本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法及其用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時長期存在的高血糖，導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。目前尚無根治糖尿病的方法，但通過多種治療手段可以控制好糖尿病。天然植物降血糖的研究已經(jīng)越來越熱門，研究顯示辣木葉粉也具有降血糖的作用。辣木(morigaoleifera)屬辣木科、辣木屬，起源于印度北部的亞喜馬拉雅山地帶。印度和非洲國家常用于治療糖尿病、高血壓、心血管病、肥胖癥等疾病。近年來，辣木在我國廣東、云南、海南和四川等都有引種栽培。2012年辣木葉被批準為新資源食品，各種辣木產(chǎn)品開發(fā)火熱，廣泛應用于食品、保健品、水質(zhì)凈化、化妝品等領(lǐng)域。

陳瑞嬌等用AB-8大孔樹脂純化過的辣木葉黃酮(TFM)用于糖尿病模型小鼠，進行降糖活性觀察，最終發(fā)現(xiàn)，TFM有顯著的降糖活性，還能增加血清SOD含量，降低MDA含量，且對非糖尿病小鼠的血糖無影響。還有研究表明，在使用辣木葉提取物3h內(nèi)能有效降低血糖水平，并且隨著劑量的增加功效也提高，但其有效性要低于標準的降血糖藥。辣木適應性廣、耐粗放栽培，辣木葉營養(yǎng)價值豐富、保健功能多樣，在我國開展辣木種植及辣木葉產(chǎn)品的市場和商業(yè)前景廣闊?，F(xiàn)對辣木葉資源的開發(fā)尚，處于起步階段，但已通過大量的檢測和實驗證明辣木葉是一種安全健康的綠色食品，且2012年辣木已被中國衛(wèi)生部批準為中國新資源食品。辣木葉被報道的成分以黃酮類化合物為主，是目前辣木葉開發(fā)中研究最多的化合物，其主要活性表現(xiàn)為抗氧化、降血糖、保護肝臟等。如今全球糖尿病患者數(shù)量猛增的形勢下，對該病的天然防治藥物需求大大增加，而辣木葉黃酮正因其具有降血糖效果的同時，營養(yǎng)成分豐富、副作用小、改善糖尿病并發(fā)癥等優(yōu)勢，且辣木葉黃酮原料具備采集方便、資源豐富，提取工藝簡單等特點，使辣木葉黃酮具有了成為防治糖尿病藥物的潛力，這可能是辣木葉的進一步發(fā)展方向。但目前還沒有辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗具體指數(shù)及辣木葉黃酮提取物相關(guān)應用的報道，判斷出辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性指數(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法及其用途，能夠判斷辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末80-100mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為0.8-1.5×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓10-12h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液160-200μL，再分別加入20-50μL樣品，孵育24-28h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL，葡萄糖攝取活性系數(shù)K大于等于1，則標記該樣品的葡萄糖攝取活性為優(yōu)，葡萄糖攝取活性系數(shù)K小于1，則標記該樣品的葡萄糖攝取活性為良，葡萄糖攝取活性系數(shù)K小于0.5，則標記該樣品的葡萄糖攝取活性為不佳；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L或餐后2h血糖大于11.1mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算；

血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算需要經(jīng)過大鼠的血樣采集，具體操作為大鼠最后一天灌胃后，禁食不禁水過夜。以乙醚麻醉動物，眼靜脈叢采血，于37℃放置1h后，4℃冰箱過夜，以3000r/min離心10min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采血完畢后處死大鼠，取肝臟、胰臟于波恩氏液中固定，做組織切片備用。取肝臟于pH7.0的4℃PBS，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡與周期備用。取肝臟、胰臟于RNA保護劑，-80℃保存，做熒光定量PCR備用。取肝臟、胰臟于戊二醛中，4℃保存，超微病理學觀察備用。

按照試劑盒說明書的要求，對大鼠血清中的葡萄糖(Glu)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、胰島素(INS)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)進行測定。

