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血液剪切力應(yīng)答蛋白1在腦卒中疾病中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):12412558閱讀:303來源:國知局
血液剪切力應(yīng)答蛋白1在腦卒中疾病中的應(yīng)用的制作方法與工藝
本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域,特別涉及血液剪切力應(yīng)答蛋白R(shí)ECS1在腦卒中疾病中的應(yīng)用,具體是在制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)
:腦卒中疾病是全球第四大致死因素,僅次于心血管疾病、腫瘤和慢性下呼吸道疾病,也是最主要的導(dǎo)致終生殘疾的致病因素之一[1,2]。腦卒中主要分缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類,其中約80%的患者為缺血性腦卒中[3]。缺血性腦卒中系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死,進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。大腦缺血再灌注損傷可以引起多種不同但相互重疊的信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞存活或者死亡。神經(jīng)元局灶性腦缺血時(shí),梗死核心區(qū)絕大部分細(xì)胞均發(fā)生壞死,特征是能量供應(yīng)劇減導(dǎo)致細(xì)胞水腫、細(xì)胞器破裂及細(xì)胞不可逆的死亡。在缺血性卒中發(fā)生后,腦組織中興奮性氨基酸如谷氨酸大量且迅速的釋放,過度激活包括鈣超載、活性氧的產(chǎn)生等一系列下游的信號(hào)通路?;钚匝跷镔|(zhì)會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、線粒體和DNA損傷、激活或抑制許多炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死相關(guān)的信號(hào)通路[4]。與此同時(shí),缺血的腦組織會(huì)釋放損傷相關(guān)模式分子如熱休克蛋白、ATP、硫酸乙酰肝素、DNA、RNA等,進(jìn)而在趨化因子和粘附分子的調(diào)節(jié)下產(chǎn)生無菌性炎癥反應(yīng)[5,6]。缺血性腦卒中其病因可分為以下5類:大動(dòng)脈粥樣硬化、心源性、穿支動(dòng)脈疾病、其他病因、病因不確定[7]。RECSl(responsivetocentrifugalforceandshearstressgene1),是血液剪切力應(yīng)答蛋白(differentiatedembryo-chondrocyteexpressedgenel),屬于Bax抑制子-1(BI-1)家族的新成員。Nojima實(shí)驗(yàn)室最早報(bào)道血液剪應(yīng)力誘導(dǎo)RECS1的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并克隆得到RECS1的cDNA和氨基酸序列[8]。人RECS1有311個(gè)氨基酸是7次跨膜蛋白,與和谷氨酸結(jié)合蛋白具有很高的同源性[9]。RECS1是腫瘤壞死因子受體2(TNF2)的結(jié)合蛋白質(zhì),有報(bào)道表明穩(wěn)定表達(dá)RECS1的小鼠成纖維細(xì)胞對(duì)特異的激動(dòng)性抗體表現(xiàn)出一定的耐受性,表明RECS1可能參與TNF-α信號(hào)調(diào)控。免疫組化分析發(fā)現(xiàn),RECS1基因敲除的小鼠主動(dòng)脈基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)的表達(dá)水平明顯提高[10]。已有研究報(bào)道RECS1基因敲除小鼠年老時(shí)易患主動(dòng)脈囊性中層壞死,并表現(xiàn)為大動(dòng)脈擴(kuò)張癥[11]。近期的研究結(jié)果顯示,可減少細(xì)胞表面的Fas表達(dá),從而保護(hù)Fas配體誘導(dǎo)的凋亡,與神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育有密切關(guān)系。本研究的目的是確定RECS1基因的表達(dá)與腦卒中疾病的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系,以期望尋找一種治療腦卒中疾病的新靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn):[1]MozaffarianD,BenjaminEJ,GoAS,etal.HeartDiseaseandStrokeStatistics-2016Update:AReportFromtheAmericanHeartAssociation[J].Circμlation.2016,133(4):e38-e360.[2]RothwellPM,AlgraA,AmarencoP.Medicaltreatmentinacuteandlong-termsecondarypreventionaftertransientischaemicattackandischaemicstroke[J].Lancet.2011,377(9778):1681-1692.[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志.2015,48(4):246-257.[4]ChamorroA,DirnaglU,UrraX,etal.Neuroprotectioninacutestroke:targetingexcitotoxicity,oxidativeandnitrosativestress,andinflammation[J].LancetNeurol.2016,15(8):869-881.[5]ChenGY,NunezG.Sterileinflammation:sensingandreactingtodamage[J].NatRevImmunol.2010,10(12):826-837.[6]GelderblomM,LeypoldtF,SteinbachK,etal.Temporalandspatialdynamicsofcerebralimmunecellaccumμlationinstroke[J].Stroke.2009,40(5):1849-1857.