本發(fā)明屬于生物檢測領域，更具體地，涉及同時檢測大鼠五種病原體的引物組、試劑盒及多重免疫熒光分析方法。

背景技術：

實驗動物微生物質量檢測是評價實驗動物質量的重要指標，微生物感染不僅對實驗動物本身造成危害，對科研工作也造成潛在干擾。實驗大鼠病原微生物多呈隱性感染，沒有明顯的臨床癥狀，疫病診斷比較困難。而且動物感染病原體往往表現(xiàn)為持續(xù)性感染，設施一旦存在病原體感染比較難清除，需要通過檢測和淘汰(test-and-removal)方法才能從受污染的設施徹底根除病原體，因此，建立快速高效的實驗動物病原體檢測方法，及時準確地發(fā)現(xiàn)病原感染，控制及清除疫情，對于提高實驗動物質量非常重要。

我國實驗動物國家標準GB14922.2-2011中規(guī)定的SPF級大鼠需排除21種病原微生物。本發(fā)明中的大鼠冠狀病毒/涎淚腺炎病毒(Rat coronavirus，RCV)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice，PVM)、肺支原體(Mycoplasma pulmonis，M.pulmonis)是國家標準需要排除的病原。大鼠泰勒病毒(Rat theilovirus，RTV)和小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV)是新發(fā)現(xiàn)的感染實驗大鼠的病毒，我們調查發(fā)現(xiàn)普通環(huán)境下飼養(yǎng)的大鼠中RTV、TMEV的感染率分別為37.6％(n＝101)和24.8％(n＝101)。這兩種病毒是國外實驗動物健康監(jiān)測的一個必檢項目，我國實驗動物國家標準中雖然尚未把RTV和TMEV列入檢測項目，但是一些實驗動物生產或使用單位、以及一些CRO公司都把其列為篩查項目。

目前，國內病毒感染診斷方法主要是針對抗體檢測的血清學檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫酶試驗(IEA)和免疫熒光試驗(IFA)等，但是這些方法中不能應用于免疫功能低下或免疫缺陷大鼠的檢測，因為它們不能產生正常的抗體反應?？乖瓩z測方面常規(guī)病毒分離鑒定方法既復雜又繁瑣，不利于日常檢測。傳統(tǒng)的檢測技術已不能滿足實驗動物質量檢測需求，以PCR為基礎的分子生物學診斷方法檢測病毒具有快速、靈敏、特異等特點，是目前臨床上檢測和診斷疾病的常用檢測方法。但普通PCR方法需要開蓋對產物進行凝膠電泳分析，操作方法不夠簡化，而且容易產生氣溶膠污染，導致出現(xiàn)假陽性。實時熒光定量PCR技術因高精確度，高靈敏性，污染少等優(yōu)點是目前病毒感染診斷的重要手段。但實時熒光PCR技術受到熒光種類及儀器自身的限制，最多只能對5個靶標進行檢測，且實驗成功的難度極大，成本也相對較高。

Luminex液相芯片技術是20世紀90年代興起的一種新型的多重熒光免疫分析方法，該技術有機地整和了熒光編碼微球技術、激光分析技術、流式細胞技術、高速數(shù)字信號處理技術、計算機運算法則等多項技術。與傳統(tǒng)的臨床檢測方法相比，其主要優(yōu)點在于可以自由組合、高通量、靈敏度高、重復性好、檢測范圍廣、反應速度快、低成本、操作簡便，既能檢測蛋白又能檢測核酸等。本發(fā)明利用Luminex液相芯片技術建立一種同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的多重免疫熒光分析方法，可應用于實驗大鼠的質量監(jiān)測、流行病學調查及早期預警。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的引物組、試劑盒及多重免疫熒光分析方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的引物組，包括6對引物，所述6對引物是通過對6對原始引物進行修飾而成；所述修飾為每對原始引物中的一條原始引物的5’端與對應的tag序列的3’端通過間臂連接，另一條原始引物的5’端添加生物素標記；