根據(jù)測得的大鼠空腹血糖值與空腹胰島素值，計算以下幾個胰島相關(guān)指數(shù)。

HOMA-IR＝FPG×FINS/22.5

HOMA-IS＝1/(FPG×FINS)

IAI＝Ln[1/(FPG×FINS)]

HOMA-β(％)＝20×FINS/(FPG-3.5)

FPG：空腹血糖值，mmol/L；FINS：空腹胰島素水平，mIU/L。

HOMA(Homeostasis model assessment)，又稱HOMA穩(wěn)態(tài)模型，目前已成為廣泛應用于臨床的評價糖尿病人胰島素敏感性，胰島素抵抗水平與胰島β細胞功能的常用指標。HOMA-IR(Homeostasis Model of Insulin Resistance)是用于評價個體的胰島素抵抗水平的指標，正常個體的HOMA-IR指數(shù)為1，隨著胰島素抵抗水平升高的升高，HOMA-IR指數(shù)將高于1。HOMA-IS是用于評價個體的胰島素敏感性的指標，HOMA-IS(Homeostasis Model of Insulin Secretion)指數(shù)隨著胰島素敏感性水平的升高而升高。該指數(shù)取自然對數(shù)后，可得到臨床上評價胰島素敏感性水平的另一指標胰島素作用指數(shù)IAI(Insulin Affect Index)。HOMA-β是用于評價個體的胰島β細胞功能的指標。正常個體的HOMA-β指數(shù)為100％。糖尿病人群中，HOMA-β(Homeostasis Model ofβ-cell Function)指數(shù)會因疾病進程不同而偏離正常值，胰島β細胞功能降低則其數(shù)值降低，功能增強則其數(shù)值升高。趙文杰以桑白皮為研究對象，圍繞胰島素抵抗，采用立體細胞模型和整體動物模型，探討桑白皮降低血糖的作用及其機理。

本發(fā)明的胰島素指數(shù)表明，辣木葉黃酮灌胃21天后，與對照組相比均可降低HOMA-IR，提高HOMA-IS，降低IAI，提高HOMA-β，說明辣木葉黃酮的服用，可降低大鼠胰島素抵抗水平，增強機體對胰島素敏感性，提高胰島素作用，增強胰島β細胞功能的作用，辣木葉黃酮口服30mg/k。

其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的飼料按照文獻《2型糖尿病大鼠模型的建立及其在輔助降血糖功能評價中的應用》所記載的方法，選擇最佳配方制備高脂高糖飼料，即基礎飼料+10％豬油+20％蔗糖。將基礎飼料、蔗糖粉碎，豬油微熱融化后混勻，加水至合適的濕度，再制粒為直徑約1.5cm、長5-8cm的圓柱形顆粒。制粒完成后，置于40℃恒溫鼓風干燥箱中至干。制備好的高脂高糖飼料密封貯藏于避光、干燥處。每次制備量不超過大鼠飼喂一周量，防止飼料變質(zhì)，一天未吃完的飼料經(jīng)烘干后再飼喂。實驗大鼠飼喂于550×400×200mm的籠中，光照周期12h：12h，飼喂間內(nèi)通風，保持溫度恒定約25℃。定期更換墊料，每次更換時消毒液消毒鼠籠，保證大鼠籠衛(wèi)生。給予充足飲水與高脂高糖飼料飼喂30天。第31天，禁食不禁水24h。第32天以5‰STZ溶液(4℃預冷的0.1mM、pH4.5檸檬酸鹽緩沖液新鮮配制，避光溶解)，按40mg/kg體重劑量一次性腹腔注射大鼠，全部大鼠在30min內(nèi)全部注射完畢。此后給予飲水與飼料飼喂，每天定時投食，9：00與17:00，一天2次，根據(jù)大鼠尿量更換墊料，保持墊料干燥。

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為4.5-5.5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，其中A₂、A₁分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B₂、B₁分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值。