[7]AdamsHJ,BendixenBH,KappelleLJ,etal.Classificationofsubtypeofacuteischemicstroke.Definitionsforuseinamμlticenterclinicaltrial.TOAST.TrialofOrg10172inAcuteStrokeTreatment[J].Stroke.1993,24(1):35-41.[8]YoshisueH,SuzukiK,KawabataA,etal.Largescaleisolationofnon-uniformshearstress-responsivegenesfromcμlturedhumanendothelialcellsthroughthepreparationofasubtractedcDNAlibrary[J].Atherosclerosis.2002,162(2):323-334.[9]ReimersK,ChoiCY,BucanV,etal.TheBaxInhibitor-1(BI-1)familyinapoptosisandtumorigenesis[J].CurrMolMed.2008,8(2):148-156.[10]ZhaoH,ItoA,SakaiN,etal.RECS1isanegativeregμlatorofmatrixmetalloproteinase-9productionandagedRECS1knockoutmicearepronetoaorticdilation[J].CircJ.2006,70(5):615-624.[11]ZhaoH,ItoA,KimuraSH,etal.RECS1deficiencyinmiceinducessusceptibilitytocysticmedialdegeneration[J].GenesGenetSyst.2006,81(1):41-50.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:為解決臨床防治腦卒中疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足,本發(fā)明的目的是確定RECS1基因的表達(dá)與腦卒中疾病之間的相互關(guān)系。提供一個(gè)用于治療腦卒中疾病的靶基因RECS1的新用途,進(jìn)而把RECS1基因應(yīng)用于腦卒中疾病的治療。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):本發(fā)明以神經(jīng)元特異性RECS1基因敲除和神經(jīng)元特異性RECS1基因過表達(dá)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷造成腦卒中模型,研究RECS1基因與腦卒中的關(guān)系,結(jié)果表明與野生型小鼠(對(duì)照組)相比,RECS1基因敲除小鼠梗死體積明顯增加,神經(jīng)功能明顯惡化,死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多;RECS1基因過表達(dá)小鼠梗死體積明顯降低,神經(jīng)功能明顯改善,死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,腺病毒介導(dǎo)的RECS1干擾可惡化原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的損傷,促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。這提示RECS1具有保護(hù)神經(jīng)功能的作用,能抑制腦卒中的發(fā)展,將為研究預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。本發(fā)明人的研究證明了:在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷造成腦卒中模型中,RECS1具有降低梗死體積,保護(hù)神經(jīng)功能,減少死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量,抑制腦卒中疾病發(fā)生的作用。針對(duì)RECS1的上述功能,提供RECS1作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。針對(duì)RECS1的上述功能,提供RECS1作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。以上藥物是指能夠促進(jìn)RECS1基因表達(dá)的藥物。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RECS1基因的新功能,即RECS1基因具有保護(hù)神經(jīng)功能,抑制腦卒中疾病發(fā)生的作用。(2)基于RECS1抑制腦卒中疾病發(fā)生的作用,其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物。附圖說明圖1是神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠和神經(jīng)元特異性RECS1敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定結(jié)果圖A為神經(jīng)元特異性RECS1敲除小鼠的構(gòu)建圖;B為神經(jīng)元特異性RECS1敲除小鼠的鑒定結(jié)果圖;C為神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建圖;D為神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果圖;圖2是RECS1flox/flox和RECS1-KO小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估結(jié)果圖(*:p<0.05vsRECS1flox/floxI/R組)。A為TTC染色結(jié)果圖;B為腦梗體積統(tǒng)計(jì)柱狀圖;C為神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)柱狀圖;圖3是NTG小鼠和RECS1-TG小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估結(jié)果圖(*:p<0.05vsNTGI/R組)。