本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒實(shí)時(shí)的熒光定量PCR引物。

背景技術(shù)：

鴨肝炎是由鴨肝炎病毒引起的、侵害雛鴨的一種高度致死性傳染病，臨床以急性肝炎為特征，主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨，尤其以1周齡內(nèi)的雛鴨為甚，病死率可達(dá)100%。目前，隨著我國(guó)鴨飼養(yǎng)密度的加大、患病鴨和病死鴨處置的不規(guī)范、各種貿(mào)易活動(dòng)的日益頻繁以及免疫抑制病的出現(xiàn)等諸多原因，鴨肝炎的危害日趨嚴(yán)重，已成為養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一。

在我國(guó)，鴨群中流行的鴨肝炎病毒主要以經(jīng)典型鴨肝炎病毒為主，但關(guān)于韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染的報(bào)道也日益增多。然而無(wú)論是經(jīng)典型鴨肝炎病毒，還是韓國(guó)型鴨肝炎病毒，均主要侵害3周齡內(nèi)的雛鴨，病死鴨多呈角弓反張，剖檢可見(jiàn)肝臟腫大、出血，無(wú)法從臨床剖檢對(duì)二者進(jìn)行有效鑒別診斷。

本發(fā)明的一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行有效區(qū)分。該引物根據(jù)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒存在特征性核苷酸序列差異來(lái)設(shè)計(jì)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線的Tm值和其GC含量正相關(guān)的特點(diǎn)，通過(guò)觀察經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒經(jīng)該組引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的熔解曲線Tm值差異，即可精確對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染情況進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別診斷，相關(guān)研究尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本發(fā)明可填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及其應(yīng)用，該引物能有效區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染（或共感染），為科學(xué)防控鴨肝炎病毒感染提供技術(shù)保障。

本發(fā)明根據(jù)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒存在特征性的核苷酸序列差異來(lái)設(shè)計(jì)一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。該引物針對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增均可得到特異性目的條帶，利用該擴(kuò)增區(qū)域經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒存在核苷酸GC含量差異，通過(guò)建立基于Eva Green的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）差異，根據(jù)熔解曲線Tm值差異可直接對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染情況進(jìn)行鑒別診斷。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，其核苷酸序列為：

上游引物F1: 5′- AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，

下游引物R1: 5′- GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。

通過(guò)所述引物建立基于Eva Green的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，根據(jù)該引物擴(kuò)增的經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒所存在的核苷酸特征性差異——GC含量的差異，可導(dǎo)致實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)后生成的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值），可直接對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染進(jìn)行鑒別。

具體包括以下步驟：

1、設(shè)計(jì)并合成上述特異性引物對(duì)F1/R1；

2、病毒RNA提取：從檢測(cè)樣品中分別提取經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的RNA；

3、RT-PCR擴(kuò)增：利用鴨肝炎特異性引物對(duì)DHVF/DHVR對(duì)提取的核酸RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)定其OD值計(jì)算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋?zhuān)鳛閷?shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。

所用鴨肝炎特異性引物對(duì)DHVF/DHVR的核苷酸序列為：

DHVF: 5’- GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGTA -3’；

DHVR: 5’- ACTCGACCAGCCGCGACC -3’。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用所述實(shí)時(shí)熒光定量引物F1和R1對(duì)含有經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)完成后獲得相應(yīng)的擴(kuò)增曲線，并生成Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的熔解曲線。

5、病毒感染情況判斷：實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線判斷是否存在經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染；通過(guò)觀察熔解曲線其Tm值差異可對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行鑒別。

其中，設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物需滿足如下要求：

（1）特異性強(qiáng)：該實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物需選擇經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒核苷酸序列進(jìn)行分析后保守的區(qū)域設(shè)計(jì)，以便僅需一組引物能對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行擴(kuò)增，即觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線便可對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染進(jìn)行判斷。

（2）兩種病毒的擴(kuò)增區(qū)域GC含量不同：該組引物對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的擴(kuò)增區(qū)域的核苷酸序列存在GC含量差異?；趯?shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)生成的熔解曲線的Tm峰值差異（該差異和核苷酸序列的GC含量差異正相關(guān)），即可通過(guò)觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后的熔解曲線對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染進(jìn)行判斷（可有效區(qū)分是經(jīng)典型鴨肝炎病毒還是韓國(guó)型鴨肝炎病毒）。