蘇木精-伊紅(Hematoxylin-EosinStaining，HE)染色法，是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著色紫藍色，細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)的成分著紅色，但是胰島與胰腺細胞區(qū)別不明顯，且胰島的幾種細胞難以區(qū)分。胰島的β細胞是嗜堿細胞，醛復紅對特殊的蛋白質(zhì)及含硫酸根的粘多糖具有很強的親和力，和彈性纖維結(jié)合很緊，另外對嗜堿細胞，能很好著色。利用醛復紅染色對胰腺進行染色，使胰島α、β細胞清晰可見，常用于觀察胰島細胞。

胰島組織HE染色時，發(fā)現(xiàn)血糖較高組的胰島發(fā)生病變較嚴重，尤其是胰島中間部位，細胞數(shù)量減少，通過醛復紅染色發(fā)現(xiàn)，減少的細胞大部分為胰島β細胞，說明了大鼠出現(xiàn)高血糖可能是因為β細胞發(fā)生了凋亡，使胰島素分泌減少，而異槲皮苷的服用產(chǎn)生了與磷酸西格列汀相似的作用，減少了β細胞凋亡的發(fā)生，從而保護胰島β細胞，使糖尿病大鼠胰島素分泌量增加，從而出現(xiàn)了血糖下降的現(xiàn)象。

目前國內(nèi)外對辣木葉提取物的研究，證明了辣木葉黃酮類化合物有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用。已報道的辣木葉黃酮乙醇回流提取法，耗時長，效率較低，且僅采用正交法優(yōu)化提取工藝。微波萃取用于黃酮類化合物提取，提取效率高、節(jié)省時間、節(jié)約溶劑、保護環(huán)境、節(jié)約成本。響應面法與正交法相比，能研究幾種因素的交互作用，越來越廣泛地運用在解決多變量問題。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以50-60％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:50-60g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為300-400W，提取時間為6-10min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

以下是采用微波萃取法單因素實驗，主要考慮乙醇濃度的影響、提取時間的影響、微波功率的影響、液料比的影響。

稱取5份辣木葉粉，每份1g，于微波萃取儀中提取。分別加入50％、60％、70％、80％、90％乙醇，微波功率200w，提取時間6min，液料比50:1，結(jié)果見圖1。由圖1，乙醇體積分數(shù)在60％時，黃酮得率最大，高于60％后，得率持續(xù)下降。因此，作為優(yōu)選的，選擇乙醇體積分數(shù)為60％。

稱取5份辣木葉粉，每份1g，加入60％乙醇，微波功率200w，液料比50:1，分別按提取時間6min、8min、10min、12min、14min于微波萃取儀中提取。結(jié)果見圖2。由圖2可見，隨時間延長，總黃酮得率升高，當提取時間為8min時，達到最高，因此，作為優(yōu)選的，選擇提取時間為8min。

稱取5份辣木葉粉，每份1g，加入60％乙醇，液料比50:1，微波功率分別為100w、200w、300w、400w、500w，提取8min。結(jié)果見圖3。由圖3可見，隨著提取功率增加，總黃酮得率增加，功率達到400w時最高，高于400w時則下降。因此，作為優(yōu)選的，選擇提取功率為400w。

稱取5份辣木葉粉，每份1g，分別按照30:1、40:1、50:1、60:1、70:1加入60％乙醇，微波功率400w，提取8min，于微波萃取儀中提取。結(jié)果見圖4。由圖4可見，隨著液料比增大，黃酮得率也隨之增加，當液料比為60:1時，總黃酮得率最高，大于60:1則出現(xiàn)下降。因此，選擇液料比為60:1。

所述的葡萄糖攝取試驗步驟中培養(yǎng)板的孔數(shù)為96孔。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