A為TTC染色結(jié)果圖;B為腦梗體積統(tǒng)計(jì)柱狀圖;C為神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)柱狀圖;圖4是RECS1flox/flox和RECS1-KO小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果圖(*:p<0.05vsRECS1flox/floxI/R組)。圖A為FluoroJadeB檢測顯示圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖;圖B為TUNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖;圖5是是NTG小鼠和RECS1-TG小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果圖(*:p<0.05vsNTGI/R組)。圖A為FluoroJadeB檢測顯示圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖;圖B為TUNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖;圖6為經(jīng)腺病毒AdshRECS1和AdshRNA轉(zhuǎn)染后OGD處理的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活性和乳酸脫氫酶釋放的結(jié)果圖(*:p<0.05vsAdshRNA組)。圖A為細(xì)胞相對(duì)活性檢測結(jié)果圖;圖B為乳酸脫氫酶釋放檢測結(jié)果圖;具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明,而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用雄性,8-12周齡,體重在24-27g,背景為C57BL/6的野生型小鼠(WT,購自北京華阜康生物科技有限公司,質(zhì)量合格證號(hào):949431)、神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠(RECS1-TG,由武漢大學(xué)李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)、非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG,同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠)、RECS1flox/flox小鼠(RECS1flox/flox,由武漢大學(xué)李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)及神經(jīng)元特異性RECS1基因敲除(RECS1-KO)小鼠(由RECS1flox/flox小鼠與CaMKIIα-Cre(購自JacksonLaboratory,StockNo.005359)小鼠雜交得到)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。(1)神經(jīng)特異性RECS1基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1A):利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)特異性RECS1基因敲除小鼠。首先,通過在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu)分別在內(nèi)含子3和4中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn),靶序列分別為:RECS1sgRNA1:GTAAGCGCTATACTATAAGCTGGRECS1sgRNA2:GGATCTACCGCTACGGTGATCGGACAG此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒,它包括兩側(cè)同源臂它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建:分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA,然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XbaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子,可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。②條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構(gòu)建:分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列:loxp1-F:AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT;loxp1-R:ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA;loxp2-F:GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA;loxp2-R:CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG;上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB,R0104L)和EcoRV(NEB,R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈,再將測序正確的載體用BamHI(NEB,R0136L)和SpeI(NEB,R0133L)雙酶切,連接入loxp2退火雙鏈,得到條件性敲除骨架載體,命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。