本發(fā)明涉及毒性檢測，具體是一種a-氰基丙烯酸酯細胞毒性檢測方法。

背景技術(shù)：

無張力疝修補成為目前臨床上疝修補的主要術(shù)式，故對疝補片的固定方式成為臨床探討的熱點。有多種將疝補片固定于腹壁的方式：如疝釘、縫線和醫(yī)用粘合劑等。多篇文獻報道：以疝釘或縫線等傷及組織的固定方式會引起術(shù)中、術(shù)后出血且疝修補術(shù)后慢性疼痛亦與此種固定方式有關(guān)。其中文獻的研究顯示：使用疝釘?shù)臄?shù)目（大于 6 枚）與術(shù)后痛的發(fā)生率有關(guān)。而以使用纖維蛋白膠為代表的醫(yī)用膠固定疝補片的方式正逐漸為外科醫(yī)生所接受。以醫(yī)用膠固定補片是一種無創(chuàng)的、有效的固定方式。使用醫(yī)用膠固定疝補片不必擔心固定時會損傷血管、神經(jīng)。且醫(yī)用膠會逐漸被機體分解、吸收，不必擔心殘留。理想的醫(yī)用膠粘劑應(yīng)該滿足以下要求：①安全、可靠、無毒性、無三致(致癌、致畸、致突變)；②具有良好的生物相容性，不妨礙人體組織的自身愈合；③無菌且可在一定時期內(nèi)保持無菌；④在有血液和組織液的條件下可以使用；⑤在常溫、常壓下可以實現(xiàn)快速粘合；⑥具有良好的粘合強度及持久性，粘合部分具有一定的彈性和韌性；⑦在使用過程中對人體組織無刺激性；⑧達到使用效果后能夠逐漸降解、吸收、代謝；⑨具有良好的使用狀態(tài)并易于保存。a-氰基丙烯酸酯膠粘劑是目前應(yīng)用較廣的醫(yī)用膠，單體呈液體狀。在人體內(nèi)當遇到微量陰離子物質(zhì)（如人體內(nèi)的血液、水、創(chuàng)面滲出的組織液）或有機胺類，室溫下其即可與生物體組織迅速發(fā)生聚合反應(yīng)，固化成膜并與創(chuàng)面緊密鑲嵌。電鏡下掃描示其固化膜成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)能有效阻止紅細胞和血小板通過，在凝血酶和纖維蛋白原的共同作用下達到有效止血、封閉創(chuàng)面、硬組織粘合和堵塞血管的作用。同時，該結(jié)構(gòu)還能將組織和細菌隔離，具有保護創(chuàng)面作用。在小梁切除術(shù)中，用a-氰基丙烯酸正辛酷代替手術(shù)縫線后，短期內(nèi)粘合力比縫線的點縫合更牢固匯，而且與縫合比較，不僅操作簡單，縮短了手術(shù)時間，還消除了由于鞏膜縫線張力引起的術(shù)后循規(guī)性散光。眼燒傷治療中粘合羊膜手術(shù)時，因燒傷眼皮表面高度充血水腫甚至出現(xiàn)缺血壞死，導(dǎo)致縫線操作困難，而用膠粘劑就可以解決這一困難，達到防止羊膜早期脫落，迅速恢復(fù)眼表完整性的效果，對防止多種并發(fā)癥的發(fā)生有很大的作用。腹腔鏡手術(shù)尾期用a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠來修補手術(shù)戳孔比手術(shù)縫線更迅速有效，降低了術(shù)后并發(fā)癥機率。另外，由于a-氰基丙烯酸酯膠粘劑本身有抑菌功能，且固化速度快，因此在粘接固定時還有抑制感染，及時封閉感染入口，加速傷口愈合的優(yōu)點有人在幾丁質(zhì)室修復(fù)兔顆骨內(nèi)面神經(jīng)缺損中應(yīng)用a一氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠固定顳骨內(nèi)面神經(jīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此方法不易引起幾丁質(zhì)管豁裂，局部無感染，神經(jīng)斷端不易從幾丁質(zhì)室脫出，簡便、省時、神經(jīng)再生質(zhì)量高。愕裂修復(fù)術(shù)中用a-氰基丙烯酸酯膠粘貼代替?zhèn)鹘y(tǒng)的碘仿紗條填塞，不需要抽出松弛切口內(nèi)填塞的碘仿紗條，從而避免引起繼發(fā)性出血，達到減少張力和腭瓣后退，防止食物嵌塞，減少感染的發(fā)生的目的。