根據(jù)通過葡萄糖攝取試驗計算出葡萄糖攝取活性系數(shù)K，通過糖脂代謝活性試驗測定出大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)，以及通過胰島保護活性試驗計算胰島細胞數(shù)量變化率M及胰島β細胞增長率N，綜合判斷出辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性指數(shù)，給辣木葉的利用與開發(fā)提供了一個定量的標準，其中，對于葡萄糖攝取活性系數(shù)K大于1、血糖變化率大于50％、大鼠血脂指標含量不超標、大鼠血清SOD增長率為10-20％，MDA減少率在7％以上、，HOMA-IR指數(shù)在1以上，計算胰島細胞數(shù)量變化率M在6以上，胰島β細胞增長率N在5以上的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

于小蓉等在HPLC測定新疆藥桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素的研究中，各種成分出峰順序為綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素。郭炬亮等在HPLC測定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚的研究中，各種成分出峰順序為綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素。而本發(fā)明中辣木葉黃酮樣品中異槲皮苷與槲皮素含量最高，分別為41.42％和21.97％，說明辣木葉黃酮中以異槲皮苷與槲皮素兩種成分為主。這兩種成分均屬于黃酮醇類化合物，該類化合物是黃酮類化合物一重要分支，是許多中草藥的有效成分之一，具有防治心血管疾病、清除自由基、抗癌、抗菌、抗炎等多種藥理作用，成為化學合成研究的熱點。上一章得到乙酸乙酯部位黃酮含量為71.80％，異槲皮苷占該部位的41.42％，即占黃酮成分的57.69％，由此推斷，異槲皮苷為辣木葉黃酮的主要成分。

申請人多次的實驗結(jié)果表明，辣木葉黃酮濃度為異槲皮苷濃度10倍時，對葡萄糖的消耗高于異槲皮苷，但差異不顯著。這可能是因為辣木葉中不僅含有異槲皮苷，還含有槲皮素、綠原酸和山奈酚，這幾種成分均具有抗氧化、抗炎的作用，可促進細胞的生長，提高葡萄糖消耗量，這些成分的協(xié)同作用，提高了辣木葉黃酮對葡萄糖的消耗。辣木葉黃酮具有體內(nèi)降血糖活性，體外也表現(xiàn)出較高的葡萄糖消耗活性，其含量最高的成分異槲皮苷在體外也表現(xiàn)有降血糖活性，同時最近也有研究表明，異槲皮苷具有調(diào)節(jié)血糖及血脂改善胰島細胞功能的作用。從而推斷，異槲皮苷可能是辣木葉黃酮降血糖活性的主要成分。

本發(fā)明的有益效果是：通過葡萄糖攝取試驗計算出葡萄糖攝取活性系數(shù)K，通過糖脂代謝活性試驗測定出大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)，以及通過胰島保護活性試驗計算胰島細胞數(shù)量變化率M及胰島β細胞增長率N，綜合判斷出辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性指數(shù)，給辣木葉的利用與開發(fā)提供了一個定量的標準。

附圖說明

圖1為本發(fā)明乙醇濃度對黃酮得率的影響曲線圖；

圖2為本發(fā)明提取時間對黃酮得率的的影響曲線圖；

圖3為本發(fā)明微波功率對黃酮得率的的影響曲線圖；

圖4為本發(fā)明液料比對黃酮得率的的影響曲線圖；

圖5為本發(fā)明對照組HE染色的切片的顯微放大圖；

圖6為本發(fā)明樣品組HE染色的切片的顯微放大圖；

圖7為本發(fā)明對照組醛復紅染色的切片的顯微放大圖；

圖8為本發(fā)明樣品組醛復紅染色的切片的顯微放大圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。

實施例1

辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末100mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為1.0×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓10h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液180μL，再分別加入30μL樣品，孵育24h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，K＝1.2，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算，其中，對照組血糖從16.27增長到19.04，樣品組從16.34下降到10.12，血糖變化率為55％、大鼠血脂指標含量不超標，具體為LDL-C2.36mmol/L，HDL-C0.34mmol/L，T-CHO2.11mmol/L，TG1.21mmol/L，大鼠血清SOD含量在對照組中為160.92U/mL，在樣品組中為185.81U/mL，SOD變化率為15％，大鼠血清MDA含量在對照組中為30.68U/mL，在樣品組中為28.45U/mL，MDA變化率為7.8％，HOMA-IR指數(shù)為1.2；

