專利名稱：來自血液的間-α抑制物蛋白的制備和組合物的制作方法
來自血液的間-α抑制物蛋白的制備和組合物相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2008年5月28日提交的美國臨時申請NO. 61/130，269的權(quán)益，通過引用 將其全部內(nèi)容合并在文本中。關(guān)于在聯(lián)邦政府贊助的研究之下完成的發(fā)明的權(quán)利的聲明
這些工作由國家衛(wèi)生研究所/國家普通醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所撥款、撥款m 2R44GM65667-02和1R43GM079071-01A1支持。政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)益。
背景技術(shù)：
膿毒癥和全身性炎性反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)都涉及在暴露于傳染原(例如，細(xì)菌毒素，如炭疽)之后，或來自損傷或外傷的嚴(yán)重的 生化反應(yīng)。全身性應(yīng)答可能導(dǎo)致膿毒性休克，其特征在于血壓的急劇降低、心血管虛脫和/ 或多器官衰竭。盡管在超過五十年前引入了抗生素，在被診斷患有膿毒性休克的受試者中 死亡率是30-50%，高于乳腺癌、結(jié)腸癌或前列腺癌的死亡率。在美國每年有大約800，000例 膿毒癥病例，代價為170億美元，與世界上其他地區(qū)數(shù)量相等。由于抗生素抗性和提高的生 物學(xué)威脅，膿毒癥和SIRS在全世界快速地增多。當(dāng)人們考慮潛在的關(guān)聯(lián)的世界大流行(例 如，禽流感)或生物恐怖主義時，“風(fēng)險”群體是實質(zhì)上更大的。在生物恐怖主義或戰(zhàn)場暴露 中，死亡率預(yù)計更高得多。使用常規(guī)的藥物快速和可靠地治療膿毒癥、SIRS和膿毒性休克 是困難的。間-α 抑制物蛋白(inter-alpha inhibitor protein) (I α Ip)家族是一組血 漿相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制物，其調(diào)節(jié)身體對伴隨膿毒癥、感染、外傷和損傷的嚴(yán)重全身性 炎癥的應(yīng)答。間-α抑制物蛋白(I α Ip)已經(jīng)顯示了改善患有膿毒癥；感染炭疽、Ebola或 登革熱病毒；或由于對有毒化學(xué)品或電離輻射的暴露遭受肺部損傷的測試動物的存活和狀 況。Ia Ip是分離自血液的大的蛋白質(zhì)。由于間-α抑制物蛋白在治療膿毒癥和SIRS中的 治療用途，純化或制備I α Ip的方法是迫切需要的。發(fā)明概述
如下所述，本發(fā)明涉及純化間-α抑制物蛋白(I α IP)的方法，以及它們用于治療疾病 或其癥狀的用途，包括疾病例如膿毒癥、急性炎癥性疾病、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病和早產(chǎn)；或降低與膿毒癥、急性炎癥性疾病、嚴(yán)重休克、 膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病和早產(chǎn)相關(guān)的死亡的風(fēng)險。在一個方面，本發(fā)明提供了純化間-α抑制物蛋白(I α Ip蛋白)的方法，所述方法 涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低(例如，3. 7,3. 5,3. 4,3. 3,3. 1,3. 0,2. 9,2. 0)的 PH值的條件下的步驟。在一個方面，本發(fā)明提供了含有根據(jù)一方法純化的I α Ip蛋白的組合物，所述方 法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的PH值的條件的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有有效劑量的根據(jù)一方法純化的I α Ip蛋白和藥 學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物，所述方法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的 PH值的條件的步驟。
在又一個方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者中疾病或疾病癥狀的方法，包括 向所述受試者施用含有根據(jù)涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的PH值的條件的步 驟的方法純化的I α Ip蛋白的組合物。在再另一個方面，本發(fā)明提供了用于純化I α Ip蛋白的試劑盒，其具有PH值約4.0 或更低的至少一種緩沖溶液和使用所述試劑盒的說明。在一個實施方式中，所述試劑盒具 有至少一種緩沖溶液，其是具有約4. 0或更低的ρΗ值的洗滌緩沖液。在另一個實施方式中， 所述試劑盒具有至少兩種緩沖溶液，它們是具有約4. 0或更低的ρΗ值的洗滌緩沖液。在具 體的實施方式中，第一洗滌緩沖液具有約4. 0的ρΗ值，第二洗滌緩沖液具有約3. 3的ρΗ值。 在另一個具體的實施方式中，第一洗滌緩沖液具有約4. 0的ρΗ值，第二洗滌緩沖液具有約 2. 9的ρΗ值。在另外的方面，本發(fā)明提供了用于治療用途的具有組合物的試劑盒，所述組合物 含有根據(jù)一方法純化的ι α Ip蛋白，所述方法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的 PH值的條件的步驟。在另外的方面，本發(fā)明提供了用于分析用途的具有組合物的試劑盒，所述組合物 含有根據(jù)一方法純化的ι α Ip蛋白，所述方法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的 PH值的條件的步驟。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用于純化間-α抑制物蛋白(I α Ip蛋白)的方法， 所述方法涉及將血液、血漿組分、或中間血漿組分放置在層析柱上，使所述柱經(jīng)受具有約 4. 0或更低ρΗ值的洗滌緩沖液。在又一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了通過一方法制造的純化的間- α抑制物蛋白 (I α Ip蛋白)，所述方法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約4. 0或更低的ρΗ值的條件，和其中 所述I α Ip蛋白在競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中與參考物相比實現(xiàn)提高的結(jié)合的步 驟。在一個實施方式中，與參考物(例如，未用低ρΗ值處理的Ia Ip蛋白)相比，I α Ip蛋白 的結(jié)合提高至大于1、1· 5、2、3、4、5或10倍。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述方法涉及其 中I α Ip蛋白暴露于約3. 6或更低的ρΗ值的條件的步驟。在各種實施方式中，所述方法涉 及其中I α Ip蛋白暴露于約3. 3或更低的ρΗ值的條件的步驟。在各種實施方式中，所述方 法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約3. 3到約3. 1之間的ρΗ值的條件的步驟。在各種實施方 式中，所述方法涉及其中I α Ip蛋白暴露于約3. 1到約2. 9之間的ρΗ值的條件的步驟。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述方法涉及層 析步驟或固相提取步驟。在各種實施方式中，所述層析步驟包含液相層析、柱層析、陰離子 交換層析或其組合。在各種實施方式中，所述層析涉及單片支持物或基于顆粒的支持物的 使用。在各種實施方式中，所述單片支持物或顆粒支持物涉及固定的陰離子交換配體。在 各種實施方式中，所述固定的陰離子交換配體是二乙基氨基乙烷(DEAE)或季胺(Q)。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述方法涉及至 少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約4. 0或更 低的PH值。在各種實施方式中，所述方法涉及至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一 個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 6或更低的ρΗ值。在各種實施方式中，所述方 法涉及至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 3或更低的pH值。在各種實施方式中，所述方法涉及至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述 至少一個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 1或更低的pH值。在各種實施方式中，所 述方法涉及至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具 有約3.1到約2. 9之間的pH值。在各種實施方式中，所述間-α抑制物蛋白(Ια ρ蛋白) 結(jié)合所述柱。在各種實施方式中，所述間_α抑制物蛋白(I α Ip蛋白)是分離的。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述方法涉及其 中所述I α Ip蛋白暴露于約250 mM NaCl或更高的鹽的濃度(例如，260、270、280、290 mM NaCl)的步驟。在此處描述的任何上述方面的各種實施方式中，所述方法涉及至少一個緩沖 液洗滌步驟，其中所述洗滌緩沖液具有約250 mM NaCl或更高的鹽的濃度(例如，260、270、 280、290 mM NaCl)0在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述I α Ip蛋白 是從血液純化的。在各種實施方式中，所述I α Ip蛋白是從血漿或血漿組分純化的。在各 種實施方式中，所述血漿是冷凍貧乏的(cryo-poor)血漿，或所述血漿組分是中間血漿組 分。在各種實施方式中，所述中間血漿組分是含有I α Ip的組分。在各種實施方式中，所述 血液、血漿組分或中間血漿組分是人類、靈長類、牛、馬、豬、羊、貓、犬或其組合的。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述I α Ip蛋白 具有約60到約280 kDa之間的表觀分子量。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明 的各種實施方式中，所述I α Ip蛋白或組合物具有約85%到約100%純的純度。在任何上述 方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述I α Ip蛋白或組合物具有約85% 到約100%的產(chǎn)率。在某些實施方式中，所述I α Ip蛋白或組合物可以用于分析用途(例如， 來測定未知I α Ip濃度的樣品中I α Ip的數(shù)量)。在某些實施方式中，所述I α Ip蛋白或組 合物具有生物學(xué)活性。在各種實施方式中，所述生物學(xué)活性是細(xì)胞因子抑制物活性、趨化因 子抑制物活性或絲氨酸蛋白酶抑制物活性。在各種實施方式中，所述方法涉及處在層析步 驟之前或之后的病毒滅活步驟或納濾步驟。在任何上述方面或在此描述的任何其他發(fā)明的各種實施方式中，所述組合物或藥 物組合物用于有需要的受試者中的治療。在各種實施方式中，所述受試者被鑒定為需要用 所述組合物治療。在各種實施方式中，所述受試者被鑒定為需要急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán) 重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病或早產(chǎn)的 治療。在任何上述方面的各種實施方式中，有需要的受試者是人類、靈長類、牛、馬、豬、羊、 貓或犬。本發(fā)明提供了從血漿制備或純化間-α抑制物蛋白(I α Ip)的方法。根據(jù)詳細(xì)說 明和根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將是明顯的。定義
如在此使用的，“改變”是指由本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法、如此處描述的那些來檢測的， I α Ip蛋白的產(chǎn)率、數(shù)量、濃度、活性、純度或水平的變化(提高或降低)。如在此使用的，改變 包括在產(chǎn)率、純度或活性方面10%的改變，優(yōu)選的在表達(dá)水平方面25%的改變、更優(yōu)選的40% 的改變以及最優(yōu)選的50%或更高的改變。“類似物”是指具有參考多肽或核酸分子的功能的、結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽或核酸分子。
“化合物”是指任何小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽、或其片段。“降低”或“提高”分別是指至少10%、25%、50%、75%或100%的負(fù)的或正的改變?！笆茉囌摺笔侵覆溉閯游铮ǖ幌抻?，人類或非人類哺乳動物，例如，靈長類、 牛、馬、豬、羊、貓或犬。如在此使用的，術(shù)語“治療”等等是指降低或改善病癥和/或與之相關(guān)的癥狀。要 理解的是，雖然沒有排除，治療病癥或狀況不需要所述病癥、狀況或與之相關(guān)的癥狀被完全 消除。如在此使用的，術(shù)語“預(yù)防”或“預(yù)防性治療”等等，是指降低受試者中發(fā)生病癥或 狀況的概率，所述受試者不患有、但是處在發(fā)生病癥或狀況的風(fēng)險中或?qū)Πl(fā)生病癥或狀況 是敏感的?！皡⒖肌笔侵笜?biāo)準(zhǔn)或?qū)φ盏臈l件。在本公開中，“包含”、“含有”和“具有”等等可以具有在美國專利法中歸于它們的 含義，可以指“包括”等等；“基本上由……組成”或“基本上組成”同樣具有在美國專利法中 歸于它們的含義，該術(shù)語是開放式的，容許敘述內(nèi)容之外的內(nèi)容的存在，只要所敘述內(nèi)容的 基礎(chǔ)的或新的特征不由敘述內(nèi)容之外的內(nèi)容的存在而改變，但是排除現(xiàn)有技術(shù)實施方式。附圖的簡要說明