③供體載體(DonorVector)的構(gòu)建:根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)如下引物(表1)以小鼠gDNA為模板,擴(kuò)增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物及pBluescriptSK(+)-2loxp載體經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后一一連接,得到供體載體。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)引物名稱引物序列酶切位點(diǎn)RECS1LA-FGGGGTACCCTATTGCAGGACCCAGAAGCKpnIRECS1LA-RGCGTCGACTCTAGGAAGCAGCTGGCATTSalIRECS1M-FTCTACCGGTGCGATGCCACTAGCCTGTAgeIRECS1M-RCGGGATCCTATAGTATAGCGCTTACTGCTCABamHIRECS1RA-FCGACGCGTAGCTGGATGCTGGGTAGGTMluIRECS1RA-RATAAGAATGCGGCCGCCACTTTCTGCCCTCCTCTTGNotI④打靶載體的轉(zhuǎn)錄:對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白,將其表達(dá)載體pST1374-Cas9(Addgene44758)用PmeI進(jìn)行酶切,以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板,用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345,Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾,獲得成熟的mRNA產(chǎn)物;對(duì)于sgRNA,使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354,Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen,217084)進(jìn)行純化。⑤RECS1flox/flox小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中,移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織,提取基因組,并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖,最終獲得RECS1flox/flox純合小鼠。⑤神經(jīng)特異性RECS1基因敲除小鼠的制作將上述RECS1flox/flox小鼠與神經(jīng)細(xì)胞特異性CaMKIIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,篩選得到RECS1flox/flox/CaMKIIα-Cre小鼠,待該小鼠長至6周齡左右后,腹腔注射Tamoxifen,誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá),Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp,并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp,最后得到神經(jīng)細(xì)胞特異性RECS1基因敲除小鼠。通過蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性RECS1基因敲除小鼠腦組織中RECS1蛋白的表達(dá)量:提取腦、脂肪、肺、腎臟組織蛋白,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),驗(yàn)證RECS1表達(dá),結(jié)果見圖1B,在小鼠脂肪、肺、腎臟組織中,WT型小鼠和基因敲除小鼠RECS1蛋白表達(dá)含量變化不大,而在腦組織中,相比于WT型小鼠,基因敲除小鼠RECS1蛋白表達(dá)含量明顯降低。(2)神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建過程(構(gòu)建策略見圖1C):用上游引物:5’-GGACTAGTGCCACCATGTCCAATCCCAGTGCC-3’;下游引物:5’-GGACTAGTTCAGTCTCTACTTCCTACGA-3’擴(kuò)增小鼠RECS1(NCBI,GeneID:69660,NM_027154.5)基因cDNA,把擴(kuò)增的RECS1基因cDNA和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實(shí)驗(yàn)室提供,制備過程參見參考文獻(xiàn):KimT,ZhelyabovskaO,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs),57.)經(jīng)限制性內(nèi)切酶SpeⅠ(NEB,R0145L)酶切后連接,形成pCAG-loxP-CAT-loxP-RECS1-hGHpA載體。RECS1的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到。將構(gòu)建的載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景),得到RECS1-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠由RECS1-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和CaMKIIα-Cre小鼠雜交繁殖得到。通過蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)實(shí)驗(yàn)檢測不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織中RECS1蛋白的表達(dá)量:提取不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織蛋白,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),驗(yàn)證RECS1過表達(dá)。我們構(gòu)建了幾株神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因小鼠(RECS1-TG1、TG3、TG4、TG7)。