專利名稱：用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)人血液蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及醫(yī)用生物制品——人血漿代用品、血液代用品及血液活性因子的生產(chǎn)技術(shù)。
一個(gè)世紀(jì)前，人們認(rèn)識(shí)到，大量失血致死的原因主要是由于循環(huán)血量的減少，而不是紅細(xì)胞的不足，從而采用了生理鹽水治療急性失血后的休克。同時(shí)，也促進(jìn)了血漿代用品的發(fā)展。
近年來，由于輸血對(duì)血液需求的迅速增長，而血液供應(yīng)卻遠(yuǎn)不能滿足需要，且從各個(gè)人體獲得的血液存在著引入愛滋病或其他致病原的危險(xiǎn)。同時(shí)，輸全血不僅不經(jīng)濟(jì)，而且從效果上來看也無必要。尤其在戰(zhàn)爭時(shí)期，大批傷員待處理，往往易發(fā)生血型錯(cuò)配和輸血后的血清性肝炎。另外，燒傷病人輸入過多全血反而會(huì)增加其心臟負(fù)擔(dān)，而慢性貧血病人輸入紅細(xì)胞濃縮液即可達(dá)到目的。因此，人血液或血漿代用品的開發(fā)無論和平時(shí)期還是戰(zhàn)時(shí)都具重大意義。
近年來生物醫(yī)學(xué)研究結(jié)果還表明，人血液中還含有許多調(diào)節(jié)人體機(jī)能的活性蛋白。如抗血友病的凝血因子、凝血酶原、纖維蛋白原、銅藍(lán)蛋白、特鐵蛋白，以及各種免疫球蛋白。這些蛋白質(zhì)在臨床上，也有著重要的應(yīng)用，而僅從人血液中提取遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。
目前，主要的血漿代用品有右旋酐、明膠、羥乙基淀粉及變性動(dòng)物血清。然而，這些代用品都存在很大的缺點(diǎn)或不足，還不能完全代替人類白蛋白和人血漿。右旋糖酐常使血管脆性增加，出血時(shí)間延長，引起變態(tài)反應(yīng)，促發(fā)充血性心衰或肺水腫的可能，導(dǎo)致腎小管阻塞，腎功能衰竭病人不能用。明膠制品也有導(dǎo)致過敏性休克發(fā)生的危險(xiǎn)。羥乙基淀粉代血漿輸注后的反應(yīng)，雖比中分子右旋糖酐少，但仍有創(chuàng)面出血現(xiàn)象。而變性動(dòng)物血清也存在導(dǎo)致手術(shù)創(chuàng)面流血及殘留動(dòng)物血清抗原的問題。
理想的血液代用品應(yīng)是無基質(zhì)血紅蛋白溶液，但是目前無基質(zhì)血紅蛋白仍只能由血漿生產(chǎn)剩余的血紅細(xì)胞或血庫中過期血液的紅細(xì)胞制備。因而也不能大量制備，存在來源緊缺的問題。
血液中活性細(xì)胞因子在血液中含量很低，更不能從人血中提取以滿足日益增長的臨床需要。
近年來發(fā)展起來的基因工程技術(shù)為工業(yè)生產(chǎn)理想的人血液代用品、血漿代用品及血液活性因子提供了有效高產(chǎn)的生產(chǎn)技術(shù)。
結(jié)合基因重組技術(shù)和動(dòng)物胚胎體外操作技術(shù)，發(fā)展出將外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)的技術(shù)。一般而言，通過基因重組技術(shù)可以獲得所要的蛋白產(chǎn)品的編碼基因，并與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)序列重組，然后通過哺乳動(dòng)物胚胎體外操作技術(shù)將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎內(nèi)，并把這些胚胎移入母體內(nèi)使之繼續(xù)發(fā)育至產(chǎn)仔。具體地說，包括以下步驟(1)分離編碼目的蛋白的基因，并進(jìn)行重組；(2)收集動(dòng)物受精卵；(3)將重組基因?qū)雱?dòng)物受精卵；(4)將轉(zhuǎn)移入外源基因的胚胎移入假孕母體內(nèi)，子代出生后，取其少部分組織制備DNA，用探針進(jìn)行雜交，以檢測外源基因的整合狀況。
上述方法已被用于將外源生物生長激素基困轉(zhuǎn)移入小鼠體內(nèi)，并獲得表達(dá)。然而在大動(dòng)物生產(chǎn)人血液蛋白質(zhì)方面尚未獲得成功。
本發(fā)明的目的是提供一種高效生產(chǎn)人類血液蛋白的方法，克服上述方法中一個(gè)或多個(gè)不足和/或缺陷。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其主要步驟包括1.分離編碼人類血液蛋白質(zhì)的基因，構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)重組基因；2.收集動(dòng)物胚胎；3.通過直接或間接的方法，將重組目的基因?qū)雱?dòng)物胚胎；4.培養(yǎng)導(dǎo)入重組基因的胚胎，或?qū)⑵湟浦踩虢?jīng)假孕處理的母體內(nèi)；5.子代出生后，取少量組織，通常是不太重要的部位，如尾部，制備DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探針雜交或印跡，以確定外源基因是否已整合入動(dòng)物基因組；同時(shí)檢測子代體內(nèi)目的蛋白的含量；6.整合表達(dá)重組基因的子代長成成體后，取其血液提取血液蛋白。