附

圖1A-1B描述了利用單個層析步驟從人血漿中純化I α Ip的方案。附圖IA描述了 利用低PH值洗滌步驟從人血漿中純化I α Ip的方案。附圖IB描述了利用鹽緩沖液洗滌步 驟和低PH值洗滌步驟從人血漿中純化I α Ip的方案。附圖2A-2C顯示了利用低ρΗ值洗滌步驟(ρΗ 4. 0或ρΗ 3. 3)通過DEAE層析從血 漿(組分D和組分C)純化I α Ip蛋白。附圖2Α顯示了利用用洗滌緩沖液(25 mM Tris, 200 mM NaCl, ρΗ 7. 8)的一個洗滌步驟通過DEAE層析(單片支持物；流動速度5 mL/分鐘)分 離的、用洗脫緩沖液(100 mM Tris,1000 mM NaCl,ρΗ 7. 6)洗脫的血漿(在25 mM Tris, 200 mM NaCl,pH 7. 8中1 100稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖2B顯示了利用使用低ρΗ值洗滌 緩沖液(150 mM乙酸，ρΗ 4. 0)的一個洗滌步驟通過DEAE層析(單片支持物；流動速度5 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, ρΗ 7. 6)洗脫的血漿(在 25mM Tris,200 mM NaCl、ρΗ 7. 8中1 :100稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖2C顯示了利用 使用低PH值洗滌緩沖液(150 mM乙酸，ρΗ 3. 3)的一個洗滌步驟通過DEAE層析(單片支持 物；流動速度5 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl，pH 7.6) 洗脫的血漿(在25 mM Tris, 200 mM NaCl，ρΗ 7. 8中1 :100稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖3顯示了利用使用兩種低ρΗ值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 150 mM乙酸，ρΗ 4. 0 ；洗滌緩沖液#2 200 mM乙酸，ρΗ 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(單片支持物) 分離的、用100 mM Tris+1000 mM NaCl,ρΗ 7. 6洗脫的冷凍貧乏的血漿(在25 mM Tris, 200 mM NaCl, ρΗ 7. 8 中 1 :100 稀釋物 1 mL)的 UV 曲線。附圖4A-4D顯示了利用單個低ρΗ值洗滌步驟(ρΗ 3.3)或兩個低ρΗ值洗滌步驟 CpH 4.0和ρΗ 3. 3)通過DEAE層析的中間血漿的分級(組分D和組分C)。附圖4A顯示了 利用使用低PH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 150 mM乙酸，ρΗ 4.0)的一個洗滌步驟通過 DEAE層析(單片支持物；流動速度5 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl,pH 7. 6)洗脫的中間血菜(在 25 mM Tris, 200 mM NaCl，pH 7. 8 中組分 D 的 1 :200稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖4B顯示了利用使用低pH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 :150 mM乙酸，PH 4.0)的一個洗滌步驟通過DEAE層析(1 mL單片支持物；流動速度5 mL/分鐘) 分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris,1000 mM NaCl,pH 7. 6)洗脫的中間血漿組分(在25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7. 8中組分C的1 :200稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖4C顯示 了利用使用兩種低PH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 150 mM乙酸，pH 4. 0 ；洗滌緩沖液#2 200 mM乙酸，pH 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(1 mL單片支持物；流動速度5 mL/ 分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris,1000 mM NaCl，pH 7. 6)洗脫的中間血漿(在 25 mM Tris,200 mM NaCUpH 7. 8中組分D的1 :200稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖4D顯 示了利用使用兩種低PH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 :150 mM乙酸，pH 4. 0 ；洗滌緩沖液 #2 200 mM乙酸，pH 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(1 mL單片支持物；流動速度5 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl,pH 7. 6)洗脫的中間血漿 組分(在25 mM Tris,200 mM NaCUpH 7. 8中組分C的1 :200稀釋物1 mL)的UV曲線。附圖5顯示了由Western印跡分析的通過DEAE單片柱層析的I α Ip蛋白的純化。 顯示了來自中間血漿組分(組分D和組分C)的兩種層析分離的分析。對于每種層析分離， 起始材料(SM)每個泳道加載相等的數(shù)量，洗滌#1組分(W#l)、洗滌#2組分(W#2)和洗脫 物(E)通過SDS-PAGE (6%;非變性的)分離。顯示了來自冷凍貧乏血漿的層析分離的洗脫 物(E)用于比較。SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，其用抗人類I α Ip (MAb 69. 26)作為初級抗體來探測。附圖6A-6F顯示了利用兩個低pH值洗滌步驟(pH 4. 0和pH 3. 3)通過DEAE層析 從冷凍貧乏血漿或中間血漿(組分D和組分C)純化I α Ip蛋白是規(guī)模可變的。附圖6Α顯 示了利用使用兩種低PH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 :150 mM乙酸，pH 4. 0 ；洗滌緩沖液 #2 200 mM乙酸，pH 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(8 mL單片支持物；流動速度40 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl,pH 7. 6)洗脫的冷凍貧乏 血漿(起始材料在25 mM Tris, 200 mM NaCl，pH 7. 8中組分C的1 :10稀釋物25 mL)的 UV曲線。附圖6B顯示了通過SDS-PAGE (4-20%梯度)分析的，通過DEAE單片層析(起始材 料(SM)，洗滌#1 (W#l)、洗滌#2 (ff#2)和洗脫物(EL))來自冷凍貧乏血漿的分離的組分。 附圖6C顯示了利用使用兩種低pH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 150 mM乙酸，pH 4. 0 ；洗 滌緩沖液#2 200 mM乙酸，pH 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(8 mL單片支持物；流 動速度40 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM TrisUOOO mM NaCl、pH 7. 6)洗 脫的中間血漿(起始材料在25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7. 8中組分D的1 :125稀釋物 2 mL)的UV曲線。附圖6D顯示了通過SDS-PAGE (4-20%梯度)分析的，通過DEAE單片層 析(起始材料(SM)，洗滌# 1 (W# 1)、洗滌#2 (W#2 )和洗脫物(EL ))來自中間血漿(組分D )的 分離的組分。附圖6E顯示了利用使用兩種低pH值洗滌緩沖液(洗滌緩沖液#1 :150 mM乙 酸，pH 4. 0 ；洗滌緩沖液#2 200 mM乙酸，pH 3. 3)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(8 mL單 片支持物；流動速度40 mL/分鐘)分離的、使用洗脫緩沖液(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7. 6)洗脫的中間血漿組分(起始材料在25 mM Tris, 200 mM NaCl,pH 7. 8中組分C的 1 125稀釋物2 mL)的UV曲線。附圖6F顯示了通過SDS-PAGE (4-20%梯度)分析的，通過 DEAE單片層析(起始材料(SM)，洗滌#1 (W#l)、洗滌#2 (ff#2)和洗脫物(EL))來自中間血 漿(組分C)的分離的組分。
附圖7A和7B顯示了使用利用鹽緩沖液(大于250mM NaCl)的洗滌步驟和低pH值 洗滌步驟(PH 2. 95)通過DEAE層析從冷凍貧乏的血漿或中間血漿組分純化Ia Ip蛋白。附 圖7A顯示了利用使用鹽洗滌緩沖液(10倍柱體積的40 mM Tris_HCl、290mM NaCl pH 7.6) 和低PH值洗滌緩沖液(10倍柱體積的200mM乙酸鈉pH 2. 95)的兩個洗滌步驟通過DEAE 層析(單片支持物)分離的、用高鹽洗脫緩沖液(5倍柱體積的40 mM檸檬酸鈉pH 6.50， 1000 mM NaCl)洗脫的冷凍貧乏的血漿(在40 mM Tris, 200 mM NaCl,pH 7. 6中1 :10稀釋 物的12. 5倍柱體積；0.2 μ M過濾的)的UV曲線。附圖7Β顯示了利用使用鹽洗滌緩沖液 (10倍柱體積的40 mM Tris-HCl、290mM NaCl pH 7. 6)和低pH值洗滌緩沖液(10倍柱體積 的200mM乙酸鈉pH 2. 95)的兩個洗滌步驟通過DEAE層析(單片支持物)分離的、用高鹽洗 脫緩沖液(5倍柱體積的40 mM檸檬酸鈉pH 6. 50,1000 mM NaCl)洗脫的中間血漿組分(組 分 D)(在 40 mM Tris, 200 mM NaCl，pH 7. 6 中 1 10 稀釋物的 2. 5 倍柱體積；0. 2 μ M 過濾 的)的UV曲線。在2. 5倍柱體積(cv)每分鐘的流動速度下，商業(yè)上可獲得的8 mL DEAE單 片柱(DEAE-CIM;BIA S印arations)用于進(jìn)行層析。采集流通物。其他的加載緩沖液施加 到柱上直到流通峰回到基線(例如，在附圖7A中，7倍柱體積25 mM Tris,200 mM NaCl、pH 7.6)。采集通過洗滌洗脫的所有的峰。采集通過高鹽洗脫緩沖液洗脫的峰，這個級分含有 高純度的Ia Ip0附圖8顯示了與來自使用低pH值洗滌步驟(pH 2. 95)的I a Ip蛋白純化的級分相 比較的，來自包括鹽洗滌步驟(290mM NaCl)和低pH值洗滌步驟(pH 2. 95)的I a Ip蛋白純 化的級分的SDS-PAGE分析。級分通過洗滌緩沖液pH 2.95 CpH洗滌)、含有290 mM NaCl 的洗滌緩沖液(鹽洗滌)和含有1000 mM NaCl的洗脫緩沖液(洗脫)來洗脫，通過SDS-PAGE (4-12%梯度；非變性的)來分離。在兩種層析過程中，I α Ip蛋白從中間血漿組分(組分D) 中純化。跑動標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)(Std麗)用于比較。箭頭——250 kDa間-α抑制物和 125 kDa前-α抑制物。發(fā)明的詳細(xì)說明
本發(fā)明一般地提供了從血漿純化I α Ip的方法和用于治療疾病、病癥或損傷的治療組 合物，所述疾病、病癥或損傷的特征在于急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病和早產(chǎn)。所述方法涉及在I α Ip的純化期間使 Ia Ip暴露于低pH值緩沖液。
間-α抑制物蛋白(I α Ip)
