本發(fā)明涉及宮頸癌檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說是一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測(cè)尿液中人乳頭瘤病毒16/18型基因的方法。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是一種發(fā)病率較高的惡性婦科腫瘤，在全球范圍內(nèi)患有惡性腫瘤的女性患者中，宮頸癌患者人數(shù)僅僅低于乳腺癌患者人數(shù)，其嚴(yán)重影響了患者的身體健康及生活質(zhì)量,HPV為一種小分子雙鏈DNA病毒,主要感染人類黏膜和皮膚鱗狀上皮組織,根據(jù)病毒致癌能力大小將其分為高危型、低危型和可能致癌型3種類型,持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(highriskhumanpapillomavirus,HR-HPV)是引起宮頸癌及癌前病變的必要因素,HR-HPV感染及檢測(cè)成為篩查和預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵問題之一。目前，臨床上常用的子宮頸癌檢查方法主要包括：肉眼觀察法、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查法、人乳頭瘤病毒檢測(cè)法以及陰道鏡檢查法,這些技術(shù)有一定的局限性，因?yàn)閷?duì)于青少年、男性及處女細(xì)胞學(xué)檢測(cè)難以實(shí)施；此外，在孕期宮頸病變篩查、手術(shù)療效的隨訪等方面，檢查時(shí)刮取宮頸或陰道上皮會(huì)造成的細(xì)微損傷，而這種損傷在后期有發(fā)生炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，因此臨床上急需一種易獲得,不受年齡、性別和疾病限制,且無創(chuàng)、取樣簡單的檢測(cè)方式。宮頸外周上皮細(xì)胞、陰道正常脫落細(xì)胞以及尿道上皮細(xì)胞可進(jìn)入尿液,當(dāng)有HPV感染時(shí),以上部位脫落細(xì)胞中可含有病毒基因或毒粒,因此用尿液作為檢測(cè)生殖道HPV感染是一種有效、簡單、無創(chuàng)傷性方法，F(xiàn)orslund等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然尿液標(biāo)本HPV檢出陽性率明顯低于宮頸脫落細(xì)胞,但可適用于青少年等受倫理或技術(shù)限制不便取得其宮頸細(xì)胞或組織的人群，由于尿液標(biāo)本無創(chuàng)、容易獲得、不受年齡、性別限制,如能改進(jìn)和提高檢測(cè)手段,可使尿液檢測(cè)HR-HPV廣泛應(yīng)用于臨床診療工作和宮頸癌的篩查,對(duì)宮頸癌的防治具有重要意義。1999年Vogelstein和Kinzler首次提出了"數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR)"的概念，dPCR具有極高的檢測(cè)敏感性，且具有不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾等特點(diǎn)。目前，dPCR技術(shù)以其極高的敏感性、絕對(duì)計(jì)數(shù)能力和無需定標(biāo)等特性而在腫瘤分子診斷工作中得到了廣泛的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)精確度差、存在發(fā)生炎癥風(fēng)險(xiǎn)的缺陷，提供一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測(cè)尿液中人乳頭瘤病毒16/18型基因的方法來解決上述問題。本發(fā)明公開了一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測(cè)尿液中人乳頭瘤病毒16/18型基因的方法，具體步驟為：步驟一、尿液中DNA的抽提：a、收集30ml尿液樣本，在4℃的條件下，5000rpm離心10min，收集底部的沉淀；b、向步驟a收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；c、向步驟b收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；d、向步驟c收集的沉淀內(nèi)加入450ul裂解液和10ul蛋白酶K，在55℃的條件下，水浴1小時(shí)，沉淀溶解，得到混合液；e、將混合液取出，冷卻至室溫后加入等體積的飽和酚，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇,混勻，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，完成了對(duì)尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板；i、將所有提取的DNA模板均用看家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確認(rèn)DNA模板中含有人類DNA，將擴(kuò)增結(jié)果陽性標(biāo)本確認(rèn)為有效的DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆?；步驟二、制備引物反應(yīng)溶液：室溫溶解HPV16E7的PCR引物、HPV18E7的PCR引物以及TaqMan探針，配置20μL引物反應(yīng)溶液，引物反應(yīng)溶液包含10μL2×ddPCRMasterMix、10μmol/L的正向引物和10μmol/L的反向引物各0.8μL、TaqMan-MGB探針0.5μL、DNA模板2μL、無菌水6μL，陰性對(duì)照組中，使用不含DNA的TE緩沖液作為模板；步驟三、制備微滴：將20uL上述引物反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)入DG8微滴發(fā)生卡中并放入QX100微滴發(fā)生器內(nèi)，在每個(gè)孔中加入70μL微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴；步驟四、PCR擴(kuò)増：將樣本生成的微滴手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟五、檢測(cè)微滴：PCR反應(yīng)后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個(gè)樣本中的微滴并隨載液流逐一通過檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴為陽性，無熒光信號(hào)的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結(jié)果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當(dāng)樣本中至少有2個(gè)微滴出現(xiàn)在FAM信號(hào)的陽性區(qū)域時(shí)，認(rèn)為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。