為了反映病理生理狀態(tài)下RECS1的改變,我們選擇了RECS1-TG3小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),WesternBlot及定量分析顯示,其腦組織中RECS1表達(dá)量分別約為正常組織4.20倍(圖1D)。飼養(yǎng)環(huán)境:所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24℃之間,濕度在40-70%之間,明暗交替照明時(shí)間為12h,自由飲水?dāng)z食。【實(shí)施例1】小鼠腦梗死模型獲得1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:小鼠腦梗死模型由大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(I/R)獲得。動(dòng)物被隨機(jī)分為4組,每組10只小鼠,分別為對(duì)照組:非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照I/R術(shù)組(NTGI/R)、RECS1flox/floxI/R術(shù)組(RECS1flox/floxI/R)以及神經(jīng)元特異性RECS1轉(zhuǎn)基因I/R術(shù)組(RECS1-TG3)、神經(jīng)元特異性RECS1基因敲除I/R術(shù)組(RECS1-KOI/R)2.線栓法腦梗死I/R手術(shù)MCAO(middlecerebralarteryocclusion,大腦中動(dòng)脈閉塞)模型操作流程:(1)抓取小鼠,使用3%異氟烷麻醉小鼠,8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛,顱頂鼠毛用手術(shù)剪迅速剪掉,3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次,75%酒精脫碘1次。(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口,暴露顱骨,用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2mm、左側(cè)5mm的部位。(3)將小鼠仰臥固定,頸正中線切口,沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA、CCA,在ECA遠(yuǎn)心端結(jié)扎和剪一小口,將線栓由剪口送入ICA,當(dāng)線栓進(jìn)入深度在9-11mm左右至血流下降遇阻力停,整個(gè)過程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5℃。(4)從線栓進(jìn)入腦血管至血流下降遇阻力時(shí)開始計(jì)時(shí),45min后將線栓拔出,并將ECA近心端結(jié)扎,迅速松開CCA處動(dòng)脈夾。注意觀察血流恢復(fù)情況,選擇血流下降75%以上,血流恢復(fù)達(dá)70%以上的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚,并用活力碘消毒傷口。手術(shù)結(jié)束后,將小鼠放在溫箱中,箱溫維持在28℃,給水和飼料,分別在24h、72h取材?!緦?shí)施例2】小鼠腦梗死模型腦梗死體積測定腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括大腦梗死體積和神經(jīng)功能評(píng)分,這些指標(biāo)均與缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。(1)分別在手術(shù)后24h、72h取材前進(jìn)行神經(jīng)功能及行為學(xué)評(píng)分;基于Berderson神經(jīng)功能評(píng)分改進(jìn)方法(9分制):0分:無神經(jīng)受損的癥狀;1分:提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢蜷曲,或者不能完全到達(dá)患側(cè)前肢;2分:提尾時(shí)對(duì)側(cè)肩膀內(nèi)收;3分:平推:向?qū)?cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降;4分:可自發(fā)的向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng),但在脫尾巴時(shí)只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎;5分:自發(fā)運(yùn)動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn);6分:無自主運(yùn)動(dòng),只在刺激時(shí)運(yùn)動(dòng);7分:無自主運(yùn)動(dòng),刺激時(shí)也無運(yùn)動(dòng);8分:與腦缺血有關(guān)的死亡。(2)抓取小鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,取腦。(3)將取下的腦組織放入1mm小鼠腦模,置于-20℃冰箱凍存。(4)腦組織2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloricej,TTC)染色:從-20℃冰箱取出腦組織,立即切成1mm厚的切片,共切7片。將切片立即置于10mL2%TTC溶液中,37℃恒溫孵育10min。正常腦組織染色后呈鮮紅色,而梗死區(qū)呈蒼白色。(5)用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片,大體拍照。(6)腦梗體積計(jì)算(Image-ProPlus6.0軟件):梗死體積%=(對(duì)側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)未梗死體積)/(對(duì)側(cè)大腦半球體積×2)×100%;總梗死體積為各自7張大腦切片結(jié)果數(shù)據(jù)之和。TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物,它是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體,與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色,而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降,不能反應(yīng),呈蒼白色。