所述的原始引物對如下：

RTV原始上游引物：5’-GGAAACTTAGAGCAGACATCG-3’，

RTV原始下游引物：5’-TCCACAGAGAACAACCATCG-3’，

TMEV原始上游引物：5’-CGTTGGAAAAGCACCTCTCAC-3’，

TMEV原始下游引物：5’-TCGGAGTCGGTTGACTTAGAT-3’，

RCV原始上游引物：5’-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT-3’，

RCV原始下游引物：5’-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG-3’，

PVM原始上游引物：5’-GCTGGCATTCCACATAACC-3’，

PVM原始下游引物：5’-CCCACAAGGTACACGGAGA-3’，

M.pulmonis原始上游引物：5’-GGAAATGCCCTAAGTATGACGG-3’，

M.pulmonis原始下游引物：5’-CGGATAACGCTTGCACCCTA-3’，

內標MS2原始上游引物：5’-CGCAGAATCGCAAATACAC-3’，

內標MS2原始下游引物：5’-TAACAATAAGCTCGCAGTCG-3’；

所述的tag序列如下：

RTV的tag序列為：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’，

TMEV的tag序列為：5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’，

RCV的tag序列為：5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’，

PVM的tag序列為：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’，

M.pulmonis的tag序列為：5’-TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-3’，

內標MS2的tag序列為：5’-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3’。

進一步的，所述間臂為12～18個原子的引物中間修飾物。

優(yōu)選的，所述間臂為六乙二醇間臂。

同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的引物組、6種編碼不同熒光色的熒光編碼微球，所述的獨立熒光編碼微球含有與上述引物中tag序列互補配對的anti-tag序列。

進一步的，上述試劑盒還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復合物、RT-PCR擴增試劑、內標MS2標準品、混合陽性對照、陰性對照，所述混合陽性對照為同時含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品；所述陰性對照為不含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品。

同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的多重免疫熒光分析方法，包括如下步驟：

1)從樣品中提取病原體RNA或DNA，作為模板，同時設置空白對照、陰性對照、混合陽性對照；所述空白對照為不添加模板；所述陰性對照為以不含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品為模板；所述混合陽性對照為以同時含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品為模板；

2)在樣品中加入內標MS2的核酸作為質控，用上述試劑盒內的引物組進行RT-PCR擴增；

3)將擴增產物、上述試劑盒內的6種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

4)雜交結束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產物進行檢測分析，讀取不同病原體的MFI值；

5)結果判斷：當樣本的MFI值/空白對照的MFI值≥3.0時，判為陽性，否則判為陰性；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進一步的，步驟2)中，RT-PCR擴增的20μL反應體系含有：5×buffer4μL、dNTP0.8μL、Enzyme mix0.8μL、引物組內每對引物混合液(10μM)各0.4μL、模板4μL、無RNase水8μL。

進一步的，步驟2)中，RT-PCR擴增的反應程序為：48～52℃反轉錄25～35min；95℃預變性15min；94℃變性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

進一步的，步驟3)中，雜交的100μL反應體系含有：6種編碼不同熒光色的熒光編碼微球20μL、鏈霉親和素-藻紅蛋白75μL、擴增產物5μL。

進一步的，步驟3)中，雜交的反應程序為：43～47℃反應20～30min。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明將多重PCR技術和Luminex液相芯片技術相結合，設計了一種可同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis這五種病原體的引物組，利用該引物組通過特定PCR獲得目標擴增產物，然后將擴增產物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交，通過Luminex檢測儀讀取MFI值時，從而分辨不同類型的病原體。該方法具有快速高效、特異性強、靈敏度高、重復性好等有益效果，可應用于實驗大鼠的質量監(jiān)測、流行病學調查及早期預警。具體如下：

1)目前實驗動物常規(guī)檢測方法均是單一項目檢測，無法一次檢測多種病原，與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明方法實現(xiàn)了對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行檢測，實現(xiàn)高通量檢測，而且可以根據(jù)病原的增多靈活增加檢測項目；同時樣本用量少，操作簡單、快速，可大大降低檢測成本。

2)通過特異性微球探針捕獲PCR產物，優(yōu)于傳統(tǒng)多重檢測方法用PCR產物片段長度進行結果判斷，檢測特異性更強。

3)液相芯片利用生物素-親和素信號放大系統(tǒng)，其親和力高達10¹⁵L/moL，比單純的抗體親和力高10⁴倍以上，使檢測結果更靈敏、受環(huán)境干擾較小、穩(wěn)定性高；本發(fā)明方法的檢測靈敏度比普通PCR高1～2個數(shù)量級。