如在此使用的，“間-α抑制物蛋白(I α ρ)”是指在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制 物的家族中大的、多組分的多肽?！岸嚯摹笔侵赴被岬娜魏蔚逆湥豢紤]長度或翻譯后修 飾。所述復(fù)合物已經(jīng)顯示了在一系列蛋白酶的抑制作用中是重要的，所述蛋白酶包括嗜中 性細(xì)胞彈性蛋白酶、纖溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶G和頂體蛋白，包括胰蛋白酶 型蛋白酶抑制物。在人血漿中，I α Ip蛋白以相對高的濃度存在(400-800 mg/L)。不同于 其他的抑制物分子，這個抑制物家族由通過硫酸軟骨素鏈獨特地共價連接的多肽鏈(輕鏈 和重鏈)的組合組成。 間-α蛋白質(zhì)的重鏈(HI、Η2和Η3)也稱為透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合蛋白。在人血漿 中發(fā)現(xiàn)的主要形式是由兩個重鏈(H1&H2)和單個輕鏈(L)組成的間-α -抑制物(Ial)，以 及由一個重鏈(H3)和一個輕鏈(L)組成的前-α-抑制物(Pal)。輕鏈(也稱為bikunin(雙-kimitz抑制物)，具有兩個Kunitz結(jié)構(gòu)域)已知廣泛地抑制血漿絲氨酸蛋白酶。在血 漿組分中存在的Ια I和Ρα I具有約60 kDa到約280 kDa之間的表觀分子量。分子量可 以通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來測定。IaI和PaI也被發(fā)現(xiàn)與 H4復(fù)合，H4是I a Ip蛋白另一種重鏈。不希望受到任何特定的科學(xué)理論的限制，相信的是， Ia Ip的重鏈，在從復(fù)合物釋放之后，結(jié)合(透明質(zhì)酸)HA，防止HA與它的受體CD44結(jié)合。在 缺乏I a Ip的重鏈時，HA將結(jié)合⑶44并觸發(fā)促炎癥因子，例如TNF- α的分泌，導(dǎo)致炎癥。 同時，I a Ip的輕鏈，一旦從復(fù)合物上釋放，展現(xiàn)抗蛋白酶活性。膿毒癥和全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)
膿毒癥和全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)都是指在暴露于傳染原(例如，細(xì)菌毒素，例如 炭疽)或外傷/損傷之后的嚴(yán)重的物理化學(xué)反應(yīng)。膿毒癥是個體對具有潛在的危急生命結(jié) 果的病原體的過度反應(yīng)，一般不直接從致病病原體發(fā)生。如果不治療，膿毒癥可能導(dǎo)致對生 命組織的嚴(yán)重?fù)p傷，這將患者置于發(fā)生多器官功能障礙、休克和最終死亡的風(fēng)險中。膿毒癥、SIRS和膿毒性休克與先天免疫和凝結(jié)系統(tǒng)的活化相關(guān)。膿毒癥和膿毒 性休克的臨床特征在于全身性炎癥、凝血病、低血壓和多器官功能障礙(J.-L. Vincent et al. , Annuals of Medicine 34 (2002) 606-613)。在嚴(yán)重的膿毒癥期間，特異性蛋白酶 的網(wǎng)絡(luò)激活凝血、血纖蛋白溶解和補(bǔ)體因子。這些蛋白酶也可能觸發(fā)組織和器官損傷，并 增強(qiáng)血漿中凝結(jié)和補(bǔ)體因子的非特異性蛋白水解作用(J. Wite et al., Intensive Care Medicine 8(1982)215-222 ；S. J. Weiss, New England Journal of Medicine 320(1989) 365-376)。在主要由于身體的壓倒性全身炎性反應(yīng)的暴露的個體中觀察到“膿毒癥樣”癥 狀。過度反應(yīng)一般包括細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生(“細(xì)胞因子風(fēng)暴”)和破壞性蛋白酶的過度產(chǎn) 生，以及代謝、氧化、凝血和血管功能的紊亂，導(dǎo)致多器官功能障礙。Ia Ip是天然的血液蛋白質(zhì)，是身體的先天免疫系統(tǒng)的一部分。Ia Ip調(diào)節(jié)身體對 伴隨膿毒癥、感染、外傷和損傷的嚴(yán)重全身性炎癥的應(yīng)答。I a Ip是針對膿毒癥和SIRS的 重要的天然防御，因而，它們調(diào)節(jié)身體的防御，對抗對全身性炎癥效應(yīng)的“過度反應(yīng)”。I a Ip 是絲氨酸蛋白酶的抑制物，絲氨酸蛋白酶是涉及各種各樣的生理學(xué)過程，包括凝血、炎癥和 免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)消化酶。I a Ip充當(dāng)了廣譜的生物響應(yīng)修飾物，來調(diào)節(jié)分泌的炎性物質(zhì) 的循環(huán)水平，所述分泌的炎性物質(zhì)例如免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)物(細(xì)胞因子)、吸引白細(xì)胞到損傷或 炎癥的位點的蛋白質(zhì)(趨化因子)以及在受影響患者中引起嚴(yán)重的發(fā)病和過高死亡率的破 壞性蛋白酶。I a Ip蛋白結(jié)合引起和維持膿毒狀態(tài)的循環(huán)的細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶。 在嚴(yán)重的炎癥過程期間，I a Ip的身體水平快速的耗盡，引起不受控制的疾病過程。在膿毒 癥患者中血漿I a Ip水平和疾病的嚴(yán)重度與死亡率之間存在高度顯著的反比關(guān)系(Lim et al. , J Infect Dis 2003，188 919-926)。I α Ip已經(jīng)顯示了顯著地改善患有膿毒癥的實驗動物、感染炭疽的實驗動物以及 在暴露于有毒化學(xué)品或電離輻射之后遭受急性肺損傷的動物的存活率(Yang et al., Crit Care Med 2002，30 (3) 617-622 ；Lim et al. , J Infect Dis 2003，188 919-926 ；Wu et al. , Crit Care Med 2004，32(8)1747-1752 ；and Opal et al. , Infect and Immun 2005, 73 (8) :5101-5105)。對凝血、新陳代謝、肝臟損傷、炎性細(xì)胞因子和氧化功能的治 療效果與刺激或致病病原體無關(guān)。在I α Ip水平被嚴(yán)重地耗盡的急性炎癥的嚴(yán)重病例中， 展現(xiàn)的是，不受控制的疾病過程的發(fā)展可以通過I α Ip的外源施用來部分地或完全地阻止(Yang et al. , Crit Care Med 2002，30(3)617-622 ；Wu et al. , Crit Care Med 2004， 32 (8):1747-1752)。循環(huán)的細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶可以通過施用I α Ip來除去或滅 活，這種除去或滅活產(chǎn)生改善的存活率、降低的發(fā)病，以及處理任何基礎(chǔ)的疾病狀況或感染 的增多的時間。從尿液分離的I α Ip的蛋白酶片段展現(xiàn)了在降低膿毒癥患者的死亡率方面 顯著的效力(Lin HY. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007 Feb 13 ；87 (7) :451_7)。通過恢 復(fù)控制，使用I α Ip替代治療具有潛力來改善存活率、降低發(fā)病和提供治療基礎(chǔ)疾病狀況 或感染的時間。替代治療具有高度的安全界限，因為Ia Ip通常在血液中以相對高的水平 存在。I α Ip是用于在膿毒癥患者和暴露于“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的患者中維持血液動力學(xué)穩(wěn)定 性、防止器官損傷、改善存活率的有用的、安全的試劑。治療方法
在此公開的是向受試者施用純化的I α Ip來治療急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿 毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病和早產(chǎn)的治療方法。本發(fā)明可以用 于治療與受試者中間-α抑制物蛋白(I α Ip)水平的降低相關(guān)的幾乎任何的疾病。間-α 抑制物蛋白(I α Ip)水平的降低可能與趨化因子、細(xì)胞因子或蛋白酶的不希望的提高相關(guān)。 例如，哺乳動物可能患有引起趨化因子、細(xì)胞因子或蛋白酶的不希望的提高的疾病、病癥或 狀況。示范性的治療的狀況包括急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病或早產(chǎn)。在其他實施方式中，所述哺乳動物 具有發(fā)生通過所述方法延遲或防止的疾病、病癥或狀況的提高的風(fēng)險。本發(fā)明的方法涉及以治療有效劑量施用Ια Ιρ。在各種實施方式中，與參考物相 比，所述方法提高受試者中I α Ip的水平達(dá)至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%，或甚至 高達(dá)300%、400%或500%。在其他實施方式中，與參考物相比，所述方法降低細(xì)胞因子、趨化 因子或蛋白酶水平達(dá)至少5%、10%、20%，更理想地達(dá)至少25%、30%、35%、40%、50%、60%，或甚 至高達(dá)70%、80%、90或100%。分析生物學(xué)化合物的水平的方法是常規(guī)的，是熟練的技術(shù)人員 己知的(例如，Guyton et al. , Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, W. B. Saunders Co. , 2000)。雖然不限于特定的理論，在此提及的病理中細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的提高 的水平的效應(yīng)，引起隨后導(dǎo)致組織損傷的局部和全身性反應(yīng)。組織損傷可能導(dǎo)致器官衰 竭。在優(yōu)選的實施方式中，與相應(yīng)的天然發(fā)生的組織或器官相比，所述方法提高組織或器 官的生物學(xué)活性達(dá)至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%,或甚至 高達(dá)200%、300%、400%或500%?？蛇M(jìn)行分析的組織或器官的生物學(xué)功能包括消化、廢物的 排出、分泌、電活性、肌肉活性、激素生產(chǎn)或其他代謝活性。分析組織和器官的生物學(xué)活性 的方法是常規(guī)，是熟練的技術(shù)人員已知的(例如，Guyton et al.，Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, W. B. Saunders Co. , 2000)。本發(fā)明的方法對于在患者(例如，人類或哺乳動物)中治療或穩(wěn)定影響組織或器官 的狀況、疾病或病癥是有用的。治療效力任選地通過測量，例如，治療的組織或器官(例如， 膀胱、骨骼、腦、乳腺、軟骨、食道、輸卵管、心臟、胰腺、腸、膽囊、腎臟、肝臟、肺、神經(jīng)組織、卵 巢、前列腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、輸尿管、尿道、泌尿生殖 道和子宮)的生物學(xué)功能來分析。這樣的方法是本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的。例如，膀胱功能通過測 量尿液滯留和排出來分析。腦、脊髓或神經(jīng)組織功能通過測量神經(jīng)活性(例如，電活性)來分析。食道功能通過測量食道向胃傳送食物的能力來分析。心臟功能通過心電圖來分析。 胰功能通過測量胰島素生產(chǎn)來分析。腸功能通過測量腸內(nèi)容物穿過腸部的能力來分析，可 以使用鋇劑灌腸和胃腸造影來評估。膽囊功能使用膽囊放射性核素掃描來分析。腎臟功 能通過測量肌酸酐水平、尿肌酐水平，或通過肌酸酐廓清率或血脲氮的臨床測試來分析。肝 功能使用肝功能測試，或測量肝臟酶水平、膽紅素水平和白蛋白水平的肝功能檢查(liver panel)來分析。肺功能使用肺活量測定法、肺容量和擴(kuò)散能力測試來分析。卵巢功能通過 測量卵巢激素(例如，促濾泡激素)的水平來分析。前列腺異常通過測量前列腺特異性抗原 來分析。脾臟功能通過使用肝臟-脾臟掃描來分析。胃功能利用胃酸測試或通過分析胃排 空來分析。睪丸功能通過測量睪丸激素(例如，睪酮)的水平來分析。分析器官功能的其他 方法是熟練的技術(shù)人員已知的，例如，在教科書醫(yī)學(xué)生理學(xué)，第十版(Guyton et al. , W. B. Saunders Co.，2000)中描述了。I α Ip 組合物
如在此使用的，“I α Ip組合物”是指I α Ip蛋白的制品，包括處于生理學(xué)比例的I α I 和Pa I。如在此使用的，生理學(xué)的比例意圖包括在不患有感染或狀況的人或動物中存在的 比例，和/或在人血漿中天然出現(xiàn)的Ia I與Pa I的比例。生理學(xué)的比例通常是約60%到 約80%之間的Ia I，和約40%到約20%之間的Pa I。由于受試者的遺傳組成方面的正常變 異，生理學(xué)的比例可能在這些范圍內(nèi)變動。如在此使用的，“I a Ip復(fù)合物”意圖包括I a Ip蛋白的所有天然發(fā)生的生物學(xué)活 性變體，包括含有刪除、插入、添加和取代的蛋白質(zhì)。I a Ip蛋白的“天然變體”被定義為從 血漿獲得的、具有改變了一個或更多個氨基酸的序列的肽。變體可以具有“保守的”改變，其 中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，例如，亮氨酸用異亮氨酸取代。在其他實施方 式中，變體可能具有“非保守的”改變，例如，甘氨酸用色氨酸取代。相似的變體還可以包括 氨基酸刪除或插入，或兩者。確定哪些和多少氨基酸殘基可以被取代、插入或刪除而不消除 生物學(xué)或免疫學(xué)活性方面的指導(dǎo)可以利用本領(lǐng)域公知的計算機(jī)程序來找到，例如，DNASTAR 軟件。如在此使用的“功能等效的”是指任何蛋白質(zhì)，其能夠展現(xiàn)與在此描述的I a Ip蛋白 基本上相似的體內(nèi)或體外活性，例如，引起膿毒癥的降低。如在此使用的，“間-α抑制物蛋白(Ια I)和前-α蛋白(P a I)的混合物”是指 含有I a I和P a I復(fù)合物的組合物?；旌衔镞€可以含有用于分離I a Ip復(fù)合物的緩沖液、 鹽或其他成分。在某些方面，所述IaI和PaI以生理學(xué)比例在所述混合物中存在。在血漿組分中存在的I a I和P a I具有約60到約觀0 kDa之間的表觀分子量。分 子量可以通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定。本發(fā)明的I a Ip組合物可以具有高的胰蛋白酶抑制比活性。根據(jù)本發(fā)明的I a Ip 組合物的胰蛋白酶抑制比活性可以從約100到約200 IU/mg。優(yōu)選的，所述胰蛋白酶抑制比 活性是高于120 IU/mg，再更優(yōu)選的高于150 IU/mg。例如，胰蛋白酶抑制比活性可以通過 利用L-BAPA作為底物通過胰蛋白酶抑制分析來測量。參見，H U Bergmeyer，ed vol 5， 3rd ed. 119(1984)Verlag Chemie, Weinheim Chromogenic substrate for the assay of trypsin R. Geiger, H. Fritz, Methods of Enzymatic Analysis。I α Ip的組合物可以是間-α抑制物蛋白(I α I)和前-α蛋白(P α I)的混合物， 其中所述I α I和P α I在所述混合物中以生理學(xué)比例存在，包括與三個重鏈HI、H2和H3的至少一個締合的間_α抑制物蛋白的輕鏈。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以具有與四個重 鏈Η1、Η2、Η3和Η4的至少一個締合的間-α抑制物蛋白的輕鏈。I α Ip復(fù)合物中每種蛋 白質(zhì)的實例如下Bikunin GenBank登記號碼ΑΑΒ84031，Ρ02760 ；Hl GenBank登記號碼 Ρ19827, NP-002206 ；Η2 GenBank 登記號碼ΝΡ—002207，Ρ19823 ；Η3 GenBank 登記號碼 NP-002208 ；Η4 GenBank登記號碼Q14624，NP—002209，通過完全引用將它們每一個合并 在本文中。間-α抑制物蛋白(I α Ip)的純化