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為4.5-5.5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，如圖5、圖6所示，其中A₂、A₁分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，A₁中有完整鼠胰臟細胞數(shù)量為接近2個，A₂中有完整鼠胰臟細胞數(shù)量為接近15-20個左右，胰島細胞數(shù)量變化率M為6；

根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B₂、B₁分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值，B₂中紅色區(qū)域面積(深色區(qū)域)為B₁中紅色區(qū)域面積的6-7倍，胰島細胞數(shù)量變化率N為5；。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以60％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:60g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為400W，提取時間為8min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的葡萄糖攝取試驗步驟中培養(yǎng)板的孔數(shù)為96孔。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

所述的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

實施例2

辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末80mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為0.8×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓12h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液160μL，再分別加入20μL樣品，孵育28h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，K＝1.05，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8:00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算，其中，血糖變化率為52％、大鼠血脂指標含量不超標，大鼠血清SOD變化率為13％，大鼠血清MDA變化率為8％，HOMA-IR指數(shù)為1.1；

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，如圖5、圖6所示，其中A₂、A₁分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率M為7；

根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B₂、B₁分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率N為6；。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以60％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:55g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為400W，提取時間為8min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

所述的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

實施例3

辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末90mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為1.5×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓12h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液200μL，再分別加入50μL樣品，孵育26h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，K＝1.3，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算，其中，血糖變化率為62％、大鼠血脂指標含量不超標，大鼠血清SOD變化率為17％，大鼠血清MDA變化率為9％，HOMA-IR指數(shù)為1.3；

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，如圖5、圖6所示，其中A₂、A₁分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率M為8；

根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B₂、B₁分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率N為6.5；。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以60％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:60g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為300W，提取時間為8min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

所述的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

實施例4

辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末100mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為1.2×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓10h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液200μL，再分別加入40μL樣品，孵育24h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，K＝1.12，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算，其中，血糖變化率為55％、大鼠血脂指標含量不超標，大鼠血清SOD變化率為12％，大鼠血清MDA變化率為7.9％,，HOMA-IR指數(shù)為1.12；

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，如圖5、圖6所示，其中A₂、A₁分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率M為8；

根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B₂、B₁分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率N為5；。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以60％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:60g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為400W，提取時間為6min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

所述的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

實施例5

辣木葉黃酮提取物的降糖、胰島保護活性試驗方法，它包含以下步驟：

S1、黃酮提取物的制備：稱取辣木葉黃酮粉末80mg，定容至1mL，混勻，經(jīng)0.22um濾器濾過，分裝成5個等量樣品，待用；

S2、葡萄糖攝取試驗：將試驗用HepG2細胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接種于培養(yǎng)板中，然后一起置于CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中，HepG2細胞溶液的細胞濃度為1.0×10⁵個/mL，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中初始葡萄糖的濃度，計為G₁，換無血清培養(yǎng)液，饑餓12h，加入DMEM高糖培養(yǎng)液180μL，再分別加入25μL樣品，孵育28h后用葡萄糖試劑盒測定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計為G₂，采用以下公式計算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n為培養(yǎng)板中試驗的孔數(shù)，根據(jù)葡萄糖攝取活性系數(shù)K，判斷樣品葡萄糖攝取活性，K＝1.4，G₀為同體積的異槲皮苷試驗樣品進行葡萄糖攝取試驗得到的葡萄糖消耗量，異槲皮苷試驗樣品中異槲皮苷的含量為0.0156mg/mL；