人血液蛋白質(zhì)主要指血紅蛋白、白蛋白、C-蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白，調(diào)理素蛋白、各種免疫球蛋白、凝血酶原和凝血因子。
動(dòng)物胚胎可以是成熟卵子、受精卵或附植前任一時(shí)期的胚胎。動(dòng)物可以是任何非人哺乳動(dòng)物，適當(dāng)?shù)膭?dòng)物包括豬、羊、牛、兔，動(dòng)物胚胎的收集可根據(jù)現(xiàn)有方法進(jìn)行。
導(dǎo)入重組基因的直接方法包括顯微注射法、電脈沖介導(dǎo)法、病毒載體轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體或原生質(zhì)體融合法，間接方法包括經(jīng)原生殖細(xì)胞、精子載體法、胚細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞嵌合法?？筛鶕?jù)所具備的條件選擇適宜的導(dǎo)入方法。
假孕母體指與胚胎來源同種的成年雌性動(dòng)物，經(jīng)外源激素進(jìn)行同期發(fā)情處理。可根據(jù)現(xiàn)有方法處理成年雌性動(dòng)物，使之同期發(fā)情。
重組基因整合狀況的檢測可以在胚胎附植前進(jìn)行。取少量胚胎細(xì)胞，制備DNA，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增可能存在的外源基因，用預(yù)先制備的探針進(jìn)行雜交檢測。這樣，在移植前便可得知重組基因的整合情況，從而只將有外源基因整合的胚胎移植入假孕母體，或供細(xì)胞核移植以產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)基因胚胎，而產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
血液蛋白質(zhì)的提取，可根據(jù)現(xiàn)有方法從成年轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液中提取。
下面非限制的實(shí)施例將簡要地對(duì)上述方法作進(jìn)一步說明實(shí)施例人類白蛋白的動(dòng)物合成一、人類血液白蛋白基因的分離1.建立人成纖維細(xì)胞基因組文庫，收集人成纖維細(xì)胞，破碎后提取DNA.用EcoRI對(duì)總DNA進(jìn)行部分酶切，用噬菌體建基因文庫(Sambrook，J，etal，1989)2.構(gòu)建人白蛋白基因的特異探針根據(jù)已知的人白蛋白基因序列(Urano，etaL，1984，1986)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，一個(gè)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(5側(cè))500bp處，另一個(gè)在下游300bp左右，引物同時(shí)引入酶切位點(diǎn)。用此二引物對(duì)提取的人成纖維細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后用Klenow酶修補(bǔ)未端，再用激酶在片段末端加上磷酸基因。65℃下孵育10分鐘，滅活此二酶。
同樣，根據(jù)已知的基因序列，設(shè)計(jì)人白蛋白的基因編碼區(qū)最未端上下游400bp左右點(diǎn)的引物，以上述基因組DNA擴(kuò)增一段白蛋白基因3’末端序列。
此二序列經(jīng)酶切后，作亞克隆(Taber，etal，1987)進(jìn)行序列分析，與已知的人白蛋白基因序列對(duì)照。
3.人白蛋白基因DNA片斷的篩選上述二亞克隆DNA片段，經(jīng)32P-標(biāo)記(Grouse，etal，1987)后，作為探針，從上述人基因組文庫篩選白蛋白基因。將探針雜交陽性的噬菌斑挑出，進(jìn)一步侵染、擴(kuò)增，取少量提取DNA，酶切，分析其序列。
二、豬血液白蛋白基因啟動(dòng)子的分離以同樣方法建立豬基因組文庫，分離出豬白蛋白基因編碼區(qū)上游及其下游(含少量編碼區(qū)序列)兩段DNA序列酶切，分析其序列。