4)Luminex液相芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，大大提高了樣品檢測的重復性，檢測結果可靠穩(wěn)定；檢測的重復性往往可以達到90％以上，并且線性范圍也很寬。

5)本發(fā)明靈活性好，可以根據(jù)需要在此基礎上加減檢測病原的種類。

附圖說明

圖1：同時檢測5種大鼠病原體的RT-PCR電泳圖【1：RTV，2：TMEV，3：RCV，4：PVM，5：M.pulmonis，6：IC，7：混合陽性對照模板，8：空白對照，M：DL500DNA marker】；

圖2：同時檢測5種大鼠病原體的多重熒光免疫分析方法檢測實驗結果圖；

圖3：同時檢測5種大鼠病原體的多重熒光免疫分析方法檢測特異性實驗結果圖；

圖4：同時檢測5種大鼠病原體的多重熒光免疫分析方法檢測靈敏度實驗結果圖；

圖5：同時檢測5種大鼠病原體的多重熒光免疫分析方法臨床樣本檢測實驗結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。下述實施例中所述試劑原料除特別注明來源外，均為市售的常見原料，試劑的配制采用常規(guī)方法。實施例中未詳述的方法均為本領域常規(guī)操作。

實施例1、同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的引物組

根據(jù)發(fā)明目的，對大量序列進行分析比較，篩選出下述病毒的特異性保守序列：RTV的5’UTR基因序列(GenBank登錄號：EU542581)，TMEV的5’UTR基因序列(GenBank登錄號：X56019)，RCV的N基因序列(GenBank登錄號：AF088984)，PVM的NS1基因序列(GenBank登錄號：AY743910)、M.pulmonis的16sRNA基因序列(GenBank登錄號：AF125582)和MS2的包膜蛋白基因序列(GenBank登錄號：NC001417，用作內標，internal control，簡稱IC)。

根據(jù)核酸序列設計引物，并進行引物二級結構及互相之間形成引物二聚體的能力進行評價。本發(fā)明在設計引物時遵循以下設計原則：引物長度為18～25bp，上下游引物之間不超過5bp，盡量使G+C含量在40％～60％間，引物自身不能有連續(xù)的4個堿基互補，盡量避免形成二聚體結構、發(fā)卡結構，擴增的片段大小選擇在100～250bp之間，這樣有利于減少Luminex微球雜交反應時的位阻效應，更有利于后續(xù)雜交反應的進行；同時，發(fā)明人也對tag序列形成引物二聚體的能力進行了分析，選擇了與原始引物序列最合適的tag序列。

由于多重PCR體系中多個引物和模板在同一個反應管里，很容易造成互相干擾，并且引物之間很容易會形成二聚體，生物素化的引物形成二聚體后，在鏈霉親和素-藻紅蛋白作用后也會激發(fā)出很強的熒光信號，這樣就會產生很高的陰性背景熒光，影響結果的判定，甚至導致試驗失敗。因此引物設計是本發(fā)明的關鍵，也是進行Luminex液相芯片檢測的基礎。

發(fā)明人對所設計的引物經過了大量的試驗和改進，才克服了上述多重PCR引物設計的難點，優(yōu)選出如下引物組，其用于多重熒光免疫同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis病原體的特異性和靈敏度最好，該優(yōu)選引物組由下述原始引物對進一步修飾而成。

原始引物對的堿基序列如下：

RTV原始上游引物：5’-GGAAACTTAGAGCAGACATCG-3’(SEQ ID NO：1)，

RTV原始下游引物：5’-TCCACAGAGAACAACCATCG-3’(SEQ ID NO：2),

TMEV原始上游引物：5’-CGTTGGAAAAGCACCTCTCAC-3’(SEQ ID NO：3)，

TMEV原始下游引物：5’-TCGGAGTCGGTTGACTTAGAT-3’(SEQ ID NO：4),

RCV原始上游引物：5’-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT-3’(SEQ ID NO：5)，

RCV原始下游引物：5’-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG-3’(SEQ ID NO：6),

