本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。

背景技術(shù)：

禽流感（Avian influneza，AI）是由A型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鳥的一種急性、高度接觸性傳染病。高致病性H5亞型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus, H5 AIV）引起的感染目前被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，在我國(guó)被列為一類動(dòng)物疫病。

關(guān)于流感的最早記錄可追溯到1878年來(lái)自意大利的一次報(bào)道，隨后世界各地陸續(xù)發(fā)生流感的暴發(fā)和流行。1996年，在我國(guó)分離到的第一株H5N1亞型HPAIV（A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1），GS/GD/96），緊接著香港于1997年發(fā)生H5N1亞型禽流感病毒直接感染人事件，這是第一個(gè)禽源流感病毒未經(jīng)中間宿主而直接感染人的證據(jù)。由于從祖源病毒GS/GD/96進(jìn)化出多個(gè)譜系且命名不統(tǒng)一，為此WHO、FAO和OIE聯(lián)合制定了H5N1 HPAIV統(tǒng)一分類準(zhǔn)則將H5N1 HPAIV分為0~9共計(jì)10個(gè)不同clade。其中clade 2.3.4最早于2003~2006年間流行于中國(guó)、越南、泰國(guó)、老撾和馬來(lái)西亞等地的病毒株，2006~2009年clade 2.3.4分支在我國(guó)很多地區(qū)是優(yōu)勢(shì)流行株；而2010年后逐漸被clade 2.3.2.1分支取代，以A/duck/Guangdong/S1322/2006為HA和NA基因供體研制Re-6株疫苗來(lái)控制clade 2.3.2.1分支病毒的流行。近年來(lái)，出現(xiàn)了clade 2.3.4.4分支病毒，針對(duì)該類病毒研制了Re-8株疫苗。對(duì)clade 2.3.4和clade 2.3.2.1 H5 AIV進(jìn)行鑒別診斷有助于指導(dǎo)H5 AIV相應(yīng)疫苗的科學(xué)使用。

然而，clade 2.3.2.1和clade 2.3.4二者之間的基因序列核苷酸同源率大于94.3%（以經(jīng)典毒株的同源率為例），很難通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)方法（如常規(guī)RT-PCR方法）進(jìn)行鑒別。本發(fā)明的一組區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可有效對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行有效區(qū)分。該引物根據(jù)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的特征性核苷酸序列差異來(lái)設(shè)計(jì)；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后生成的熔解曲線的Tm值和其GC含量正相關(guān)的特點(diǎn)，通過(guò)觀察clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV經(jīng)該組引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的熔解曲線Tm值差異，即可精確對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情況進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別診斷，相關(guān)研究尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本發(fā)明可填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及其應(yīng)用，該引物能有效區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染（或共感染），為科學(xué)防控 H5 AIV提供技術(shù)保證。

本發(fā)明根據(jù)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）存在特征性的核苷酸序列差異來(lái)設(shè)計(jì)一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。利用該擴(kuò)增區(qū)域clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）存在的核苷酸GC含量差異，通過(guò)建立基于Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）差異，根據(jù)熔解曲線Tm值差異可直接對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情況進(jìn)行鑒別診斷。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，其核苷酸序列為：

上游引物F1：5’- ATTGACAAAATGAACACTC -3’；

下游引物R1：5’- CCAGACATCTAGGAATCCGT -3’。

通過(guò)所述引物建立基于Eva Green的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，根據(jù)利用該引物擴(kuò)增的clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因（HA）所存在的核苷酸特征性差異——GC含量差異，可導(dǎo)致實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)后的生成的熔解曲線存在不同的熔解溫度（Tm值）的特點(diǎn)，可直接對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染進(jìn)行鑒別。

具體包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)并合成上述特異性引物對(duì)F1/R1；

（2）病毒RNA提取：從檢測(cè)樣品中分別提取clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的病毒RNA；

（3）RT-PCR擴(kuò)增：設(shè)計(jì)并合成H5 AIV血凝素基因HA特異性引物對(duì)H5-HAF/H5-HAR對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得其HA基因序列；將RT-PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA的陽(yáng)性重組質(zhì)粒（T-clade 2.3.2.1-1和T-clade 2.3.4.4 -1），測(cè)定其OD值計(jì)算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。

所用H5 AIV血凝素基因HA特異性引物對(duì)H5-HAF/H5-HAR的核苷酸序列為：

H5-HAF: 5’- TGGTTACCATGCAAACAAC -3’；

H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’。

（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用所述實(shí)時(shí)熒光定量引物對(duì)F1/R1對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒（T-clade 2.3.2.1-1和T-clade 2.3.4.4-1）進(jìn)行Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)完成后獲得相應(yīng)的擴(kuò)增曲線，并生成Eva Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的熔解曲線。

（5）病毒感染情況判斷：實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線判斷是否存在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染；通過(guò)觀察熔解曲線其Tm值差異可對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行鑒別。

其中，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)F1/R1滿足如下要求：

（1）特異性強(qiáng)：該實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物在針對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因HA核苷酸序列進(jìn)行分析后保守的區(qū)域設(shè)計(jì)，對(duì)二者均具有高特異性，達(dá)到僅需一組引物便能對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行擴(kuò)增的目的，即觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線即可判斷是否感染clade 2.3.2.1或clade 2.3.4.4 H5 AIV感染進(jìn)行判斷（但無(wú)法區(qū)分是clade2.3.4 H5 AIV還是clade 2.3.2.1 H5 AIV）。

