǎn)物重新溶解后制成10mg/ml的多肽溶液，選取1kDa、3kDa的濾膜用PALL超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾，收集<1kDa、1～3kDa、>3kDa的組分。

(6)將(5)中鈣螯合率最高的組分置于DEAE-FF 16/10陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5M NaCI的20mM Tris-HCl(pH7.5)，流速為5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)量。

(7)將(6)中鈣螯合率最高的組分置于Superdex Peptide 10/300凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)定。

(8)將(7)中鈣螯合率最高的組分通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離，分離條件是用5-30％乙睛溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液由5％乙睛和95％水的混合液開始，到30％乙睛和70％水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集鈣螯合率最高的組分，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析儀得出多肽序列。

實(shí)施例3

(1)麥胚分離蛋白提?。好撝溑叻?購(gòu)于河南安陽(yáng)漫天雪有限公司)以料液比1:10(w/v)分散于去離子水中，將分散液的酸堿度恒定在pH9.5，恒溫40℃攪拌2h，5000rpm離心10min獲得上清液，上清液調(diào)到pH4.0沉淀蛋白，蛋白水洗2次并將pH調(diào)到中性，冷凍干燥后得麥胚分離蛋白。

(2)麥胚分離蛋白粉與去離子水按料液比25％(w/v)混合，添加堿液，形成弱堿性的懸濁液(pH7.5)，懸濁液密封于透明的密封袋中，厚度控制在1～2cm。

(3)蛋白懸濁液置于傳送帶上，于電子加速器下輻照，輻照劑量10kGy，輻照條件5.0MeV/20mA。

(4)輻照過(guò)后的蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解，得到麥胚多肽混合物。水解條件為：蛋白濃度5％(w/v)，酶解pH8.0，溫度50℃，酶與蛋白的重量配比為1:50，水解3h。水解完成后，酶解液于沸水中煮10min，冷卻后5000rpm離心10min，收集上清液冷凍干燥備用。

(5)將(4)中酶解產(chǎn)物通過(guò)超濾過(guò)程分離，超濾過(guò)程為：酶解產(chǎn)物重新溶解后制成10mg/ml的多肽溶液，選取1kDa、3kDa的濾膜用PALL超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾，收集<1kDa、1～3kDa、>3kDa的組分。

(6)將(5)中鈣螯合率最高的組分置于DEAE-FF 16/10陰離子交換色譜進(jìn)行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5M NaCI的20mM Tris-HCl(pH7.5)，流速為5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)量。

(7)將(6)中鈣螯合率最高的組分置于Superdex Peptide 10/300凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.5mL/min，洗脫峰在214nm處進(jìn)行測(cè)定。

(8)將(7)中鈣螯合率最高的組分通過(guò)RP-HPLC進(jìn)行分離，分離條件是用5-30％乙睛溶液作為梯度洗脫液，流速為lmL/min，洗脫液由5％乙睛和95％水的混合液開始，到30％乙睛和70％水的混合液結(jié)束，進(jìn)行梯度洗脫，收集鈣螯合率最高的組分，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析儀得出多肽序列。

圖1為麥胚多肽DEAE-FF陰離子交換色譜圖，經(jīng)陰離子柱純化得到3個(gè)峰，其中峰F2的鈣離子螯合性最強(qiáng)，收集該峰用于凝膠柱的分離。圖2為麥胚多肽凝膠過(guò)濾色譜圖，經(jīng)凝膠柱純化得到4個(gè)峰，其中峰F22的鈣離子螯合性最強(qiáng)，收集該峰用于反相高效液相的分離。圖3為麥胚多肽反相高效液相色譜圖，經(jīng)反相柱純化主要得到2個(gè)峰，其中峰2的鈣離子螯合性最強(qiáng)，收集該峰用于多肽的測(cè)序。圖4為L(zhǎng)C-ESI/MS圖，經(jīng)過(guò)LC-ESI/MS的結(jié)果，鑒定出多肽的氨基酸序列是Phe-Val-Asp-Val-Thr。各步驟中最高組分鈣的螯合率如表1所示。

表1各分離純化步驟中最高組分鈣的螯合率

實(shí)施例3中得到的Phe-Val-Asp-Val-Thr比麥胚蛋白水解混合物，鈣的螯合率提高了86.37％。

《海洋骨膠原低聚肽鈣的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定》(劉文穎，任瑋等食品工業(yè)科技，2015年第4期)中，提供了其經(jīng)反向色譜初步純化后，鈣螯合率為51.38％±0.09％。本發(fā)明的螯合率數(shù)值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于該技術(shù)。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例?？梢岳斫?，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。