作為優(yōu)選，所述的步驟d中，所述的裂解液的組分構(gòu)成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作為優(yōu)選，所述的步驟g中，所述的乙酸鈉溶液的pH值為5.2。作為優(yōu)選，所述的步驟二中，所述的引物預(yù)混液中，引物序列如下：HPV16E7正向引物序列F：5`-TGCAGCTGGACAAGCAGAAC-3`HPV16E7反向引物序列R：5`-CACAACCGAAGCGTAGAGTC-3`HPV16E7TaqmanMGB探針：5`-FAM-ACAGAGCCCATTACAAT-3`HPV18E7正向引物序列F：5`-TACATTTACCAGCCCGACG-3`HPV18E7反向引物序列R：5`-TCGTCTGCTGAGCTTTCTAC-3`HPV18E7TaqmanMGB探針：5`-FAM-AACCACAACGTCACACAA-3`。作為優(yōu)選，所述的步驟四中，檢測(cè)的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；94℃孵育30s，60℃孵育1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃孵育10min，最后置于4℃中。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明將尿液作為檢測(cè)對(duì)象，為青少年、孕婦等受倫理或技術(shù)限制不便取得其宮頸細(xì)胞或組織的人群提供一種取樣無創(chuàng)、不受年齡限制且易獲得的檢測(cè)方式；微滴數(shù)字PCR技術(shù)具有高靈敏度和高精確度，彌補(bǔ)了尿液中病毒核酸稀少造成的檢測(cè)難度，可使尿液檢測(cè)HR-HPV廣泛應(yīng)用于臨床診療工作和宮頸癌的篩查,對(duì)宮頸癌的防治具有重要意義。附圖說明圖1為實(shí)施例1對(duì)HPV16型和18型E7基因的檢測(cè)結(jié)果。圖中方框內(nèi)信號(hào)點(diǎn)代表發(fā)生PCR擴(kuò)增的微滴，系統(tǒng)判讀為陽性信號(hào),方框外信號(hào)點(diǎn)代表未發(fā)生PCR擴(kuò)增的微滴，系統(tǒng)判讀為陰性信號(hào)。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明公開了一種應(yīng)用數(shù)字PCR檢測(cè)尿液中人乳頭瘤病毒16/18型基因的方法，具體步驟為：步驟一、尿液中DNA的抽提：a、收集30ml尿液樣本，在4℃的條件下，5000rpm離心10min，收集底部的沉淀；b、向步驟a收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；c、向步驟b收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；d、向步驟c收集的沉淀內(nèi)加入450ul裂解液和10ul蛋白酶K，在55℃的條件下，水浴1小時(shí)，沉淀溶解，得到混合液；e、將混合液取出，冷卻至室溫后加入等體積的飽和酚，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇,混勻，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，完成了對(duì)尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板；i、將所有提取的DNA模板均用看家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確認(rèn)DNA模板中含有人類DNA，將擴(kuò)增結(jié)果陽性標(biāo)本確認(rèn)為有效的DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆茫徊襟E二、制備引物反應(yīng)溶液：室溫溶解HPV16E7的PCR引物、HPV18E7的PCR引物以及TaqMan探針，配置20μL引物反應(yīng)溶液，引物反應(yīng)溶液包含10μL2×ddPCRMasterMix、10μmol/L的正向引物和10μmol/L的反向引物各0.8μL、TaqMan-MGB探針0.5μL、DNA模板2μL、無菌水6μL，陰性對(duì)照組中，使用不含DNA的TE緩沖液作為模板；步驟三、制備微滴：將20uL上述引物反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)入DG8微滴發(fā)生卡中并放入QX100微滴發(fā)生器內(nèi)，在每個(gè)孔中加入70μL微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴；步驟四、PCR擴(kuò)増：將樣本生成的微滴手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟五、檢測(cè)微滴：PCR反應(yīng)后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個(gè)樣本中的微滴并隨載液流逐一通過檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴為陽性，無熒光信號(hào)的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結(jié)果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當(dāng)樣本中至少有2個(gè)微滴出現(xiàn)在FAM信號(hào)的陽性區(qū)域時(shí)，認(rèn)為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。作為優(yōu)選，所述的步驟d中，所述的裂解液的組分構(gòu)成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。作為優(yōu)選，所述的步驟g中，所述的乙酸鈉溶液的pH值為5.2。