用5’端片段，5’端和3’端序列分別與CAT基因(氯胺苯醇乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，哺乳類細(xì)胞中沒有的)重組(Gorman，C.N，etal，1983)，構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。培養(yǎng)44小時(shí)后，檢測基因表達(dá)產(chǎn)物，以確定豬白蛋白基因5’端片斷和3’端片斷對(duì)其間基因表達(dá)的作用，選出啟動(dòng)因子三、構(gòu)建豬血白蛋白基因啟動(dòng)子/人白蛋白基因的融合基因上述分離到豬血白蛋白基因啟動(dòng)子，經(jīng)擴(kuò)增酶切，與人白蛋白基因編碼區(qū)重組，用Klenow酶修補(bǔ)末端，插入適當(dāng)質(zhì)粒中，進(jìn)行克隆，(Messing，etal，1983)四、重組基因?qū)胴i受精卵上述重組基因克隆后，用內(nèi)切酶從質(zhì)粒切下，電泳分離，提純沉淀DNA片段，溶于10mM Tris，0.1mM EDTA(pH7.2)的緩沖液中，濃度為1-2ug/ml。
根據(jù)現(xiàn)有方法，對(duì)成年母豬進(jìn)行超數(shù)排卵處理，同時(shí)預(yù)備假孕的受體母豬。超排母豬人工授精后，從其體內(nèi)收集受精卵，以15000g離心5分鐘。將制備的重組基因注射入受精卵雄原核，每個(gè)卵約注射1-3pl，相當(dāng)于20-100拷貝基因，注射后的受精卵部分進(jìn)行體外培養(yǎng)，部分移入假孕受體母豬，使之懷孕。
五、重組人白蛋白基因在豬胚胎或仔豬中整合表達(dá)的檢測上述體外培養(yǎng)的胚胎，發(fā)育至桑椹胚胎至囊胚時(shí)，從胚胎上吸取少量細(xì)胞，制備DNA部分酶切經(jīng)PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行點(diǎn)印跡、條印跡及Southern分析(King，D.etal，1988)。
移入假孕母體的胚胎發(fā)育至仔豬出生后，取其尾部少量組織，制備DNA進(jìn)行分析，用抗人白蛋白特異性抗體檢測仔豬血液中人白蛋白的存在。
六、人白蛋白的提取純化成功地整合表達(dá)重組人白蛋白基因的仔豬，喂養(yǎng)成長后，即可采血提取人白蛋白，并純化之。
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1.用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)人類血液蛋白，其包括(1)分離人血液蛋白基因，與動(dòng)物基因表達(dá)序列重組；(2)收集動(dòng)物胚胎；(3)將重組人血液蛋白基因直接或間接地導(dǎo)入動(dòng)物胚胎；(4)培養(yǎng)導(dǎo)入重組基因的胚胎，或?qū)⑵湟浦踩虢?jīng)假孕處理的成年雌性動(dòng)物體內(nèi)；(5)檢測重組基因的整合表達(dá)效果；(6)采取已成功整合表達(dá)重組人血液蛋白基因的動(dòng)物血液，提取人血液蛋白質(zhì)，并純化之；
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，人血液蛋白指人血液中起重要作用的蛋白，主要包括血紅蛋白、白蛋白、C-蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原、銅藍(lán)蛋白、調(diào)理素蛋白、凝血酶原、凝血因子及各種免疫球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，動(dòng)物指非人哺乳動(dòng)物，合適的動(dòng)物包括豬、羊、牛、兔。動(dòng)物的胚胎可以是成熟卵子、受精卵、及附植前各發(fā)育時(shí)期的胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，重組基因的導(dǎo)入可選用以下任一種方法顯微注射法、電脈沖介導(dǎo)法、病毒載體轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體或脂質(zhì)體融合法、經(jīng)原生殖細(xì)胞及精于載體法、胚細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞嵌合法。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及醫(yī)用生物制品——人血漿代用品，血漿代用品及血液活性因子的生產(chǎn)技術(shù)。用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)人類血液蛋白質(zhì)的方法，其包括(1)分離人血液蛋白編碼基因的DNA片段，構(gòu)建重組基因；(2)收集動(dòng)物胚胎；(3)直接或間接地將重組基因?qū)雱?dòng)物胚胎；(4)培養(yǎng)或?qū)⑸鲜雠咛ヒ浦踩爰僭心阁w；(5)檢測重組基因的整合與表達(dá)；(6)采取成功整合并表達(dá)重組人血液蛋白基因的動(dòng)物血液，提取人血液蛋白質(zhì)，并純化之。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1114196SQ9410731
公開日1996年1月3日 申請(qǐng)日期1994年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月1日
發(fā)明者唐勇煒 申請(qǐng)人:唐勇煒