但是，研究認為此膠粘劑存在抗沖擊性能差、粘度低、體內(nèi)降解時間快等缺陷，因此其應(yīng)用范圍受到限制。但是a-氰基丙烯酸酯固化時產(chǎn)生的聚合熱僅為2.1J，因而對局部組織的刺激很小。動物實驗也發(fā)現(xiàn)，a-氰基丙烯酸酯膠粘劑屬無毒級，致癌、致畸及致突變實驗和細菌培養(yǎng)均為陰性。成人急性毒性試驗結(jié)果為:LD50>13 g/kg，屬實際無毒級；無致癌、致畸性；另外，它還能在體內(nèi)分解、排泄，無毒性累積。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)a-氰基丙烯酸正辛酯在粘接聽骨鏈時，雖無組織毒性的表現(xiàn)，但會引起輕度的異物反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠用于神經(jīng)組織時，可致神經(jīng)元壞死，神經(jīng)纖維斷裂和脫髓鞘。據(jù)推測是因為a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠涂抹于坐骨神經(jīng)后，使部分神經(jīng)纖維損傷，激活Schwann細胞、肥大細胞、巨嗜細胞，并且a-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠作為外源性物質(zhì)可使T淋巴細胞、肥大細胞、巨嗜細胞等聚集。

在疝修補應(yīng)用上，國內(nèi)外的許多學(xué)者都相繼報道了在開放式疝修補術(shù)或腹腔鏡疝修補術(shù)中使用纖維蛋白膠（Fibrin sealant）的情況。在這些報道中纖維蛋白膠獲得了大多數(shù)學(xué)者的認可。亦有多篇文獻報道使用合成醫(yī)用膠固定疝補片。Jain 等人的研究認為：明膠—間二苯—甲醛膠固定組與縫線固定組相比，在術(shù)后痛方面膠固定組明顯優(yōu)于縫線組。膠固定不僅可降低術(shù)后痛發(fā)生率還可以使手術(shù)醫(yī)生在固定疝補片時不必如使用疝釘固定時那樣需仔細辨認結(jié)構(gòu)，避免損傷腹壁下血管、髂血管、神經(jīng)。手術(shù)醫(yī)生可以從容固定補片。Jourdan 等介紹了將 n-丁基-2 氰基丙烯酸合成膠應(yīng)用于腹腔鏡疝修補術(shù)的成功經(jīng)驗。與其他修補不同的是，疝補片為異物，故粘合劑生物相容性十分重要。雖然 Fortelny 等人報道：在大鼠腹壁疝模型上使用一種名為氰基丙烯酸鹽（Glubran-Ⅱ）醫(yī)用膠會損害補片與腹壁的融合。但其研究結(jié)果表明，此種醫(yī)用膠術(shù)后 3 個月仍未降解且其殘留物影響組織侵潤而這就是（Glubran-Ⅱ）醫(yī)用膠固定失敗的原因。由于疝補片植入機體后會皺縮，從而導(dǎo)致疝修補術(shù)的失敗同時。而引起補片皺縮與炎癥反應(yīng)有關(guān)，也與粘合劑的相容性息息相關(guān)。而a-氰基丙烯酸酯作為疝修補粘合劑組織生物相容性和細胞毒性鮮有研究，本發(fā)明通過體外以及動物研究，探討a-氰基丙烯酸酯作為疝修補粘合劑組織生物相容性和細胞毒性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種a-氰基丙烯酸酯細胞毒性檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種a-氰基丙烯酸酯細胞毒性檢測方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗、a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性動物實驗以及聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗，其中a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗主要包括以下步驟：

1、取真皮層成纖維細胞和間皮細胞進行培養(yǎng)基培養(yǎng)；

2、在預(yù)定時間點（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0時、6時和24時）取步驟1中的樣本進行依次進行洗滌、分散、再洗滌、離心；

3、取步驟2中的懸濁液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯膠和6ml 的PBS混合液后繼續(xù)播種到培養(yǎng)基上并在37°C環(huán)境的密封內(nèi)孵化5 h后進行進行染色處理，同時在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并對流式細胞術(shù)檢測并計算細胞數(shù)，同時在a-氰基丙烯酸酯膠與PBS混合液混合時進行甲醛測定。

所述的細胞毒性動物實驗主要包括以下步驟：

1、取新西蘭兔人為造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左側(cè)面)內(nèi)部和外部斜肌和橫向肌肉，腹橫筋以及腹膜壁層，并均分為觀察組以及對照組；

2、將觀察組采用a-氰基丙烯酸酯膠粘劑處理固定，將對照組采用縫合處理；

3、將觀察組以及對照組的在培養(yǎng)14天后制作標本顯微鏡下觀察模型部分細胞特征并對比。

所述聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗主要包括以下步驟：

1、將需要縫合的患者均為為兩組，一組為對照組，另一組為觀察組；

2、將觀察組患者應(yīng)用聚丙烯補片和a-氰基丙烯酸酯膠進行固定，將對照組患者應(yīng)用聚丙烯補片和縫合的方式進行固定；

對對照組與觀察組的患者進行術(shù)后血液指標（白細胞、中性粒細胞）、生化指標（AST、ALT、BUN、Cr）以及術(shù)后隨訪并發(fā)癥監(jiān)測。