（2）兩種病毒的擴(kuò)增區(qū)域GC含量不同：該組引物擴(kuò)增的血凝素基因HA在clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV中存在核苷酸序列GC含量差異?；趯?shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)生成的熔解曲線的Tm值差異（該差異和核苷酸序列的GC含量差異正相關(guān)），即可通過(guò)觀察實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后的熔解曲線對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染進(jìn)行判斷（可有效區(qū)分是clade2.3.4 H5 AIV還是clade 2.3.2.1 H5 AIV）。

其中，所述的步驟（5）的病毒感染情況判斷方法如下：

若在Tm=（80.06±0.09）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為clade 2.3.2.1 H5 AIV陽(yáng)性；

若在Tm=（79.18±0.08）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為clade 2.3.4.4 H5 AIV陽(yáng)性；

若在Tm=（80.06±0.09）℃以及Tm=（79.18±0.08）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV雙重感染；

其他情況均判為陰性。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)F1/R1可用于制備區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染的試劑盒。

本發(fā)明的有益效果：鑒定方法簡(jiǎn)單，效率和準(zhǔn)確率較高。使用本研究提供的一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)前期分離的2株clade 2.3.2.1 H5 AIV和2株clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，均和預(yù)期相符。且僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可有效對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行有效區(qū)分。

附圖說(shuō)明

圖1 為clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV血凝素基因HA引物設(shè)計(jì)區(qū)及核苷酸序列特征性差異圖。

圖2 引物對(duì)F1/R1對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線：F1/R1對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV病毒感染結(jié)果的判斷須在擴(kuò)增成功的前提下做出，若擴(kuò)增失敗，則不可依據(jù)熔解曲線做出感染類型判斷；若拷貝數(shù)相同，則clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV擴(kuò)增曲線一致。

圖3 引物對(duì)F1/R1對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的熔解曲線。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1

1、毒株：

H5亞型流感病毒clade 2.3.2.1分支（DY1株）和clade 2.3.4.4分支（DK10株）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

2、引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA核苷酸特征性差異區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的引物F1和R1，其中F1和R1引物序列為：

上游引物F1：5’- ATTGACAAAATGAACACTC -3’，

下游引物R1：5’- CCAGACATCTAGGAATCCGT -3’。

3、病毒RNA提取以及RT-PCR擴(kuò)增：

以常規(guī)方法提取H5亞型流感病毒clade 2.3.2.1分支（DY1株）和clade 2.3.4.4分支（DK10株）的病毒RNA。利用針對(duì)H5 AIV血凝素基因HA基因,設(shè)計(jì)特異性引物（ H5-HAF: 5’- TGGTTACCATGCAAACAAC -3’和H5-HAR: 5’- TTACACTTTCCATACATTCATTATC -3’）對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得其HA基因序列；將RT-PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行膠回收并純化后，克隆到T載體上，獲得含有clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的血凝素基因HA的陽(yáng)性重組質(zhì)粒（T- clade 2.3.2.1-1和T- clade 2.3.4.4-1），測(cè)定其OD值計(jì)算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：

優(yōu)化出的20 μL 最佳反應(yīng)體系為體系：Eva Green 10 μL，濃度為10 μmol/L的F1、R1各0.2 μL、模板2 μL、水補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃，2 min預(yù)變性；95℃ 10 s，59℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，根據(jù)條件做出對(duì)應(yīng)的熔解曲線。

5、病毒感染情況判斷：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，觀察擴(kuò)增曲線，判斷建立的方法有無(wú)特異性擴(kuò)增（沒有擴(kuò)增曲線，熔解曲線的檢測(cè)結(jié)果沒有意義）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后做出的熔解曲線，直接在和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器連接的電腦上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)應(yīng)的軟件進(jìn)行分析（可直接肉眼觀察），對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV感染情況進(jìn)行判斷，判斷方法為：

若在Tm=（80.06±0.09）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為clade 2.3.2.1 H5 AIV陽(yáng)性；

若在Tm=（79.18±0.08）℃出現(xiàn)單一的特異性Tm峰判為clade 2.3.4.4 H5 AIV陽(yáng)性；

若在Tm=（80.06±0.09）℃以及Tm=（79.18±0.08）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV雙重感染；

其他情況均判為陰性。

從圖3可以看出，引物對(duì)F1/R1對(duì)兩株病毒血凝集素基因（HA）片段擴(kuò)增特異性強(qiáng)，且二者的Tm值存在差異，可有效區(qū)分兩株病毒。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用本研究提供的一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)前期分離的2株clade 2.3.2.1 H5 AIV和2株clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，均和預(yù)期相符。且僅需1組引物對(duì)（2條引物）即可有效對(duì)clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV進(jìn)行有效區(qū)分。

實(shí)施例2

對(duì)臨床送檢的85份死亡鴨病料經(jīng)處理后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，clade 2.3.2.1 H5 AIV感染陽(yáng)性有3株，陽(yáng)性率為3.52%（3/85）；clade 2.3.4.4 H5 H5 AIV感染陽(yáng)性有5株，陽(yáng)性率為5.88%（5/85）；，未檢測(cè)到臨床送檢的85份死亡鴨存在 clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV共感染現(xiàn)象。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 區(qū)分clade 2.3.2.1和clade 2.3.4.4 H5 AIV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> F1

<400> 1

attgacaaaa tgaacactc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> R1

<400> 2

ccagacatct aggaatccgt 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> H5-HAF

<400> 3

tggttaccat gcaaacaac 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> H5-HAR

<400> 4

ttacactttc catacattca ttatc 25