I α Ip可以通過層析來純化。如在此使用的，“純化”是指從I α Ip中除去不需要的或 污染的蛋白質(zhì)或成分來產(chǎn)生純化的I α Ip的步驟或過程。例如，含有生理學(xué)比例的I α I和 P α I的血漿組分可以通過至少一個層析步驟來純化所述I α Ιρ。如在此使用的，“層析”可 以包括液體層析或柱層析。本領(lǐng)域已知的是，層析具有不相互排斥的許多種描述和/或分 類。例如，液相層析可以在柱上進(jìn)行。柱層析可以包括陰離子交換層析。一般地，Ia Ip的制備涉及樣品的分離和被測定含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的級分的采集。 分離的方法包括，例如，固相提取、層析，例如，陰離子交換層析、大小排阻層析、離子交換層 析、肝素層析、親和層析、連續(xù)提取、凝膠電泳和液相層析。制備還可以包括純化，其可以包 括層析的步驟，例如，離子交換層析、肝素層析、親和層析、連續(xù)提取、凝膠電泳和液相層析?！肮滔嘀С治铩笔侵腹腆w材料，其可以用捕獲試劑衍生化，或以另外方式附著于捕 獲試劑。示范性的固相支持物包括單片支持物、基于顆粒的支持物、探針和微量滴定板。如 在此使用的，“單片支持物”是指單塊的多孔固相支持物。如在此使用的，“基于顆粒的支持 物”是指用于填充層析柱的勻質(zhì)的顆粒，包括層析樹脂?！氨环治鑫铩笔侵钙谕粰z測的樣品的任何成分。該術(shù)語還可以指樣品中的單個成 分或多個成分。“吸附”是指被分析物與吸附劑或捕獲試劑的可檢測的非共價結(jié)合。吸附劑表面是 指吸附劑(也稱為“捕獲試劑“或“親和試劑")結(jié)合的表面。吸附劑是能夠結(jié)合被分析物 (例如，目標(biāo)多肽或核酸)的任何材料。層析吸附劑是指一般用于層析中的材料。層析吸附劑包括，例如，離子交換材料、 金屬螯合劑(例如，氮川乙酸或亞氨基二乙酸)、固定的金屬螯合物、疏水性相互作用吸附 劑、親水性相互作用吸附劑、染料、簡單的生物分子(例如，核苷酸、氨基酸、單糖和脂肪酸) 以及混合式吸附劑(例如，疏水性吸移/靜電排斥吸附劑)。生物特異性吸附劑是指包含生物分子的吸附劑，所述生物分子例如核酸分子(例 如，適體)、多肽、多糖、脂質(zhì)、類固醇或這些的共軛物(例如，糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(例 如，DNA)-蛋白質(zhì)共軛物)。在某些情況中，生物特異性吸附劑可以是大分子結(jié)構(gòu)，例如，多 蛋白復(fù)合物、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的實例有抗體、受體蛋白和核酸。與層析吸 附劑相比，生物特異性吸附劑一般具有對目標(biāo)被分析物更高的特異性?！跋疵撘骸被颉跋礈炀彌_液”是指試劑，一般是溶液，其被用于影響或修飾被分析物 與吸附劑表面的吸附和/或從所述表面除去未結(jié)合的材料。洗滌緩沖液或洗脫液的洗脫 特征可以取決于，例如，PH值、離子強(qiáng)度、疏水性、chaotropism的程度、洗滌劑強(qiáng)度和溫度。 在本發(fā)明的某些實施方式中，所述純化方法涉及至少一個緩沖液洗滌步驟。在本發(fā)明的方 法中，緩沖液洗滌步驟涉及向柱施加具有低PH值的洗滌緩沖液(例如，4. 0,3. 7,3. 5,3. 4、3. 3、3，1,2. 9,2. 0)。在一個實施方式中，所述低pH值洗滌緩沖液具有小于約4. 0的pH值。 在優(yōu)選的實施方式中，所述洗滌溶液具有小于約3.6的pH值。在再更優(yōu)選的實施方式中， 所述洗滌溶液具有小于約3. 3的pH值。最優(yōu)選的，所述洗滌溶液具有小于約3. 3到約2. 9 的PH值。在其他實施方式中，所述純化方法涉及超過一個緩沖液洗滌步驟。優(yōu)選的是，隨后 的緩沖液洗滌步驟具有比之前的緩沖液洗滌步驟更低的PH值。在一個實施方式中，第一洗 滌緩沖液具有約4. 0的pH值，第二洗滌緩沖液具有約3. 6的pH值。在另一個實施方式中， 第一洗滌緩沖液具有約4. 0的pH值，第二洗滌緩沖液具有約3. 1的pH值。在另一個實施 方式中，第一洗滌緩沖液具有約4. 0的pH值，第二洗滌緩沖液具有約2. 9的pH值。在本發(fā) 明的實施方式中，所述洗滌緩沖液是乙酸或乙酸鈉。適用于本發(fā)明的其他洗滌緩沖液包括 檸檬酸、甘氨酸或磷酸鹽緩沖液。在再其他的實施方式中，所述純化方法涉及使用含鹽的緩 沖液的洗滌步驟。優(yōu)選的是，在含鹽的緩沖液中的鹽濃度是高于250 mM NaCl (例如，260、 270,280,290 mM NaCl)0在一個實施方式中，第一洗滌緩沖液具有四0 mM NaCl的鹽濃度， 第二洗滌緩沖液具有約2. 9的pH值。發(fā)現(xiàn)的是，與沒有鹽洗滌步驟時相比，向涉及低pH值 步驟的純化方案中添加鹽洗滌步驟提高了 I α Ip的產(chǎn)率和純度。在本發(fā)明的實施方式中， 含鹽洗滌緩沖液中的鹽是氯化鈉(NaCl)。適用于本發(fā)明的其他鹽包括氯化鉀(KCl)。陰離子交換層析可以通過單片支持物，例如，具有固定的陰離子交換配體的CIM， 例如DEAE-CIM或Q-CIM(BIA Separations)0陰離子交換層析還可以是基于顆粒的，例如， DEAE Sepharose、DEAE Sephadex A50、Toyopearl DEAE> TMAE Fractogel、DEAE Fractogel 或Q-kpharose。SEPHAR0SE是新澤西州Wiarmacia公司用于高分子量物質(zhì)的商品名，所述 高分子量物質(zhì)用于通過大分子凝膠過濾的分離。陰離子交換柱具有兩種成分，基質(zhì)和配體。 基質(zhì)可以是，例如，纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或聚苯乙烯。固定的陰離子交換配體可以是二乙 基氨基乙烷(DEAE)、聚乙烯亞胺(PEI)或季胺官能團(tuán)(Q)。陰離子交換柱的強(qiáng)度是指配體的 電離狀態(tài)。強(qiáng)陰離子交換柱，例如，具有季銨配體的那些，在寬闊的PH范圍上帶有永久的正 電荷。在弱陰離子交換柱例如DEAE和PEI中，正電荷的存在取決于柱的pH值。強(qiáng)陰離子交 換柱，例如Q Sepharose FF或金屬螯合kpharose(例如，Cu2+_螯合kpharose)是優(yōu)選的。 陰離子交換柱一般加載處在高于要純化的蛋白質(zhì)的Pl的PH值下的低鹽緩沖液。緩沖液、緩 沖液濃度、鹽濃度和洗脫液的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如kopes "Protein Purification Principles and Practice" Springer ；3rd ed. edition (November 19, 1993))。在本發(fā)明的一個實施方式中，樣品可以通過陰離子交換層析純化。陰離子交換層 析容許大略地根據(jù)樣品中的蛋白質(zhì)的電荷特征純化樣品中的蛋白質(zhì)。例如，可以使用Q陰 離子交換樹脂(例如，Q HyperD F, Bios印ra)，樣品可以使用具有不同的pH值的洗脫液連 續(xù)地洗脫。陰離子交換層析容許樣品中帶有比其他類型生物分子更多負(fù)電荷的生物分子的 分離。用具有高PH值的洗脫液洗脫的蛋白質(zhì)可能是微弱地帶負(fù)電的，用具有低pH值的洗 脫液洗脫的級分可能是強(qiáng)烈地帶負(fù)電的。因而，除了降低樣品的復(fù)雜性之外，陰離子交換層 析根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)合特征分離蛋白質(zhì)。在又一個實施方式中，樣品可以通過肝素層析進(jìn)一步純化。肝素層析容許還在與 肝素的親和相互作用以及電荷特征的基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化樣品中的I α Ip復(fù)合物。肝素，一 種硫酸化的粘多糖，將結(jié)合具有帶正電荷部分的Ia Ip復(fù)合物，樣品可以用具有不同PH值或鹽濃度的洗脫液連續(xù)地洗脫。用具有低PH值的洗脫液洗脫的I α Ip復(fù)合物更可能是微弱 地帶正電的。用具有高PH值的洗脫液洗脫的I α Ip復(fù)合物更可能是強(qiáng)烈地帶正電的。因 而，肝素層析也降低樣品的復(fù)雜性，并根據(jù)I α Ip復(fù)合物的結(jié)合特征分離I α Ip復(fù)合物。在 另一個實施方式中，樣品可以通過羥磷灰石層析進(jìn)一步純化。在又一個實施方式中，樣品可 以通過疏水性相互作用層析進(jìn)一步純化。I α Ip復(fù)合物可以用固定在支持物上的捕獲試劑來捕獲，支持物例如任何生物芯 片、多孔微量滴定板、樹脂或硝化纖維素膜，其隨后被探測蛋白質(zhì)的存在。特別地，本發(fā)明的 I α Ip復(fù)合物可以捕獲在表面增強(qiáng)的激光脫附/電離(SELDI)蛋白質(zhì)生物芯片上。捕獲可 以在層析表面或生物特異性表面上。包含反應(yīng)表面的任何SELDI蛋白質(zhì)生物芯片可以用于 捕獲和檢測本發(fā)明的I α Ip復(fù)合物。這些生物芯片可以用特異性捕獲I α Ip復(fù)合物的抗體 來衍生化，或它們可以用捕獲試劑，例如結(jié)合免疫球蛋白的蛋白A或蛋白G來衍生化。然后 I α Ip復(fù)合物可以利用特異性抗體在溶液中捕獲，捕獲的I α Ip復(fù)合物在芯片上通過捕獲 試劑分離。I α Ip的純化可以根據(jù)體積和數(shù)量來調(diào)整規(guī)模。在某些實施方式中，1 mL或8 mL 柱被用于純化Ια Ip。在其他實施方式中，80 mL、800 mL柱或8 L柱被用于純化Ια Ip。一般地，在從柱上洗脫之后，純化的I a Ip被交換到緩沖液中來維持穩(wěn)定性或活 性。純化的I a Ip還可以通過超濾或滲濾處理來除去低分子量蛋白質(zhì)污染物。在某些實施 方式中，病毒滅活步驟被整合到純化中。在層析分離之前，血漿的溶劑和洗滌劑處理可以用 于滅活病毒顆粒。在超濾或滲濾之后，純化的I a Ip可以通過納濾來進(jìn)一步處理(例如，來 滅活病毒)。純化的I a Ip還可以被凍干和包裝用于長期保存(庫存)。本發(fā)明的I a Ip組合物優(yōu)選地是約85%到約100%純的。如在此使用的，術(shù)語“純” 是指I a Ip組合物，其是從其天然環(huán)境移除的、分離的或分隔的，以及沒有至少約85%到約 100%之間、優(yōu)選90%、以及更優(yōu)選的95%與之天然相關(guān)的其他成分。在優(yōu)選的實施方式中， 基本上純化的蛋白質(zhì)將構(gòu)成組合物中蛋白質(zhì)的超過85%、87. 5%、90%、92. 5%、95%、99%或甚 至更多。用于本發(fā)明時，“純化到勻質(zhì)”的肽、多肽或蛋白質(zhì)意思是，肽、多肽或蛋白質(zhì)具有 一定水平的純度，其中所述肽、多肽或蛋白質(zhì)基本上沒有其他蛋白質(zhì)和生物學(xué)成分。任何適 合的材料和方法可以用于進(jìn)行單個或多個血漿的分離步驟來獲得純化的I a IP。根據(jù)當(dāng)前的公開內(nèi)容，用于定量蛋白質(zhì)、多肽或肽的純化的程度的各種方法對本 領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的。這些包括，例如，測定級分的蛋白質(zhì)比活性，或通過凝膠電泳評 估級分內(nèi)多肽的數(shù)量。術(shù)語“生物學(xué)活性”是指具有天然發(fā)生的I a Ip復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié) 或生物化學(xué)功能。同樣地，“免疫學(xué)活性”定義了天然的、重組的或合成的I a Ip復(fù)合物或其 任何寡肽在適合的動物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)、以及與特定抗體結(jié)合的能力。Ia Ip 濃度可以利用如 Lim et al, (J. of Infectious Diseases, 2003)中描述的 Mab 69.31 通過競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測量。在競爭性ELISA中，結(jié)合I α Ip的輕鏈的 抗體，例如 MAb 69. 