其中，所述的步驟（5）的病毒感染情況判斷方法如下：

若在Tm=（87.2±0.20）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為經(jīng)典型鴨肝炎病毒陽(yáng)性；

若在Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為韓國(guó)型鴨肝炎病毒陽(yáng)性；

若在Tm=（87.2±0.20）℃以及Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒雙重感染；

其他情況均判為陰性。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)F1/R1可用于制備區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染的試劑盒。

本發(fā)明的有益效果：鑒定方法簡(jiǎn)單，效率和準(zhǔn)確率較高。使用本研究提供的一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)前期分離的5株經(jīng)典型鴨肝炎病毒和3株韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，均和預(yù)期相符。且僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可有效對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行有效區(qū)分。

附圖說(shuō)明

圖1 鴨肝炎病毒定量PCR引物設(shè)計(jì)區(qū)；

圖2 鴨肝炎病毒基因擴(kuò)增區(qū)域的核苷酸差異；

圖3 特異性引物對(duì)F1/R1對(duì)經(jīng)典型鴨肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；

圖4 特異性引物對(duì)F1/R1對(duì)韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線；

圖5 特異性引物對(duì)F1/R1對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1

1、毒株：

經(jīng)典型鴨肝炎病毒（JX1132株）和韓國(guó)型鴨肝炎病毒（FJ1521株）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

2、引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的核苷酸特征性差異區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的引物F1和R1，引物序列為：

上游引物F1：5′- AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，

下游引物R1: 5′- GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。

3、病毒RNA提取以及RT-PCR擴(kuò)增：

以常規(guī)方法提取經(jīng)典型鴨肝炎病毒（JX1132株）和韓國(guó)型鴨肝炎病毒（FJ1521株）的病毒RNA。利用鴨肝炎特異性引物對(duì)DHVF/DHVR對(duì)提取的核酸RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)定其OD值計(jì)算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋?zhuān)鳛閷?shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。所用鴨肝炎特異性引物對(duì)DHVF/DHVR的核苷酸序列為：

DHVF: 5’- GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGTA -3’；

DHVR: 5’- ACTCGACCAGCCGCGACC -3’。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：

優(yōu)化出的20 μL 最佳反應(yīng)體系為體系：Eva Green 10 μL，濃度為10 μmol/L的F1、R1各0.2 μL、模板2 μL、水補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃，2 min預(yù)變性；95℃ 10 s，59℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，根據(jù)條件做出對(duì)應(yīng)的熔解曲線。

5、病毒感染情況判斷：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，觀察擴(kuò)增曲線，判斷建立的方法有無(wú)特異性擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后做出的熔解曲線，直接在熒光定量PCR儀器連接的電腦上利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)應(yīng)的軟件進(jìn)行分析（可直接肉眼觀察），對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染情況進(jìn)行判斷，判斷方法為：

若在Tm=（87.2±0.20）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為經(jīng)典型鴨肝炎病毒陽(yáng)性；

若在Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為韓國(guó)型鴨肝炎病毒陽(yáng)性；

若在Tm=（87.2±0.20）℃以及Tm=（84.8±0.24）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒雙重感染；

其他情況均判為陰性。

使用本研究提供的一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)前期分離的5株經(jīng)典型鴨肝炎病毒和3株韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，均和預(yù)期相符。且僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可有效對(duì)經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒進(jìn)行有效區(qū)分。

實(shí)施例2

對(duì)臨床送檢的75份疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)；經(jīng)典型鴨肝炎病毒感染陽(yáng)性有6份，陽(yáng)性率為8%（6/75）；韓國(guó)型鴨肝炎病毒感染陽(yáng)性有2份，陽(yáng)性率為2.67%（2/75）； 經(jīng)典型鴨肝炎病毒和韓國(guó)型鴨肝炎病毒共感染的樣品1份。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 區(qū)分經(jīng)典型和韓國(guó)型鴨肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> F1

<400> 1

aaacggatta ccggtagtag catc 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> R1

<400> 2

gaccagccgc gaccctat 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> DHVF

<400> 3

gttgtgaaac ggattaccgg tagta 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> DHVR

<400> 4

actcgaccag ccgcgacc 18