S3、糖脂代謝活性試驗：取用人工誘導2型糖尿病大鼠模型樣品組和對照組各10只，其中，人工誘導2型糖尿病大鼠模型的標準為空腹血糖大于7.8mmol/L，樣品組和對照組按樣品組的劑量給予等量的生理鹽水，于確定大鼠成模當天統(tǒng)一開始灌胃給藥，連續(xù)灌胃21天，每天8:00AM-9:00AM定時空腹給藥一次，灌胃后再給予等量的飼料與飲水，21天后取分別取各組大鼠的血糖變化率，大鼠血脂指標含量，大鼠血清SOD與MDA含量的測定以及胰島素指數(shù)的計算，其中，血糖變化率為54％、大鼠血脂指標含量不超標，大鼠血清SOD變化率為11.5％，大鼠血清MDA變化率為9％,，HOMA-IR指數(shù)為1.4；

S4、胰島保護活性試驗：將糖脂代謝活性試驗中樣品組和對照組的大鼠胰臟用波恩氏液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟后，用石蠟包埋，切片，厚度為5μm，30-45℃烘箱加熱固定，對胰腺切片進行HE染色和醛復紅染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察，并拍照記錄，根據(jù)HE染色的胰腺切片中胰島細胞的數(shù)量A₂與對照組中胰島細胞數(shù)量A₁，計算胰島細胞數(shù)量變化率M，如圖5、圖6所示，其中A2、A1分別為樣品組合對照組中HE染色的切片下的10只大鼠胰臟細胞數(shù)量的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率M為7；

根據(jù)醛復紅染色胰島β細胞所代表的紅色區(qū)域面積計算胰島β細胞增長率N，其中，B2、B1分別為樣品組合對照組中醛復紅染色的切片下10只大鼠胰島β細胞數(shù)量所代表的紅色區(qū)域面積的平均值，胰島細胞數(shù)量變化率N為7；。

所述的辣木葉黃酮粉末由以下方法制得：取辣木葉粉以50％v/v乙醇為溶劑，料液比為1:60g/ml，進行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率為400W，提取時間為10min，然后提取液濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇至干，無水乙醇復溶后靜置12小時濾過，除去水溶性雜質(zhì)，濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，除去乙醇，以蒸餾水稀釋，高濃度黃酮溶液分裝為2mL/管于15mL螺口帶蓋離心管，置于真空超低溫冷凍干燥儀48h，黃酮完全凍干為粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的試驗用HepG2細胞溶液是由以下方法制得：將HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入1640培養(yǎng)液，置于37℃、飽和濕度的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)液，3d后傳代，傳代數(shù)1:4，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

所述的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

結(jié)合誘導的2型糖尿病模型大鼠21天。對大鼠的各項指標進行測定后，最終發(fā)現(xiàn)：辣木葉黃酮具有改善糖尿病大鼠“三多一少”的癥狀，降低血糖、改善口服葡萄糖耐受量，減輕氧化應激、抑制炎性反應，降低胰島素抵抗水平，增加胰島素敏感性，增強胰島β細胞功能，且其降低糖尿病心血管疾病風險作用。同時通過HE染色、醛復紅染色對不同用藥組大鼠的胰島進行了觀察。最終發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮的對胰島保護的效果較好。鏡下表現(xiàn)為，胰島結(jié)構(gòu)較完整，胰島組織與腺泡界限清晰可見，胰島細胞較多，形態(tài)較好，排列整齊，胞漿豐富，胞核多數(shù)清晰，僅少量細胞變性或壞死，減少了糖尿病大鼠胰島β細胞的病變。因此，異槲皮苷對糖尿病大鼠胰島β細胞有保護的作用。基于以上試驗數(shù)據(jù)申請人得出，對于葡萄糖攝取活性系數(shù)K大于1、血糖變化率大于50％、大鼠血脂指標含量不超標、大鼠血清SOD增長率為10-20％，MDA減少率在7％以上、，HOMA-IR指數(shù)在1以上，計算胰島細胞數(shù)量變化率M在6以上，胰島β細胞增長率N在5以上的辣木葉黃酮提取物用于降低血糖、修復胰腺β細胞分泌胰島素功能的藥物及醫(yī)藥產(chǎn)品。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。