26 和 MAb 69.31 (Lim et al, J. of Infectious Diseases, 2003)可 以用于檢測I α Ip的活性位點是否被暴露。當(dāng)在競爭性ELISA中利用結(jié)合I α Ip的輕鏈的 抗體時，與根據(jù)蛋白質(zhì)濃度預(yù)測的相比、獲得的更高的測量值可能表明Ia Ip的活性位點 被暴露。如通過競爭性ELISA測定的，抗I α Ip抗體與純化的I α Ip的結(jié)合提高至大于1、1.5、2、3、4、5或10倍。測量蛋白質(zhì)濃度的方法是本領(lǐng)域已知的，也可以通過商業(yè)上可獲得 的蛋白質(zhì)分析(二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)分析；BioRad蛋白質(zhì)分析)來測量。Ia Ip產(chǎn)物結(jié)構(gòu) 和純度可以通過，例如，HPLC或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他層析方法來確認(rèn)。純化的I α Ip 的比抑制活性可以利用發(fā)色底物L(fēng)-BAPA (N (α)-苯甲酰基-L-精氨酸_4_硝基苯胺鹽 酸鹽(Fluka Chemicals)在胰蛋白酶抑制分析中測量。這種分析是基于I α Ip抑制L-BAPA 的水解的能力。抑制作用可以通過在410 nm處Δ吸光度/分鐘的比例的降低來監(jiān)視。純化的I α Ip具有約60到約觀0 kDa之間的表觀分子量。分子量可以通過十二 烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來測定。純化的I α Ip也具有生物學(xué)活性(例如，細(xì)胞因子 抑制物活性、趨化因子抑制物活性或絲氨酸蛋白酶抑制物活性)，其可以通過在此描述的或 本領(lǐng)域已知的方法來測定。純化的I α Ip具有與未用低ρΗ值處理的I α Ip的相比至少一 樣高的生物學(xué)活性，所述未用低PH值處理的I α Ip包括，血液、血漿或血漿組分中存在的 I α Ιρ，或通過其他手段純化的I α Ιρ。所述方法還有助于定量未知I α Ip濃度的樣品中間-α抑制物蛋白(Ια Ιρ)。未 知I α Ip濃度的樣品被施加于層析柱。在某些實施方式中，層析柱的體積小于1 mL。施加 樣品的柱用低PH值緩沖液(例如，ρΗ值小于4.0)洗滌。柱隨后用高鹽緩沖液(例如，>500 mM)洗脫?；旧嫌蒊 α Ip組成的(例如，純度>90%)洗脫的蛋白質(zhì)通過本領(lǐng)域已知的用于 測定蛋白質(zhì)濃度的方法來測量。這樣的方法可以包括UV吸光度、蛋白質(zhì)分析、或用于測定 I α Ip濃度的競爭性ELISA，如在此描述的。樣品中存在的I α Ip的數(shù)量可以通過與一個或 更多個參考物比較蛋白質(zhì)的數(shù)量來獲得。這樣的參考物包括含有已知數(shù)量的Ια Ιρ、通過用 于加工未知I α Ip濃度的樣品的方法處理的樣品。血液、血漿和血漿組分
由于I α Ip在血液中是豐富的，I α Ip 一般從血液、血漿或分離自血漿的血漿組分來純 化。如在此使用的“分離”是指從血漿產(chǎn)生血漿組分，其含有生理學(xué)比例的Ια I和Pa I。 例如，分離血漿組分可以通過使血漿層析根據(jù)本發(fā)明來實現(xiàn)。分離的是指從其原始環(huán)境(例 如，如果它是天然存在的，指自然環(huán)境)移出的材料，因而是從其自然狀態(tài)“經(jīng)人手”改變的。 例如，分離的多肽或蛋白質(zhì)可以是血漿的成分，或可以被包含在細(xì)胞內(nèi)并被認(rèn)為是“分離 的”，因為血漿或特定的細(xì)胞可能不是所述多肽的原始環(huán)境。如在此使用的，“血漿-衍生的”是指原始地分離自或純化自血漿。也就是說，組合 物的自然環(huán)境是血漿。如在此使用的，“血漿組分”是來自分離或純化步驟的組分，例如，層析，其原始地 來自血漿。根據(jù)本發(fā)明的血漿組分可以是，例如，獲自凝血因子IX的純化的副組分、來自 凝血酶原復(fù)合物濃縮物的純化的副組分、產(chǎn)自血漿的冷凍沉淀的冷凍上清液(在Hoffer et al. , Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196 中描述的)或冷凍貧乏的血菜。 如在此使用的，“冷凍貧乏的血漿”或“冷凍上清液”是獲自血漿的冷凍沉淀的上清液。冷凍 貧乏的血漿可以通過解凍新鮮的冷凍血漿制備(例如，在4攝氏度和在IOk rpm離心30分 鐘)。除了血漿之外，這種純化方案也可以對含有I α Ip的任何血漿組分使用。含有 I α Ip的血漿組分包括在凝血因子和其他血漿衍生物的工業(yè)加工期間、或在其他治療蛋白 質(zhì)如凝血因子的純化過程期間的副組分或血漿中間物。根據(jù)本發(fā)明的副組分的實例是獲自凝血因子IX的純化的副組分。I α Ι/Ρα I的混合物已經(jīng)顯示了在因子IX (FIX)的純化期 間產(chǎn)生的副組分中存在。獲得獲自凝血因子IX的純化的副組分的方法在Hoffer et al., Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196中描述了，通過完全引用將其合并在 本文中。副組分的其他實例包括來自FIX純化的副組分、或來自凝血酶原復(fù)合物濃縮物的 純化的副組分，如在 D. Josic et al. , Thrombosis Research 100 (2000)433-441 中描述 的，通過完全引用將其合并在本文中。副組分的其他實例包括來自FIX純化的副組分，在此 稱為組分D和組分C。組分D和組分C是指在FIX和其他凝血因子等等通過陰離子交換層 析的純化期間獲得的含有I α Ip的組分。組分D是在高鹽條件(例如，>500mM NaCl)下從 陰離子交換柱洗脫的含有I α Ip的組分。組分C是含有I α Ip的組分，其來自從陰離子交 換柱純化、用25 mM檸檬酸鹽，pH 6.0，0.5 M NaCl洗脫的血漿組分。組分C是來自抗因 子IX親和純化步驟的未結(jié)合的組分，即，流通物，在所述步驟中來自陰離子交換柱的洗脫 液(在25 mM檸檬酸鹽、pH 6. 0 0. 5 M NaCl中)施加到抗-因子IX親和柱上。
副組分的實例作為產(chǎn)自血漿的冷凍沉淀的冷凍上清液分離。例如，Hoffer et al., Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196 中描述了適合的冷凍沉淀方法。
血液和血漿可以獲自人類、靈長類、牛、馬、豬、羊、貓或犬來源。血液可以獲自或購 自，例如，血庫、醫(yī)院、收容所、私營公司、研究基金會或任何其他血液來源。血漿可以獲自或 購自，例如，血庫、醫(yī)院、收容所、私營公司、研究基金會或任何其他血液來源。作為選擇，血 漿也可以在獲得血液時從血液分離。分離血漿的適合的方法包括重力和離心。根據(jù)本發(fā)明 的血漿組分可以獲自人類、靈長類、牛、馬、豬、羊、貓或犬來源。來自副組分的某些早先的I α Ip純化物含有因子X (FX)的污染，其通過Western 印跡分析作為80 kDa條帶和在凝血分析中被檢測出。FX的去除是重要的，因為FX是凝血 酶原性的，如果施用給人類可能是有害的。在此描述的I α Ip純化的方法除去FX污染物。 另外，在層析分離之前可以進(jìn)行血漿的溶劑和洗滌劑處理，來滅活在血漿或血漿組分中存 在的任何病毒。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了與I α Ip水平的降低或趨化因子、細(xì)胞因子或蛋白酶的水平的提高相關(guān) 的疾病和病癥的治療。與細(xì)胞數(shù)量的缺陷相關(guān)的許多疾病或狀況特征在于趨化因子、細(xì)胞 因子或蛋白酶的水平的提高。這樣的疾病或病理學(xué)狀況包括但不限于炎癥、外傷/損傷、腫 瘤侵入、腫瘤轉(zhuǎn)移、膿毒癥、膿毒性休克或傳染性疾病。本發(fā)明的方法通過降低趨化因子、細(xì) 胞因子或蛋白酶的水平或活性改善這樣的疾病、病癥或損傷。本發(fā)明提供了治療疾病和/或病癥或其癥狀的方法，其包括向受試者(例如，哺乳 動物，例如人類)施用治療有效量的包含此處的純化的I α Ip蛋白的藥物組合物。因而，一 個實施方式是治療受試者的方法，所述受試者患有或易感于以I α Ip的缺陷為特征的疾病 或病癥或其癥狀。所述方法包括在一定條件下向所述哺乳動物施用足以治療所述疾病或病 癥或其癥狀的、治療數(shù)量的本發(fā)明的組合物的步驟，所述條件使得所述疾病或病癥被治療。在各種實施方式中，本發(fā)明的試劑通過向疾病或損傷的位點局部注射、通過持續(xù) 輸注、或通過在外科條件下的微量注射(Wolff et al. , Science 247 :1465, 1990)來施 用。在其他實施方式中，所述試劑向具有I α Ip方面缺陷的患者的組織或器官全身地施用。此處的方法包括向所述受試者(包括被鑒定為需要這樣的治療的受試者)施用有效量的在此描述的純化的I α Ip蛋白、或在此描述的組合物來產(chǎn)生這樣的效果。鑒定需要 這樣的治療的受試者可以是受試者或護(hù)理專業(yè)人員的判斷，可以主觀的(例如，觀點)或客 觀的(例如，通過測試或診斷方法可測量的)。本發(fā)明的治療方法(其包括預(yù)防性治療)一般包括向有需要的受試者(例如，動物， 人類)，包括哺乳動物，特別是人類施用治療有效量的此處的化合物，例如，此處的化學(xué)式的 化合物。所述受試者還可以是靈長類、牛、馬、豬、羊、貓或犬。適合于用I α Ip治療的受試 者可以被鑒定為患有炎癥、外傷/損傷、腫瘤侵入、腫瘤轉(zhuǎn)移、膿毒癥、膿毒性休克或傳染性 疾病。這樣的治療將適合地施用給受試者，特別是人類，其患有、具有或易感于、或有疾病、 病癥或其癥狀的風(fēng)險?！坝酗L(fēng)險”的那些受試者的鑒定可以通過診斷測試或受試者或護(hù)理提 供者的意見(例如，遺傳學(xué)測試、酶或蛋白質(zhì)標(biāo)志物、標(biāo)志物(在此定義的)、家族史，等等)通 過任何客觀或主觀的鑒定來進(jìn)行。受試者可以自我鑒定或由執(zhí)業(yè)醫(yī)生診斷為患有炎癥、腫 瘤侵入、腫瘤轉(zhuǎn)移、膿毒癥、膿毒性休克或傳染性疾病。所述受試者可以是靈長類、人類或其 他動物。此處的組合物也可以用于治療任何其他病癥，在所述病癥中可能存在細(xì)胞數(shù)量的 缺陷。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了監(jiān)視治療進(jìn)展的方法。所述方法包括測定受試 者中診斷標(biāo)志物(標(biāo)志物)(例如，通過此處的化合物、蛋白質(zhì)或其指示物等等調(diào)節(jié)的、在此 描述的任何靶點)或診斷測量(例如，篩選，分析)的水平的步驟，所述受試者患有或易感于 與I α Ip水平的缺陷或趨化因子、細(xì)胞因子或蛋白酶水平的提高相關(guān)的病癥或其癥狀。所 述受試者可以被施用足以治療所述疾病或其癥狀的、治療數(shù)量的此處的化合物。在所述方 法中測定的標(biāo)志物的水平可以與健康的正常對照中或其他患病患者中的標(biāo)志物的已知水 平比較，來建立受試者的疾病狀態(tài)。在優(yōu)選的實施方式中，所述受試者中標(biāo)志物的第二水 平在比所述第一水平的測定更晚的時點測量，比較兩種水平來監(jiān)視疾病的進(jìn)程或治療的效 力。在某些優(yōu)選的實施方式中，所述受試者中治療前的標(biāo)志物水平在開始根據(jù)本發(fā)明的治 療之前測定；這種標(biāo)志物的治療前的水平然后可以與治療開始后受試者中的標(biāo)志物的水平 比較，來確定治療的效力。藥物組合物
本發(fā)明的特征在于藥物制品，其包含能夠降低細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的水平或 抑制細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的活性的試劑。這樣的制品兼具治療和預(yù)防應(yīng)用。在此處 描述的方法中有用的試劑包括降低細(xì)胞因子、趨化因子或蛋白質(zhì)的水平的那些。如果希望， 本發(fā)明的組合物與降低受試者的循環(huán)中存在的細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的水平的試劑 一起配制。降低細(xì)胞因子或趨化因子應(yīng)答的試劑包括但不限于抗-TNF-α抗體或TNF抑制 物。本發(fā)明的化合物可以作為藥物組合物的部分來施用。組合物應(yīng)當(dāng)被消毒，并在適 合于向受試者施用的重量或體積單位中含有治療有效量的本發(fā)明的試劑。本發(fā)明的組合物 和組合可以是藥物包裝的部分，其中每一種化合物以獨立的劑量數(shù)量存在。用于預(yù)防性的或治療性施用的本發(fā)明的藥物組合物應(yīng)當(dāng)被消毒。消毒可以通過無 菌過濾膜(例如，0.2 ym膜)過濾、通過γ輻射、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他適合的 手段來容易地實現(xiàn)。治療多肽組合物一般置于具有消毒的進(jìn)入口的容器中，例如，具有可被 皮下注射針頭刺入的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶。這些組合物通常將保存在單位劑量或多劑量容器中，例如，密封的安瓿瓶或小瓶，作為水溶液或作為用于重構(gòu)的凍干的制劑。任選地，化合物可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。在此使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接 受的賦形劑”是指適合于向人類施用的一種或更多種相容的固體或液體填充物、稀釋劑或 包封物質(zhì)。賦形劑優(yōu)選地含有微小數(shù)量的添加劑，例如，增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。 