RECS1flox/flox、RECS1-KO組TTC染色結(jié)果如圖2A所示,經(jīng)過I/R缺血45min再灌注24小時(shí)后RECS1-KO小鼠梗死體積較對(duì)照組小鼠升高,且這種惡化作用在I/R術(shù)后72小時(shí)仍然持續(xù)(圖2B);且I/R組RECS1-KO小鼠神經(jīng)功能評(píng)分在術(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)均比對(duì)照組小鼠高(圖2C)。相反的,RECS1-TG小鼠I/R術(shù)后24h、72h梗死體積較對(duì)照組小鼠均降低(圖3A、B),神經(jīng)功能評(píng)分比對(duì)照組小鼠低(圖3C)。這一結(jié)果表明RECS1基因可減少缺血再灌注損傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死體積,可保護(hù)神經(jīng)功能,即RECS1基因?qū)θ毖俟嘧p傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死以及神經(jīng)功能損傷具有保護(hù)作用?!緦?shí)施例3】腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定1.腦組織冰凍切片制備(1)抓取小鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。(2)開胸暴露心臟,用注射針頭穿刺入左心室,同時(shí)剪開右心房。(3)用PBS(0.01M,pH7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變白后,用4%多聚甲醛灌流15min。(4)開顱迅速取出小鼠大腦,室溫4%多聚甲醛后固定6-8h。(5)切除腦組織的嗅球和小腦,再延正中線將大腦分為先后兩個(gè)部分,用先前的固定液再固定15min。(6)隨后浸沒于含30%蔗糖的PBS(0.01M,pH7.4)中,4℃冰箱沉底過夜。(7)30%蔗糖與OCT包埋劑按1:1(v/v)混合后,倒適量到包埋框中,將前一步的組織取出,在紗布上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會(huì)兒,再將其轉(zhuǎn)入到先已加入2滴OCT的另一個(gè)包埋框中,調(diào)整組織的位置,使其正好位于包埋框的正中。(8)將盛組織的包埋框,移入干冰中,盡量使其處于水平位,稍待一會(huì)兒后,繼續(xù)加入OCT,浸沒組織一定的高度,待OCT凝固后,將其儲(chǔ)存于-80℃的冰箱中。(9)用冰凍切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5μm的冰凍切片備用。2.FJB(FluoroJadeB)染色(1)將冰切組織切片在烘箱中烘干1小時(shí);(2)1%NaOH+80%無水乙醇5min;(3)70%無水乙醇2min;(4)ddH2O2min;(5)FlouroJadeB稀釋液(AG310,Millipore,Billerica,MA),室溫,避光20min;(6)ddH2O1min×3;(7)在烘箱中烘片5-10min;(8)二甲苯>1min;(9)封片,拍照。3、TUNEL試劑盒染色檢測凋亡用TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL試劑盒:PlusInSituApoptosisFluoresceinDetectionKit(S7111,Chemicon)):(1)將冰切組織切片置于(pH7.4)1%的多聚甲醛中,室溫固定水解10分鐘;(2)PBS洗兩次,每次5min;(3)置于預(yù)冷的乙醇:乙酸(2:1)溶液中,-20℃浸泡5分鐘,去除多余液體,但注意不要干燥;(4)PBS洗兩次,每次5min;(5)濾紙小心吸去多余液體,立即在切片上按75μl/5cm2直接加入平衡緩沖液,室溫孵育1-5min;(6)濾紙小心吸去多余液體,立即在切片上按55μl/5cm2直接加入TdT酶反應(yīng)液,置于避光保濕盒中作用1h(陰性對(duì)照加入不含TdT酶的反應(yīng)液);(7)將切片置于終止/洗滌緩沖液中,輕輕搖動(dòng)15sec,室溫孵育10min;此時(shí)準(zhǔn)備適量抗地高辛抗體,預(yù)熱至室溫,注意避光;(8)PBS洗三次,每次1min;(9)濾紙小心吸去多余液體,直接在切片上按65μl/5cm2加入抗地高辛抗體,室溫下于避光保溫濕盒中作用1h;(10)PBS洗四次,每次2min;(11)SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI(Invitrogen,S36939)封片;(12)熒光鏡下觀察,拍照。若需保存,于暗濕盒中4℃保存。在熒光顯微鏡下觀察,拍照,計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。(若需保存,于暗濕盒中4℃保存)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測定結(jié)果如圖4、圖5所示。圖4是RECS1-KO小鼠和RECS1flox/flox小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況,F(xiàn)luoroJadeB染色(A)和TUNEL染色(B)結(jié)果顯示RECS1-KO小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均比RECS1flox/flox小鼠升高。圖5是RECS1-TG3小鼠和NTG小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況,F(xiàn)luoroJadeB染色(A)和TUNEL染色(B)檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示RECS1-TG小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比NTG組小鼠低。這些結(jié)果表明,RECS1基因的表達(dá)可以改善腦組織缺血/再灌注損傷,且可能與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡密切相關(guān);RECS1基因可保護(hù)腦組織缺血/再灌注損傷的發(fā)生,抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡?!