作為優(yōu)選，所述的步驟二中，所述的引物預(yù)混液中，引物序列如下：HPV16E7正向引物序列F：5`-TGCAGCTGGACAAGCAGAAC-3`HPV16E7反向引物序列R：5`-CACAACCGAAGCGTAGAGTC-3`HPV16E7TaqmanMGB探針：5`-FAM-ACAGAGCCCATTACAAT-3`HPV18E7正向引物序列F：5`-TACATTTACCAGCCCGACG-3`HPV18E7反向引物序列R：5`-TCGTCTGCTGAGCTTTCTAC-3`HPV18E7TaqmanMGB探針：5`-FAM-AACCACAACGTCACACAA-3`。作為優(yōu)選，所述的步驟四中，檢測(cè)的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；94℃孵育30s，60℃孵育1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃孵育10min，最后置于4℃中。本發(fā)明通過采用尿液作為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)比較方便，而且由于不會(huì)與人體直接接觸，不會(huì)損害人體，另外微滴數(shù)字PCR技術(shù)具有高靈敏度和高精確度結(jié)，彌補(bǔ)了尿液中病毒核酸稀少造成的檢測(cè)難度，可使尿液檢測(cè)HR-HPV廣泛應(yīng)用于臨床診療工作和宮頸癌的篩查,對(duì)宮頸癌的防治具有重要意義。實(shí)施例1以對(duì)HPV16型和18型E7基因的檢測(cè)為例具體步驟為：步驟一、尿液中DNA的抽提：a、尿液標(biāo)本收集：收集宮頸癌及癌前病變患者清晨第1次前段尿液30mL,裝入無菌有蓋試管中,在4℃的條件下，5000rpm離心10min，收集底部的沉淀；b、向步驟a收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；c、向步驟b收集的沉淀內(nèi)加入1.0mlTE緩沖液，混勻，8000rpm離心5min，收集底部的沉淀；d、向步驟c收集的沉淀內(nèi)加入450ul裂解液和10ul蛋白酶K，在55℃的條件下，水浴1小時(shí)，沉淀溶解，得到混合液；e、將混合液取出，冷卻至室溫后加入等體積的飽和酚，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；f、加入432μL的氯仿和18μL的異戊醇，混勻，5000rpm離心10min，棄上清；g、加入占步驟f制得的混合液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，再加入2.5倍步驟f制得的混合液體積的無水乙醇,混勻，在-20℃的條件下放置1h后，10000rpm離心15min，棄上清；h、采用0.6mL的70%乙醇溶液洗滌2次，晾干后，加入50μLTE緩沖液，完成了對(duì)尿液中DNA的抽提，得到了DNA模板；i、將所有提取的DNA模板均用看家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確認(rèn)DNA模板中含有人類DNA，將擴(kuò)增結(jié)果陽性標(biāo)本確認(rèn)為有效的DNA模板，在－20℃的條件下保存?zhèn)溆?；步驟二、制備引物反應(yīng)溶液：室溫溶解HPV16E7的PCR引物、HPV18E7的PCR引物以及TaqMan探針，配置20μL引物反應(yīng)溶液，引物反應(yīng)溶液包含10μL2×ddPCRMasterMix、10μmol/L的正向引物和10μmol/L的反向引物各0.8μL、TaqMan-MGB探針0.5μL、DNA模板2μL、無菌水6μL，陰性對(duì)照組中，使用不含DNA的TE緩沖液作為模板；步驟三、制備微滴：將20uL上述引物反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)入DG8微滴發(fā)生卡中并放入QX100微滴發(fā)生器內(nèi)，在每個(gè)孔中加入70μL微滴生成油，然后置于微滴生成卡中，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴；步驟四、PCR擴(kuò)増：將樣本生成的微滴手動(dòng)轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，孔板用錫箱熱封后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；步驟五、檢測(cè)微滴：PCR反應(yīng)后，將96孔PCR板置于QX100微滴分析儀中，依次吸取每個(gè)樣本中的微滴并隨載液流逐一通過檢測(cè)器，有熒光信號(hào)的微滴為陽性，無熒光信號(hào)的微滴為陰性；步驟六、分析數(shù)據(jù)以及顯示結(jié)果：采用QuantaSoft軟件分析ddPCR數(shù)據(jù)確定等位基因分型，當(dāng)樣本中至少有2個(gè)微滴出現(xiàn)在FAM信號(hào)的陽性區(qū)域時(shí)，認(rèn)為該樣本此突變?yōu)殛栃?，否則為陰性。所述的步驟d中，所述的裂解液的組分構(gòu)成為：10mMTris-HCl，1mMEDTA,0.5%SDS。所述的步驟g中，所述的乙酸鈉溶液的pH值為5.2。所述的步驟二中，所述的引物預(yù)混液中，引物序列如下：HPV16E7正向引物序列F5`-TGCAGCTGGACAAGCAGAAC-3`HPV16E7反向引物序列R5`-CACAACCGAAGCGTAGAGTC-3`HPV16E7TaqmanMGB探針5`-FAM-ACAGAGCCCATTACAAT-3`HPV18E7正向引物序列F5`-TACATTTACCAGCCCGACG-3`HPV18E7反向引物序列R5`-TCGTCTGCTGAGCTTTCTAC-3`HPV18E7TaqmanMGB探針5`-FAM-AACCACAACGTCACACAA-3`所述的步驟四中，檢測(cè)的熱循環(huán)模式為：95℃孵育10min；94℃孵育30s，60℃孵育1min，共40個(gè)循環(huán)；98℃孵育10min，最后置于4℃中。如圖1所示，HPV16和HPV18E7基因在40個(gè)循環(huán)內(nèi)成果擴(kuò)增出特異性序列，而陰性對(duì)照在40個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有明顯的擴(kuò)增,這個(gè)結(jié)果表明應(yīng)用數(shù)字PCR可準(zhǔn)確檢測(cè)出尿液中人乳頭瘤病毒16/18型基因。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。當(dāng)前第1頁1 2 3