這樣的材料在所采用的劑量和濃度下對接受者是無毒的，包括緩沖劑，例如，磷酸鹽、檸檬 酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽和其他有機(jī)酸或它們的鹽；三-羥基甲基氨基甲 烷(TRIS)、重碳酸鹽、碳酸鹽和其他有機(jī)堿和它們的鹽；抗氧化劑，例如，抗壞血酸；低分子 量(例如，小于約十個殘基)多肽，例如，聚精氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸；蛋白 質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚 丙二醇(PPG)和聚乙二醇(PEG);氨基酸，例如，甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸或 精氨酸；單糖、二糖和其他碳水化物，包括纖維素或它的衍生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精 或硫酸化的碳水化物衍生物，例如，肝素、硫酸軟骨素或硫酸葡聚糖；多價金屬離子，例如， 二價金屬離子，包括，鈣離子、鎂離子和錳離子；螯合劑，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)；糖醇， 例如，甘露醇或山梨醇；平衡離子，例如，鈉或銨；和/或非離子型表面活性劑，例如，聚山梨 酸酯或泊洛沙姆。也可以包括其他添加劑，例如，穩(wěn)定劑、抗微生物劑、惰性氣體、液體和營 養(yǎng)補(bǔ)充物(即，Ringer' s葡萄糖)、電解質(zhì)補(bǔ)充物，等等，其可以以常規(guī)數(shù)量存在。如上所述，所述組合物可以以有效量施用。有效量將取決于施用的方式、要治療的 特定狀況和期望的結(jié)果。它還取決于狀況的階段、所述受試者的年齡和物理條件、當(dāng)前的治 療的性質(zhì)，如果有的話，以及執(zhí)業(yè)醫(yī)生公知的類似因素。對于治療應(yīng)用，數(shù)量足以實現(xiàn)醫(yī)學(xué) 上期望的結(jié)果。對于患有以I α Ip的降低為特征的疾病或病癥的受試者，有效量是足以降低趨化 因子、細(xì)胞因子或蛋白酶的水平或活性的；或足以穩(wěn)定、減慢或降低與病理相關(guān)的癥狀。本 發(fā)明的組合物可以用來治療急性的炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病或早產(chǎn)，可以直接地確定。一般地，本發(fā)明的化合物的劑 量將是約0.01 mg/kg每天到約1000 mg/kg每天。預(yù)計的是，從約50到約2000 mg/kg的 劑量將是適合的。更低的劑量將來自某些施用形式，例如，靜脈內(nèi)施用。在受試者中的應(yīng)答 在施加的初始劑量下不充分的情況下，可以采用更高的劑量(或通過不同的、更為局部化的 遞送途徑的有效地更高的劑量)達(dá)到患者耐受性允許的程度。實現(xiàn)本發(fā)明的組合物的合適 的全身性水平的每天的多劑量是期待的。多種給藥途徑是可獲得的。一般而言，本發(fā)明的方法可以利用醫(yī)學(xué)上可接受的任 何施用方式實踐，是指產(chǎn)生有效水平的活性化合物而不引起臨床上不可接受的副作用的任 何方式。施用的其他方式包括口服、直腸、局部、眼內(nèi)、口腔、陰道內(nèi)、腦池內(nèi)、腦室內(nèi)、氣管 內(nèi)、鼻、經(jīng)皮、植入物之內(nèi)或之上、或胃腸外的途徑。術(shù)語“胃腸外的”包括皮下的、鞘內(nèi)的、 靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或輸注。由于對患者以及給藥日程是方便的，口服施用對于 預(yù)防性治療是優(yōu)選的。本發(fā)明的藥物組合物任選地可以進(jìn)一步含有所希望的一種或更多種另外的蛋白 質(zhì)。適合的蛋白質(zhì)或生物材料可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和可獲得的任何純化方法從 人類或哺乳動物血漿獲得；從含有根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)導(dǎo)入的、表達(dá)人類或哺乳動物 蛋白質(zhì)的基因的重組組織培養(yǎng)物、病毒、酵母、細(xì)菌等等的上清液、提取物或溶胞產(chǎn)物獲得；或從人類生物液體(例如，血液、奶、淋巴、尿液，等等)或從含有根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入 的、表達(dá)人類蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)基因動物獲得。本發(fā)明的藥物組合物可以包含一種或更多種pH值緩沖化合物來將制劑的pH值維 持在預(yù)定水平，所述水平反映生理學(xué)的PH值，例如，在約5. 0到8. 0的范圍之內(nèi)。在水性液 體制劑中使用的PH值緩沖化合物可以是氨基酸或氨基酸的混合物，例如組氨酸，或氨基酸 如組氨酸和甘氨酸的混合物。做為選擇，PH值緩沖化合物優(yōu)選地是將制劑的pH值維持在 預(yù)定水平的試劑，例如，在約5.0到約8.0的范圍內(nèi)，并且其不螯合鈣離子。這樣的pH值緩 沖化合物的說明性實例包括但不限于，咪唑和乙酸鹽離子。PH緩沖化合物可以以適合于將 制劑的PH值維持在預(yù)定水平的任何數(shù)量存在。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有一種或更多種滲透調(diào)節(jié)試劑，S卩，將制劑的滲透 性質(zhì)(例如，滲漲度、重量克分子滲透壓濃度和/或滲透壓)調(diào)節(jié)到接受個體的血流和血細(xì)胞 可接受的水平的化合物。滲透調(diào)節(jié)試劑可以是不螯合鈣離子的試劑。滲透調(diào)節(jié)試劑可以是 調(diào)節(jié)制劑的滲透性質(zhì)的、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可獲得的任何化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以經(jīng)驗性地確定本發(fā)明的制劑中使用的給定滲透調(diào)節(jié)試劑的適用性。滲透調(diào)節(jié)試劑的適 合的類型的說明性實例包括但不限于鹽，例如，氯化鈉和乙酸鈉；糖類，例如，蔗糖、葡萄 糖和甘露醇；氨基酸，例如，甘氨酸；以及這些試劑和/或試劑類型的一種或更多種的混合 物。滲透調(diào)節(jié)試劑可以以足夠調(diào)節(jié)制劑的滲透性質(zhì)的任何濃度存在。包含本發(fā)明的化合物的組合物可以含有多價的金屬離子，例如，鈣離子、鎂離子和 /或錳離子?？梢允褂脦椭€(wěn)定組合物并且將不會不利地影響接受個體的任何多價的金屬 離子。根據(jù)這兩個指標(biāo)，熟練的技術(shù)人員將可以經(jīng)驗性地確定適合的金屬離子，這樣的金屬 離子的適合的來源是已知的，包括無機(jī)鹽和有機(jī)鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可以是非水性液體制劑?？梢圆捎萌魏芜m合的非水性液 體，只要它為其中含有的活性試劑提供了穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述非水性液體是親水性液體。 適合的非水性液體的說明的例子包括甘油；二甲亞砜(DMSO)；聚二甲硅氧烷(PMS)；乙二 醇，例如，乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(“PEG”)200、PEG 300和PEG 400;以及 丙二醇，例如，二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇(“PPG”)425、PPG 725、PPG100、PPG2000、PPG 3000 和 PPG 4000。本發(fā)明的藥物組合物也可以是混合的水性/非水性液體制劑。任何適合的非水 性液體制劑，例如上文描述的那些，可以與任何水性液體制劑，例如上文描述的那些一起采 用，條件是所述混合的水性/非水性液體制劑為其中含有的化合物提供了穩(wěn)定性。優(yōu)選的， 這樣的制劑中的非水性液體是親水性液體。適合的非水性液體的說明性的實例包括甘 油；DMSO ;PMS ；乙二醇，例如，PEG 200、PEG 300 禾口 PEG 400 ；以及丙二醇，例如，PPG 425、 PPG725、PPG 1000、PPG 2000、PPG 3000 和 PPG 4000。適合的穩(wěn)定制劑可以允許活性試劑在冷凍或非冷凍液體狀態(tài)中保存。穩(wěn)定的液體 制劑可以在至少-70°C的溫度下保存，但也可以在至少0°C、或約0. 1°C和約42°C之間的更 高的溫度下保存，取決于組合物的性質(zhì)。熟練的技術(shù)人員一般已知的是，蛋白質(zhì)和多肽對于 PH值、溫度以及可能影響治療效力的許多其他因素的改變是敏感的。其他遞送系統(tǒng)可以包括時間-釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。這樣的系 統(tǒng)可以避免本發(fā)明的組合物的重復(fù)施用，提高對受試者和醫(yī)師的方便性。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲得的和已知的。它們包括基于聚合物的系統(tǒng)，例 如聚交酯(美國專利NO. 3，773，919 ；歐洲專利NO. 58，481)、聚(丙交酯-乙交酯)、共聚 草酸酯、聚己酸內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚正酯、聚羥基丁酸，例如，聚-D- (-)-3-羥基丁酸(歐洲 專利NO. 133,988)、L 一谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，K. R. et al.， Biopolymers 22 :547_556)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或乙烯-乙酸乙烯酯(Langer，R. et al., J. Biomed. Mater. Res. 15 :267-277 ；Langer, R. Chem. Tech. 12 :98-105)禾口 聚酐。持續(xù)釋放組合物的其他實例包括處于有形的物體，例如薄膜或微囊的形式的半滲 透性的聚合物基質(zhì)。遞送系統(tǒng)還包括非聚合物系統(tǒng)，它們是脂質(zhì)，包括固醇例如膽固醇、膽 固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，例如單_、二-和三-甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)，例如生物學(xué)衍 生的生物可吸收的水凝膠(即，幾丁質(zhì)水凝膠或殼聚糖水凝膠);SylaStic系統(tǒng)；基于肽的系 統(tǒng)；蠟包衣；利用常規(guī)粘合劑和賦形劑的壓制的片劑；部分融合的植入物；等等。具體的實 例包括但不限于(a)浸蝕性系統(tǒng)，其中試劑以處在基質(zhì)內(nèi)部的形式含有，例如在美國專利 NO. 4，452，775,4, 667，014,4, 748，034 和 5，239，660 中描述那些，和(b)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活 性成分以受控的速率從聚合物中滲透，例如在美國專利N0. 3，832，253和3，854，480中描 述的那些。可以用于本發(fā)明的方法和組合物的另一種類型的遞送系統(tǒng)是膠態(tài)分散系統(tǒng)。膠 態(tài)分散系統(tǒng)包括基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠粒團(tuán)、混合的膠粒團(tuán)和脂質(zhì)體。脂質(zhì) 體是人工的膜容器，其作為體內(nèi)或體外的遞送載體是有用的。大小范圍從0.2-4. O μπι的 大單層容器(LUV)，可以在水性內(nèi)部之內(nèi)包封大的大分子，并以生物學(xué)活性形式遞送到細(xì)胞 (Fraley, R.，and Papahadjopoulosj D.，Trends Biochem. Sci. 6 77_80)o通過將脂質(zhì)體偶聯(lián)到特異性配體，例如，單克隆抗體、糖類、糖脂或蛋白質(zhì)，脂質(zhì) 體可以靶向特定的組織。脂質(zhì)體是從Gibco BRL商業(yè)上可獲得的，例如，LIP0FECTIN 和 LIP0FECTACE ，它們由陽離子脂質(zhì)形成，例如N_[l_ (2,3 二油氧基)-丙基]-N，N、N-三 甲基銨氯化物(DOTMA)和二甲基雙十八烷基銨溴化物(DDAB)。制造脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng) 域公知的，以及在許多公開物中描述，例如，DE 3,218, 121 ；Epstein et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)82 :3688-3692 (1985);Hwang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77 :4030-4034 (1980) ；EP 52, 322 ；EP 36, 676 ；EP 88，046 ；EP 143, 949 ；EP 142，641 ；日 本專利申請 83-118008 ；美國專利 Nos. 4，485，045 和 4，544，545 ；和 EP 102，324.脂質(zhì)體 還由 Gregoriadis, G. , Trends Biotechnol. , 3 235-241 綜述。另一種類型的運(yùn)載體是適合于植入到哺乳動物接受者中的生物相容的微?；?植入物。