緦?shí)施例4】RECS1干擾(AdshRECS1)對(duì)缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響4.1新生SD乳鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)Sprague-Dawley乳鼠購買于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。(1)準(zhǔn)備培養(yǎng)平皿,加入DMEM培養(yǎng)基,在冰上預(yù)冷。(2)將出生1天的SD乳鼠,75%乙醇浸泡消毒。(3)用小剪和鑷子逐層分離乳鼠皮膚及顱骨,取出腦放入平皿并在冰上分離皮層。(4)將腦皮層轉(zhuǎn)入置于冰上的盛有DMEM液的培養(yǎng)皿中,剪碎腦組織。(5)將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)入15mL離心管,將DMEM液吸盡,加入0.125%酶消化液5mL。(6)將離心管置于37℃水中消化20min左右,用含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。(7)1000r/min離心×5min,吸棄上清,加入4ml含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸,用200目網(wǎng)篩過濾。(8)將細(xì)胞接種于10mg/L多聚賴氨酸過夜包被的培養(yǎng)皿。(9)4-6h后全量換成Neurobasal+B27培養(yǎng)基。(10)接種第2d,根據(jù)情況加入終濃度5μmol/L的阿糖胞苷處理24h后,全量換Neurobasal+B27培養(yǎng)液。(11)每隔兩天半量換液,第5d左右細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。4.2氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)(OGD):將細(xì)胞培養(yǎng)皿Neurobasal+B27培養(yǎng)液棄去,換成無血清無糖的OGD液,放入95%N2和5%CO2低氧培養(yǎng)裝置,培養(yǎng)1h,到時(shí)間后取出培養(yǎng)皿棄去ODG液換成Neurobasal+B27培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),到相應(yīng)的時(shí)間后,收集樣品。對(duì)照組在正常培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。4.3構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞:(1)AdshRNA和AdshRECS1載體的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):ChenK,GaoL,LiuY,etal.Vinexin-βprotectsagainstcardiachypertrophybyblockingtheAkt-dependentsignallingpathway[J].BasicResCardiol,2013,108(2):1-14.。(2)腺病毒的包裝:1)用PacI處理重組的陽性質(zhì)粒,用乙醇沉淀后重懸于20μl無菌水中。2)使用VigoFect將6μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染匯合率為50~70%的293A細(xì)胞,8h后移除混合液,加入4ml含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液,觀察綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率。3)轉(zhuǎn)染后的7~10d,觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)時(shí),用移液器將細(xì)胞吹下,移到50ml錐形離心管中。離心后用1mlPBS使細(xì)胞重懸。液氮凍結(jié)細(xì)胞,再用37℃水浴融化,并劇烈振蕩,重復(fù)4次。之后離心,取上清液,得到第一代病毒,-80℃保存。4)將293A細(xì)胞鋪在100mm培養(yǎng)皿內(nèi),匯合率為50~70%,加入含病毒的上清液0.5ml。2~3d可觀察到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象。感染后3~5d,當(dāng)1/3~1/2的細(xì)胞脫離時(shí)收集病毒,并按上述方法獲得病毒上清液。5)將獲得的病毒上清液感染100mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞,收集病毒,使其感染150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的293A細(xì)胞,進(jìn)一步擴(kuò)增,獲得足量病毒。6)將富集的病毒顆粒上清液滴加在CsCl梯度溶液上,30000rpm超速離心,4℃,16h。離心后出現(xiàn)兩個(gè)條帶,顏色弱、位置高的條帶為腺病毒空殼;顏色亮、位置低的條帶含活病毒顆粒,用16號(hào)針頭收集該條帶。7)之后在TBS中透析1h,再用含有10%甘油的TBS透析兩次,每次1h。將獲得的純化腺病毒裝進(jìn)EP管中。用紫外分光光度計(jì)測定透析液中的總蛋白,1μg病毒蛋白≈4×109病毒顆粒。腺病毒短期保存在4℃冰箱,長期應(yīng)保存在-80℃超低溫冰箱。(3)腺病毒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞:通過梯度感染法確定所需病毒用量。感染原代神經(jīng)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(mμltiplicityofinfection,MOI)為100:1。將Ploybrene加入培養(yǎng)液,二者比例為1:1000。感染后8~12h換液,加入適量完全培養(yǎng)基。