PVM原始上游引物：5’-GCTGGCATTCCACATAACC-3’(SEQ ID NO：7)，

PVM原始下游引物：5’-CCCACAAGGTACACGGAGA-3’(SEQ ID NO：8),

M.pulmonis原始上游引物：5’-GGAAATGCCCTAAGTATGACGG-3’(SEQ ID NO：9)，

M.pulmonis原始下游引物：5’-CGGATAACGCTTGCACCCTA-3’(SEQ ID NO：10),

內標MS2原始上游引物：5’-CGCAGAATCGCAAATACAC-3’(SEQ ID NO：11)，

內標MS2原始下游引物：5’-TAACAATAAGCTCGCAGTCG-3’(SEQ ID NO：12)；

為了對大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis病原體進行區(qū)分，故將上述引物作進一步的修飾，以滿足相應的操作要求。在各條原始上游引物的5’端連接相應的tag序列，其中tag序列的3’端和引物序列的5’端之間通過六乙二醇間臂連接。

所連接的tag序列如下：

RTV的tag序列為：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’(SEQ ID NO：13)；

TMEV的tag序列為：5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’(SEQ ID NO：14)；

RCV的tag序列為：5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’(SEQ ID NO：15)；

PVM的tag序列為：5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’(SEQ ID NO：16)；

M.pulmonis的tag序列為：5’-TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-3’(SEQ ID NO：17)；

內標MS2的tag序列為：5’-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3’(SEQ ID NO：18)。

另外，各條原始下游引物的5’端還添加有生物素標記。

實施例2、同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的試劑盒

試劑盒包括以下組分：

1)實施例1所設計的同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis病原體的引物組；

2)6種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應地與多重熒光免疫分析引物中的tag序列互補配對；6種微球均購自luminex公司，其中RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis和IC分別對應的熒光編碼微球號為MTAG-A034、MTAG-A046、MTAG-A028、MTAG-019、MTAG-029和MTAG-036；

3)鏈霉親和素-藻紅蛋白復合物、RT-PCR擴增試劑、內標MS2標準品、混合陽性對照、陰性對照；所述RT-PCR擴增試劑含有5×buffer、dNTP、Enzyme mix；所述混合陽性對照為同時含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品；所述陰性對照為不含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的核酸樣品。

實施例3、同時檢測大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的多重熒光免疫分析方法的建立

(1)核酸提取

用核酸自動抽取儀(天根公司)分別提取RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的RNA或DNA，作為多重熒光免疫分析檢測方法的模板。其中內標MS2標準品加到各個樣品中，同步參與樣品核酸的提取、加樣、RT-PCR擴增及信號檢測的全過程。

(2)質粒標準品的制備

以RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體的RN或DNA為模版，分別用實施例1所設計的原始引物組中相應的原始引物對進行RT-PCR擴增，將擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段連接至pMD-19T載體，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，用含有Amp的LB瓊脂平板篩選陽性克隆，用PCR鑒定陽性克隆菌，并對陽性重組質粒測序驗證。用質粒提取試劑盒提取質粒，微量紫外分光光度計測定濃度與純度，根據(jù)下面的公式計算拷貝數(shù)?？截悢?shù)(copies/μL)＝6.022×10²³(copies/moL)×DNA濃度(g/μL)/質量MW(g/moL)。其中，MW＝DNA堿基數(shù)(bp)×660daltons/bp，DNA堿基數(shù)＝載體序列堿基數(shù)+插入序列堿基數(shù)。

(3)多重RT-PCR擴增

用實施例1所設計的引物組，分別對RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis和MS2(內標)進行多重RT-PCR擴增，多重RT-PCR試劑采用Qiangen公司的OneStep RT-PCR Kit，每次試驗同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照，其中陽性對照以含有上述五種病原體的組織或細胞培養(yǎng)物提取的核酸作為陽性對照模板，其中陰性對照以不含有上述五種病原體核酸樣品(可以是正常動物組織或正常細胞培養(yǎng)物)作為陰性對照模板，空白對照即為不加模板對照(No Template Control，NTC)，即在反應中用水來代替模板。

RT-PCR擴增反應體系如下：

擴增的反應程序為：50℃反轉錄30min；95℃預變性15min；94℃變性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，其電泳圖如圖1所示，可見均擴增出目的條帶。

(4)雜交

將多重RT-PCR產物、熒光編碼微球、鏈霉親和素藻紅蛋白(SA-PE)雜交，包括以下步驟：

所述熒光編碼微球是包被有特異的anti-tag序列的6種微球，其中anti-tag序列能相應地與RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五種病原體和內標MS2引物上的tag序列互補配對。6種微球均購自luminex公司，具體的RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis和IC分別對應的熒光編碼微球號為MTAG-A034、MTAG-A046、MTAG-A028、MTAG-019、MTAG-029和MTAG-036。