作為本發(fā)明進一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中的甲醛測定主要在室溫條件下并放在封閉的環(huán)境中，在預(yù)定時間點將50ul樣本置于96孔板中，加入甲醛試劑進行孵育30分鐘，同時在在535nm光照處測定甲醛的量。

作為本發(fā)明再進一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中的培養(yǎng)基包括低糖杜爾貝科培養(yǎng)基、10%的胎牛血清營養(yǎng)液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的鏈霉素和25ug/ml的兩性霉素），且每3天更換新的培養(yǎng)液。

作為本發(fā)明再進一步的方案：a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中樣本分離和計算主要是孵育完的待測溶液首先進行洗滌去培養(yǎng)液后，加入胰蛋白酶進行吹打分散，然后上離心機以1000r/min離心7分鐘，加入2ml染色液后再進行離心，取懸濁液上流式機，細胞計算采用流式細胞術(shù)，最終計算出細胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有細胞毒性。

作為本發(fā)明再進一步的方案：聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗所選取患者不包括患有血液學(xué)、肝臟、腎臟疾病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明整體檢測準確，可以有效的實現(xiàn)a-氰基丙烯酸酯膠的有效檢測，同時采用多重檢測手段，不會產(chǎn)生樣品較大誤差，同時也非常的高效。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

請參閱本發(fā)明實施例中，一種a-氰基丙烯酸酯細胞毒性檢測方法，主要包括a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗、a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性動物實驗以及聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗，其中a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗主要包括以下步驟：

4、取真皮層成纖維細胞和間皮細胞進行培養(yǎng)基培養(yǎng)；

5、在預(yù)定時間點（每月2日、4日、7日、10日、14日、21日、28日的0時、6時和24時）取步驟1中的樣本進行依次進行洗滌、分散、再洗滌、離心；

6、取步驟2中的懸濁液并加入10ml的a-氰基丙烯酸酯膠和6ml 的PBS混合液后繼續(xù)播種到培養(yǎng)基上并在37°C環(huán)境的密封內(nèi)孵化5 h后進行進行染色處理，同時在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并對流式細胞術(shù)檢測并計算細胞數(shù)，同時在a-氰基丙烯酸酯膠與PBS混合液混合時進行甲醛測定。

所述的細胞毒性動物實驗主要包括以下步驟：

4、取新西蘭兔人為造成腹部缺陷，包括腹前壁(右和左側(cè)面)內(nèi)部和外部斜肌和橫向肌肉，腹橫筋以及腹膜壁層，并均分為觀察組以及對照組；

5、將觀察組采用a-氰基丙烯酸酯膠粘劑處理固定，將對照組采用縫合處理；

6、將觀察組以及對照組的在培養(yǎng)14天后制作標本顯微鏡下觀察模型部分細胞特征并對比。

所述聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗主要包括以下步驟：

3、將需要縫合的患者均為為兩組，一組為對照組，另一組為觀察組；

4、將觀察組患者應(yīng)用聚丙烯補片和a-氰基丙烯酸酯膠進行固定，將對照組患者應(yīng)用聚丙烯補片和縫合的方式進行固定；

5、對對照組與觀察組的患者進行術(shù)后血液指標（白細胞、中性粒細胞）、生化指標（AST、ALT、BUN、Cr）以及術(shù)后隨訪并發(fā)癥監(jiān)測。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中的甲醛測定主要在室溫條件下并放在封閉的環(huán)境中，在預(yù)定時間點將50ul樣本置于96孔板中，加入甲醛試劑進行孵育30分鐘，同時在在535nm光照處測定甲醛的量。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中的培養(yǎng)基包括低糖杜爾貝科培養(yǎng)基、10%的胎牛血清營養(yǎng)液、抗生素（10000U/ml的青霉素，10000ug/ml的鏈霉素和25ug/ml的兩性霉素），且每3天更換新的培養(yǎng)液。

a-氰基丙烯酸酯膠粘劑生物相容性和細胞毒性體外實驗中樣本分離和計算主要是孵育完的待測溶液首先進行洗滌去培養(yǎng)液后，加入胰蛋白酶進行吹打分散，然后上離心機以1000r/min離心7分鐘，加入2ml染色液后再進行離心，取懸濁液上流式機，細胞計算采用流式細胞術(shù)，最終計算出細胞水平，判定a-氰基丙烯酸酯是否具有細胞毒性。

聚丙烯補片應(yīng)用a-氰基丙烯酸酯膠進行固定效果實驗所選取患者不包括患有血液學(xué)、肝臟、腎臟疾病。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。