4.4細(xì)胞活性的測定:細(xì)胞活性檢測用CCK8試劑盒,其原理是WST-8在電子耦合劑存在時(shí),可以被活細(xì)胞中的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物,進(jìn)而可以反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。用CCK8試劑盒(CK04,Dojindo,Japan)檢測神經(jīng)細(xì)胞活性,具體操作步驟按照說明書:(1)在神經(jīng)元培養(yǎng)96孔板中,感染相應(yīng)腺病毒,并OGD處理指定時(shí)間后。(2)加入10μl/每孔CCK-8溶液,空白對(duì)照組加入相應(yīng)量的培養(yǎng)液。(3)將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h。(4)在450nm測定吸光度,同時(shí)使用630nm的波長作為參考波長進(jìn)行波長測定。4.5細(xì)胞LDH釋放檢測:活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有乳酸脫氫酶(LDH),正常情況下,LDH不能透過細(xì)胞膜,當(dāng)細(xì)胞受到損傷后,LDH釋放到細(xì)胞外。進(jìn)而可以通過測定LDH的釋放來反應(yīng)細(xì)胞損傷毒性。用LDH試劑盒(G1782,Promega)檢測細(xì)胞釋放LDH,具體操作步驟按照說明書:(1)將培養(yǎng)的神經(jīng)元感染相應(yīng)病毒,并用OGD處理指定時(shí)間。(2)將待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出,放進(jìn)離心機(jī)以250g,離心4分鐘。(3)分別移取50μl/孔上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里,避免觸摸細(xì)胞,同時(shí)注意做好標(biāo)記。(4)每孔分別加入50μl底物混合液,混勻,在室溫下孵育30分鐘,避免光照。(5)每孔分別加入50μl終止液。在波長490nm測定吸光度值。RECS1干擾(AdshRECS1)對(duì)缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力結(jié)果如圖6所示。經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后,原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活力降低,乳酸脫氫酶的釋放量增加,而經(jīng)AdshRECS1轉(zhuǎn)染的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活力的下降程度以及乳酸脫氫酶釋放的增加程度明顯大于AdshRNA對(duì)照組。說明體外敲低RECS1基因可使原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞易發(fā)生缺氧/復(fù)氧損傷,促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果表明,在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的損傷中,RECS1敲除小鼠梗死體積顯著增加,神經(jīng)功能明顯惡化,凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯增加,RECS1過表達(dá)小鼠梗死體積明顯減少,神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn),凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也顯著降低,這說明RECS1基因表達(dá)可保護(hù)神經(jīng)功能,改善腦卒中。體外利用AdshRECS1敲低RECS1基因表達(dá)獲得與載體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果,敲低RECS1基因表達(dá)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)OGD處理后,細(xì)胞活力降低;說明RECS1在腦卒中疾病模型中有著重要的保護(hù)作用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>血液剪切力應(yīng)答蛋白1在腦卒中疾病中的應(yīng)用<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人類<400>1gtaagcgctatactataagctgg23<210>2<211>27<212>DNA<213>人類<400>2ggatctaccgctacggtgatcggacag27<210>3<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>7ggggtaccctattgcaggacccagaagc28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>8gcgtcgactctaggaagcagctggcatt28<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9tctaccggtgcgatgccactagcctgt27<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>10cgggatcctatagtatagcgcttactgctca31<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>11cgacgcgtagctggatgctgggtaggt27<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>12ataagaatgcggccgccactttctgccctcctcttg36<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>13ggactagtgccaccatgtccaatcccagtgcc32<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>14ggactagttcagtctctacttcctacga28當(dāng)前第1頁1 2 3 
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