熒光編碼微球工作液的制備：將2500個/μL熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到1μL約含有125個/種熒光編碼微球。

SA-PE工作液制備：將1mg/mL SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到10μg/μL。

充分重懸熒光編碼微球工作液，每個樣品孔和對照孔加入微球工作液20μL，隨后樣品孔中加入5μL PCR產物，對照孔中也分別加入5μL PCR陽性對照、陰性對照和空白對照產物，最后加入75μL的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中45℃孵育25min。

依照Luminex 200檢測儀的說明將雜交后的50μL上述反應液進行檢測，結果如圖2所示。檢測儀讀取五種病原體的MFI值時，可以明顯分辯不同類型的病原體。

結果判斷標準：當樣本的MFI值大于等于空白對照的MFI值的3倍，即樣本的MFI值/空白對照的MFI值≥3.0時判為陽性，否則判為陰性。

實施例4、特異性試驗

分別用RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis、小鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)和小鼠細小病毒MVM株(MVM)、小鼠諾如病毒(MNV)、小鼠細小病毒MPV株(MPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺病毒(SV)、小鼠出血熱病毒(HV)、鼠痘病毒(Ect)、多瘤病毒(Poly)、小鼠腺病毒(Mad)、大鼠細小病毒KRV株(KRV)、大鼠細小病毒H-1株(H-1)、和小鼠巨細胞病毒(MCMV)的RNA或DNA作為模板進行多重熒光免疫分析檢測，各樣品添加內標MS2作為質控，同時設置陰性對照和空白對照，用實施例3建立的多重熒光免疫檢測分析方法進行檢測。

實驗結果如圖3所示，IC對照成立，根據(jù)判斷標準：樣本的MFI值/空白對照的MFI值≥3.0時判為陽性，否則判為陰性，只有RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis為陽性，且不存在交叉反應，其他病原體均為陰性，說明本發(fā)明方法及試劑盒特異性好。

實施例5、靈敏度試驗

將制備的RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis五個病原體的質粒標準品用Easy dilution(Takara公司)做10倍系列稀釋，得到1×10⁷～1×10⁰copies/μL系列標準模板，用上述建立的多重熒光免疫分析方法進行檢測。

表1多重熒光免疫分析靈敏度檢測結果

多重熒光免疫分析檢測靈敏度實驗結果如表1和圖4所示，實驗結果表明RTV、TMEV、RCV、PVM、M.pulmonis的最低檢測限為1×10²copies/μL。

實施例6、臨床樣品的檢測

待測樣本為廣東地區(qū)收集的24份大鼠樣本(編號為1-24)，提取大鼠臟器和盲腸內容物的RNA/DNA，各樣品添加內標MS2作為質控，同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照，采用上實施例3建立的多重熒光免疫檢測分析方法進行檢測。

實驗結果如圖5所示，IC對照成立，根據(jù)判斷標準：樣本的MFI值/空白對照的MFI值≥3.0時判為陽性，否則判為陰性，結果：樣本2、5、7、8、11、12、13、22、23為陰性樣本；樣本9、10、20為RTV核酸陽性樣本；樣本3、4為TMEV核酸陽性樣本；樣本16、17、18、19為RCV核酸陽性樣本；樣本15、21、24為PVM核酸陽性樣本；樣本1、6、14為M.pulmonis核酸陽性樣本。陽性樣本通過測序分析，結果一致。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省實驗動物監(jiān)測所

<120> 同時檢測大鼠五種病原體的引物組、試劑盒及多重免疫熒光分析方法

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaaacttag agcagacatc g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccacagaga acaaccatcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgttggaaaa gcacctctca c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcggagtcgg ttgacttaga t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggmatcctc aagaagacca ctt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgccmgaaa accargagta atg 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctggcattc cacataacc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccacaaggt acacggaga 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggaaatgccc taagtatgac gg 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggataacgc ttgcacccta 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcagaatcg caaatacac 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taacaataag ctcgcagtcg 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acttatttct tcactactat atca 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttaaacaatc tactattcaa tcac 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cacttaattc attctaaatc tatc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atactttaca aacaaataac acac 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tactacttct ataactcact taaa 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

attaaacaac tcttaactac acaa 24