根據(jù)這種方法有用的示范性的生物可侵蝕的植入物在PCT國際申請NO. PCT/ US/03307 (公開NO. WO 95/24929、標(biāo)題“聚合的基因遞送系統(tǒng)”)中描述。PCT/US/0307描 述了生物相容的、優(yōu)選地生物可降解的聚合物基質(zhì)，用于含有處在合適的啟動子控制下的 外源基因。聚合物基質(zhì)可以用于實現(xiàn)外源基因或基因產(chǎn)物在受試者中的持續(xù)釋放。聚合物基質(zhì)優(yōu)選地處于微粒的形式，例如微球體(其中試劑分散在整個固體聚合 物基質(zhì)中)或微囊(其中試劑保存在聚合物殼的核心中)。上述含有藥物的聚合物的微囊在 例如美國專利5，075，109中描述了。含有試劑的其他形式的聚合物基質(zhì)包括薄膜、包衣、凝 膠、植入物和stents。選擇聚合物基質(zhì)設(shè)備的大小和組成來產(chǎn)生在導(dǎo)入基質(zhì)的組織中有利的釋放動力學(xué)。根據(jù)要使用的遞送方法進(jìn)一步選擇聚合物基質(zhì)的大小。優(yōu)選的，當(dāng)使用氣霧 劑途徑時，聚合物基質(zhì)和組合物被包圍在表面活性劑運(yùn)載體中?？梢赃x擇聚合物基質(zhì)組成 以兼具有利的降解速率，以及由生物粘附性的材料形成，以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)移的有效性。還可 以選擇基質(zhì)組成不被降解，而是在延長的時間期中通過擴(kuò)散釋放。遞送系統(tǒng)還可以是生物 相容的微球體，其適合于局部的、位點特異性的遞送。這樣的微球體在Chickering，D. Ε.， et al. , Biotechnol. Bioeng. , 52 96-101 ；Mathiowitz, E. , et al. , Nature 386 410-414中公開了。生物不可降解的和生物可降解的聚合物基質(zhì)都可以用于向受試者遞送本發(fā)明的 組合物。這樣的聚合物可以是天然的或合成的聚合物。根據(jù)期望的釋放的時間期，一般在 數(shù)小時到一年或更久的數(shù)量級，來選擇聚合物。一般地，在幾個小時和三到十二個月之間的 時間上的釋放是最期望的。聚合物任選地是水凝膠的形式，其可以在水中吸收其重量的最 高達(dá)約90%，以及進(jìn)一步的，任性地是與多價離子或其他聚合物交聯(lián)的。可以用于形成生物可降解的遞送系統(tǒng)的示范性的合成聚合物包括聚酰胺、聚碳 酸酯、聚烯、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚對苯二甲酸亞烷酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚 乙烯酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯和其共聚物、烷基 纖維素、羥基烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸和異丁烯酸酯的聚合 物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥基-丙基甲基纖維素、羥基丁基甲基纖維 素、醋酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、苯二甲酸醋酸纖維素、羧基乙基纖維素、三 醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸 丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸基酯)、聚(甲基丙 烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸酸異丁 酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(氧乙烯)、聚(對苯二甲酸亞乙 酯)、聚(乙烯醇)、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及乳酸和乙醇酸 的聚合物、聚酐、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共己內(nèi)酯)和天然聚合物，例 如，藻酸鹽和其他多糖，包括葡聚糖和纖維素、膠原蛋白、其化學(xué)衍生物(化學(xué)基團(tuán)的取代、 添加，例如，烷基、亞烷基、羥基化、氧化和本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行的其他常規(guī)修飾)、白蛋白和 其他親水性蛋白質(zhì)、玉米蛋白和其他醇溶谷蛋白和疏水性蛋白質(zhì)、共聚物和其混合物。一般 地，這些材料通過在體內(nèi)酶水解或暴露于水、通過表面或骨架侵蝕(bulk erosion)來降解。技術(shù)人員將認(rèn)識到，使用本發(fā)明的化合物來治療急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休 克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、傳染性疾病或早產(chǎn)的最佳處置方案可以 直接的確定。這不是實驗的問題，而是優(yōu)化的問題，這是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)地進(jìn)行的。裸鼠中 的體內(nèi)研究常常提供了出發(fā)點，從該出發(fā)點開始優(yōu)化劑量和遞送方案。注射的頻率開始將 是每周一次，如在某些小鼠研究中進(jìn)行的一樣。然而，取決于從初始的臨床試驗獲得的結(jié)果 和特定患者的需求，這個頻率可以從一天到每兩周到每月來最佳地調(diào)整。人類劑量數(shù)量可以通過從小鼠中使用的化合物的數(shù)量推斷來初步確定，熟練的技 術(shù)人員知道，與動物模型相比修改人類的劑量是本領(lǐng)域常規(guī)的。在某些實施方式中，設(shè)想的 是劑量可以在約1 mg化合物/kg體重到約5000 mg化合物/kg體重之間變化；或從約5 mg/ kg體重到約4000 mg/kg體重或從約10 mg/kg體重到約3000 mg/kg體重；或從約50 mg/ kg體重到約2000 mg/kg體重；或從約100 mg/kg體重到約1000 mg/kg體重；或從約150mg/kg體重到約500 mg/kg體重。在其他實施方式中，這個劑量可以是約1、5、10、25、50、75、 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、 1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000 mg/kg體重。在其他實施方式中，設(shè)想的是可以使用更高 的劑量，這樣的劑量可以在約5 mg化合物/kg體重到約20 mg化合物/kg體重的范圍內(nèi)。 在其他實施方式中，劑量可以是約8、10、12、14、16或18 mg/kg體重。當(dāng)然，這個劑量數(shù)量 可以向上或向下調(diào)整，如在這樣的治療方案中常規(guī)地進(jìn)行的，取決于初步臨床試驗的結(jié)果 和特定患者的需要。組合治療
本發(fā)明的組合物和方法可以與本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)療法組合地施用。例如，其他 治療試劑可以是抗癌試劑、抗炎癥試劑、抗凝劑或免疫調(diào)節(jié)物。例如，雙脫氧核苷，例如齊 多夫定(AZT)、2’，3’ -雙脫氧肌苷(ddl)和2，，3，-雙脫氧胞嘧啶(ddC)、拉米夫定(3TC)、 司他夫定(d4T)和TRIZIMR (abacavir+zidovudine+拉米夫定)、非核苷類，例如，依法韋 (DMP-266, DuPont Pharmaceuticals/Bristol Myers Squibb)、奈韋拉平(Boehringer Ingleheim)和 delaviridine (Pharmacia-Upjohn)、TAT 拮抗劑例如 Ro 3-3335 和 Ro 24-7429,蛋白酶抑制物，例如，茚地那韋(Merck),利托那韋(阿博特)、沙奎那韋 (Hoffmann LaRoche)、奈非那韋(Agouron Pharmaceuticals)、141 W94(Glaxo-Wellcome)、 阿扎那韋(Bristol Myers Squibb)、安普那韋(GlaxoSmithKline)、fosamprenavir (GlaxoSmithKline)、替拉那韋(Boehringer Ingleheim), KALETRA (洛匹那韋 + 利托那 韋，Abbott)和其他試劑例如9- (2-羥基乙氧基甲基)鳥嘌呤(無環(huán)鳥苷)、干擾素，例如， α-干擾素、白細(xì)胞介素II和膦甲酸(Foscarnet)、或進(jìn)入抑制物，例如，T20(enfuvirtide， Roche/Trimeris)或UK-427，857 (Pfizer)、左旋咪唑或胸腺素、順鉬、卡鉬、多西他賽、紫 杉醇、氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、絲裂霉素、吉非替尼、 長春新堿、長春堿、多柔比星、環(huán)磷酰胺、塞來考昔、羅非考昔、伐地考昔、布洛芬、萘普生、酮 洛芬、地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、退熱凈、米索硝唑、氨磷汀、坦洛新、非那吡 啶、昂丹司瓊、格拉司瓊、阿洛司瓊、帕洛諾司瓊、異丙嗪、丙氯拉嗪、曲美芐胺、阿瑞吡坦、地 芬諾酯與阿托品和/或洛哌丁胺?？鼓齽├缈鼓窱II、活化蛋白C和蛋白酶抑制物， 例如，fur in抑制物。如果希望，誘導(dǎo)組織修復(fù)或再生、或防止細(xì)胞死亡的試劑與I α Ip蛋白一起施用。 這樣的試劑包括干細(xì)胞、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、整聯(lián)蛋白、血管生成因子、抗炎 因子、糖胺聚糖、vitrogen、抗體和其片段、這些試劑的功能等效物和其組合。本發(fā)明的組合 物可以同時地、或在相互間幾個小時、幾天或幾周內(nèi)施用。在一種方法中，誘導(dǎo)組織修復(fù)或 再生或防止細(xì)胞死亡的試劑在此處描述的常規(guī)治療劑之前、同時或之后施用。試劑盒
本發(fā)明提供了用于I α Ip蛋白的純化的試劑盒。在一個實施方式中，所述試劑盒包括 用于I α Ip蛋白的層析純化的試劑。在某些實施方式中，所述試劑盒包含無菌容器，其含有 低PH值洗滌緩沖液(例如，ρΗ 3. 1-4.0);這樣的容器可以是安瓿劑、瓶子、小瓶、試管、袋子、 小袋、泡罩包裝或本領(lǐng)域已知的其他適合的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃或適合 于保持試劑的其他材料制成。
如果希望，本發(fā)明的試劑盒提供了用于I α Ip蛋白的純化的試劑以及純化方案的 說明。所述說明一般將包括關(guān)于純化方案中使用的緩沖條件和體積的信息。在其他實施方 式中，所述說明包括至少一種以下的試劑或試劑的組合的描述；預(yù)防措施；警告；科學(xué)研 究；和/或參考文獻(xiàn)。所述說明可以直接印刷為獨立的頁、小冊子、卡片或折頁，或在容器上 (當(dāng)有容器時)，或貼在試劑盒內(nèi)或與試劑盒一起提供的容器上的標(biāo)簽。本發(fā)明提供了用于提高受試者中間-α抑制物蛋白(I α Ip)水平或降低受試者中 細(xì)胞因子趨化因子或蛋白酶水平的試劑盒。本發(fā)明還提供了用于與受試者中Ia Ip水平的 降低或受試者中細(xì)胞因子、趨化因子或蛋白酶水平的提高相關(guān)的疾病、病癥或其癥狀的治 療或預(yù)防的試劑盒。疾病、病癥或其癥狀可以包括急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性 休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病或早產(chǎn)。在一個實施方式 中，所述試劑盒包括包含有效量的純化的I α Ip的藥物包裝。優(yōu)選的，所述組合物以單位劑 量形式存在。在某些實施方式中，所述試劑盒包含無菌容器，其含有治療或預(yù)防組合物；這 樣的容器可以是盒子、安瓿瓶、瓶子、小瓶、試管、袋子、小袋、泡罩包裝或本領(lǐng)域已知的其他 適合的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合于保持藥物的其他 材料制成。如果希望，本發(fā)明的組合物或其組合與向需要的受試者施用它們的說明一起提 供。說明一般將包括關(guān)于化合物用于治療或預(yù)防可用I α Ip治療的疾病或病癥(例如，急 性的炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損 傷、傳染性疾病或早產(chǎn))的使用的信息。在其他實施方式中，說明包括至少一種以下的化 合物或化合物的組合的描述；對于提高受試者中的I α Ip水平和/或降低受試者中的細(xì)胞 因子、趨化因子或蛋白酶水平的給藥日程和施用；對于治療急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休 克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病或早產(chǎn)或其癥 狀的給藥日程和施用；預(yù)防措施；警告；適應(yīng)癥；反向指示(counter indication)；過量信 息；有害反應(yīng)；動物藥理學(xué)；臨床研究；和/或參考文獻(xiàn)。所述說明可以直接印刷在容器(當(dāng) 有容器時)上，或作為貼在容器上的標(biāo)簽，或作為容器中提供的或與容器一起提供的獨立的 頁、小冊子、卡片或折頁。本發(fā)明還提供了用于分析樣品中的間-α抑制物蛋白(I α Ip)的試劑盒。在一個 實施方式中，所述試劑盒包括已知數(shù)量的純化的I α IP。所述已知數(shù)量的純化的I α Ip可以 用作分析參考物用于未知I α Ip濃度的樣品中I α Ip的測量。優(yōu)選的，所述組合物以等分 量存在。在某些實施方式中，所述試劑盒包含無菌容器，其含有純化的I α Ip的等分量；這 樣的容器可以是盒子、安瓿瓶、瓶子、小瓶、試管、袋子、小袋、泡罩包裝或本領(lǐng)域已知的其他 適合的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔或適合于保持化合物或溶 液的其他材料制成。在其他實施方式中，所述說明包括至少一種以下的化合物或化合物的 組合的描述。所述說明可以直接印刷在容器(當(dāng)有容器時)上，或作為貼在容器上的標(biāo)簽，或 作為容器中提供的或與容器一起提供的獨立的頁、小冊子、卡片或折頁。
實施例實施例1. IaIp在涉及用低ρΗ值緩沖液洗滌的單個層析步驟中純化。利用單個層析步驟從人血漿純化I a Ip的方案涉及低ρΗ值洗滌(附圖1Α)。使用低PH值洗滌步驟的I α Ip純化方案被用于從冷凍貧乏的血漿中純化I α Ip0冷凍貧乏的血 漿(在25 mM Tris +200 mM NaCl, pH 7. 6的1 :10稀釋物；0. 2 μ m過濾的)。稀釋的血漿 (五十(50)倍柱體積)以5倍柱體積(cv)每分鐘的流速施加到商業(yè)上可獲得的1 mL DEAE 單片柱(DEAE-CIM;BIA S印arations)上。柱的結(jié)合能力被預(yù)測為每1 mL柱體積約50 mL 稀釋的血漿。采集流通物。其他血漿稀釋緩沖液(20倍柱體積25 mM Tris, 20 mM NaCl,pH 7. 6)施加到柱上以容許起始材料完全地穿過柱。當(dāng)流通峰返回基線時，柱用洗滌緩沖液(5 倍柱體積的150 mM乙酸，pH 4. 0，或200 mM乙酸，pH 3. 3)洗滌，采集峰。在低pH值洗滌 之后，柱進(jìn)一步用緩沖液洗滌以將PH值提高到低pH值洗滌之前的(15倍柱體積的100 mM TrisaOO mM NaCl, pH 7. 6)以準(zhǔn)備洗脫。結(jié)合的蛋白質(zhì)用高鹽洗脫緩沖液(15倍柱體的 25 mM Tris,1000 mM NaCl,pH 7. 6)洗脫。采集峰，這個級分含有高純度的I α Ip。為了交 換緩沖液和除去低分子量溶質(zhì)和鹽，利用30 kDa的膜截斷進(jìn)行超濾或滲濾。純化的I α Ip 也可以凍干。在三次獨立的分離中利用三種不同的洗滌緩沖液通過DEAE單片層析的相同數(shù)量 血漿的分級，被用于確定在洗滌步驟期間降低PH值對I α Ip蛋白的純化的作用。不使用 低PH值洗滌(pH 7. 6)通過DEAE單片層析的血漿的分級當(dāng)用1000 mM NaCl CpH 7. 6)洗 脫時產(chǎn)生了相對大的峰的洗脫(附圖2A)。純化的I α Ip具有大于95%Ι α Ip的產(chǎn)率，純度 約10-15%之間。應(yīng)用低pH值洗滌(pH 4.0)產(chǎn)生了大的峰，代表了在用1000 mM NaCl CpH 7. 6)洗脫之前通過低pH值洗滌的進(jìn)一步污染物的分離。在洗脫的級分中，約95%的I α Ip 被回收，40-50%純度(附圖2Β)。與pH 4.0相比，降低洗滌步驟的pH值到pH 3. 3引起了洗 脫峰大小的減少(附圖2C)。洗脫的產(chǎn)率是約90%Ι α Ιρ，純度80_90% (附圖2C)。這些研究 顯示了在洗滌步驟期間降低PH值產(chǎn)生了更高純度的Ια Ιρ，伴有產(chǎn)率的微小降低。冷凍貧乏的血漿通過DEAE單片層析利用兩種低pH值洗滌緩沖液(150 mM乙酸、 PH 4.0，和200 mM乙酸、pH 3. 3)分離，用于檢查對蛋白質(zhì)的分級的作用(附圖3)。每個低 PH值洗滌引起一定量蛋白質(zhì)從柱上去除。由于相應(yīng)于兩種低pH值洗滌緩沖液的應(yīng)用觀察 到兩個峰，這種結(jié)果表明在PH 3. 3的第二次低pH值洗滌可以進(jìn)一步除去pH 4.0的第一次 低PH值洗滌沒有除去的污染物。當(dāng)組分D和組分C用作起始材料時(附圖4A-4D)，觀察到 顯示了第二次低PH值洗滌步驟的進(jìn)一步蛋白質(zhì)去除的類似結(jié)果。還通過Wfestern印跡分析了通過DEAE單片柱層析來自組分D起始材料的I α Ip蛋 白純化的級分(附圖5)。在第一次低pH值洗滌時(150 mM乙酸，pH 4. 0)，可以檢測到I α Ip (250 kDa)。在第二次低 pH 值洗滌(200 mM 乙酸、pH 3. 3)時，某些 I α Ip (250 kDa 和 125 kDa)也變得與柱不結(jié)合，被洗脫在不結(jié)合的物質(zhì)中。然而，在洗脫物中檢測到主要數(shù)量的純 化的I α Ip蛋白。對于利用兩次低pH值洗滌通過DEAE單片柱層析、從組分C起始材料的 I α Ip蛋白的純化，觀察到類似的結(jié)果。對于利用兩個低pH值洗滌步驟(pH 4.0和pH 3. 3)通過DEAE單片柱層析 (DEAE-CIM ；BIA Separations )來自組分D起始材料的分離的級分，也測定了產(chǎn)率和純度的 量(表1)。表權(quán)利要求
1.一種純化間-α抑制物蛋白(I α Ip蛋白)的方法，所述方法包括其中所述I α Ip蛋 白暴露于約4. 0或更低的ρΗ值的條件的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，包括其中Iα Ip蛋白暴露于約3. 6或更低的ρΗ值的條件的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，包括其中Iα Ip蛋白暴露于約3. 3或更低的ρΗ值的條件的步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，包括其中Iα Ip蛋白暴露于約3. 3到約2. 9之間的ρΗ值的條件 的步驟。
5.權(quán)利要求1-4的任一項的方法，包括層析步驟或固相提取步驟。
6.權(quán)利要求1-5的任一項的方法，其中所述層析步驟包括液相層析、柱層析、陰離子交 換層析或其組合。
7.權(quán)利要求1-6的任一項的方法，其中所述層析包括單片支持物或基于顆粒的支持物 的使用。
8.權(quán)利要求1-7的任一項的方法，其中所述單片支持物或顆粒支持物包括固定的陰離 子交換配體。
9.權(quán)利要求1-8的任一項的方法，其中所述固定的陰離子交換配體是二乙基氨基乙烷 (DEAE)或季胺(Q)。
10.權(quán)利要求1-9的任一項的方法，包括至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一個 緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約4. 0或更低的ρΗ值。
11.權(quán)利要求1-10的任一項的方法，包括至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一 個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 6或更低的ρΗ值。
12.權(quán)利要求1-11的任一項的方法，包括至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一 個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 3或更低的ρΗ值。
13.權(quán)利要求1-12的任一項的方法，包括至少一個緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一 個緩沖液洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約3. 3到約2. 9之間的ρΗ值。
14.權(quán)利要求1-13的任一項的方法，包括緩沖液洗滌步驟，其中所述至少一個緩沖液 洗滌步驟的洗滌緩沖液具有約250 mM NaCl或更高的鹽濃度。
15.權(quán)利要求1-14的任一項的方法，其中所述Iα Ip蛋白是從血液純化的。
16.權(quán)利要求1-15的任一項的方法，其中所述IaIp蛋白是從血漿或血漿組分純化的。
17.權(quán)利要求1-16的任一項的方法，其中所述血漿是冷凍貧乏的血漿，或所述血漿組 分是中間血漿組分。
18.權(quán)利要求1-17的任一項的方法，其中所述中間血漿組分是含有Iα Ip的組分。
19.權(quán)利要求1-18的任一項的方法，其中所述血液、血漿組分或中間血漿組分是人類、 靈長類、牛、馬、豬、羊、貓、犬或其組合的。
20.權(quán)利要求1-19的任一項的方法，其中所述Iα Ip蛋白具有約60到約280 kDa之間 的表觀分子量。
21.權(quán)利要求1-20的任一項的方法，其中所述Iα Ip蛋白具有生物學(xué)活性。
22.權(quán)利要求1-21的任一項的方法，其中所述生物學(xué)活性是細(xì)胞因子抑制物活性、趨 化因子抑制物活性或絲氨酸蛋白酶抑制物活性。
23.權(quán)利要求1-22的任一項的方法，其中所述方法具有約85%到約100%Ια Ip蛋白的產(chǎn)率。
24.權(quán)利要求1-23的任一項的方法，進(jìn)一步包括病毒滅活步驟或納濾步驟。
25.權(quán)利要求1-24的任一項的方法，其中所述病毒滅活步驟或納濾步驟在層析步驟之 前發(fā)生。
26.權(quán)利要求1-25的任一項的方法，其中所述病毒滅活步驟或納濾步驟在層析步驟之 后發(fā)生。
27.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1-26的方法純化的I α Ip蛋白的組合物。
28.一種藥物組合物，包含有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-26的任一項的方法純化的 I α Ip蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，用于在有需要的受試者中的治療。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述有需要的受試者是人類、靈長類、牛、馬、豬、 羊、貓或犬。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其中有需要的受試者是被鑒定為需要急性炎性疾病、 膿毒癥、嚴(yán)重休克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病 或早產(chǎn)的治療的人類。
32.—種治療或預(yù)防受試者中的疾病或疾病癥狀的方法，包括向所述受試者施用權(quán)利 要求28的組合物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述受試者被鑒定為需要用權(quán)利要求27的組合物治療。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述受試者被鑒定為需要急性炎性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重休 克、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、外傷/損傷、傳染性疾病或早產(chǎn)的治療。
35.一種用于純化I α Ip蛋白的試劑盒，其包含ρΗ值約4. 0或更低的至少一種緩沖溶 液和使用所述試劑盒的說明。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中至少一種緩沖溶液是具有約4.0或更低的ρΗ值的洗滌 緩沖液。
37.權(quán)利要求35的試劑盒，其中至少兩種緩沖溶液是具有約4.0或更低的ρΗ值的洗滌 緩沖液。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中第一洗滌緩沖液具有約4.0的ρΗ值，第二洗滌緩沖液 具有約2.9的ρΗ值。
39.權(quán)利要求35的試劑盒，進(jìn)一步包括具有250mM NaCl或更高的鹽濃度的至少一種 緩沖溶液。
40.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求26的組合物和治療使用的說明。
41.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求26的組合物和分析使用的說明。
42.—種純化間- α抑制物蛋白(I α Ip蛋白)的方法，所述方法包括將血液、血漿組分或中間血漿組分置于層析柱上，使所述柱經(jīng)歷約4. 0或更低的ρΗ值的洗滌緩沖液。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述間-α抑制物蛋白(Iα Ip蛋白)結(jié)合所述柱。
44.權(quán)利要求42-43的任一項的方法，其中所述間-α抑制物蛋白(Iα Ip蛋白)是分 離的。
45.通過權(quán)利要求1-26的任一項的方法制得的純化的間-α抑制物蛋白(Iα Ip蛋白)。
46.權(quán)利要求44的Iα Ip蛋白，其中所述I α Ip蛋白在競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)中測得具有相比參考物提高的結(jié)合。
47.權(quán)利要求46的Iα Ip蛋白，相比所述參考物，其中所述結(jié)合提高至大于1、1. 5、2、 3、4、5 或 10 倍。
48.權(quán)利要求45的Iα Ip蛋白，其中所述I α Ip蛋白具有約85%到約100%純的純度。
49.一種試劑盒，包含權(quán)利要求45-48的任一項的I α Ip蛋白和分析使用的說明。
全文摘要
本發(fā)明一般地提供了從血液純化間-α抑制物蛋白(IαIp)和其組合物的方法。
文檔編號G01N33/53GK102112876SQ200980129119
公開日2011年6月29日 申請日期2009年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者E.S.西爾亞, P.布爾內(nèi), Y-P.林 申請人:普羅瑟拉生物制劑有限責(zé)任公司