專(zhuān)利名稱(chēng)：用蛋白指紋法檢測(cè)急性心肌梗死在血液中蛋白指紋的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法，具體指用于生物樣品分析的蛋白指紋法。本發(fā)明還涉及用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組并采用計(jì)算機(jī)可讀取的條碼格式(蛋白指紋)分析的蛋白指紋法。
背景技術(shù)：
不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開(kāi)發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行定性鑒定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內(nèi)等電點(diǎn)聚焦先分離蛋白質(zhì)，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行第二次分離。結(jié)果得到一張根據(jù)等電點(diǎn)范圍(凈電荷)和大小(質(zhì)量)來(lái)區(qū)分蛋白質(zhì)的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項(xiàng)特征—質(zhì)量和等電點(diǎn)(pI)。其次，各維度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質(zhì)量差異小于5％或pI差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無(wú)法檢測(cè)出少量表達(dá)的生物分子。第四，無(wú)法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測(cè)出疾病的已知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時(shí)間，這阻礙了此類(lèi)診斷方法的發(fā)展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項(xiàng)，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據(jù)多種分析物/吸附劑相互作用來(lái)分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而費(fèi)時(shí)。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質(zhì)譜的方法測(cè)定蛋白質(zhì)是較新的方法，但目前的質(zhì)譜分析方法只能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，無(wú)法進(jìn)行定量分析，尤其在是樣品中混合物復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量極小的情況下。
滯留層析法是上世紀(jì)90年代開(kāi)發(fā)的一種新的生物分析方法(Singh TK，F(xiàn)ox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人將其用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究中。滯留層析中先將待測(cè)樣品與選定的吸附劑結(jié)合，然后檢測(cè)滯留在吸附劑上的分析物。與常規(guī)層析不同，進(jìn)行滯留層析時(shí)無(wú)需將分析物先從吸附劑上洗脫，而是直接進(jìn)行檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。但目前未見(jiàn)到文獻(xiàn)有用滯留層析法進(jìn)行蛋白指紋鑒定分析。
蛋白指紋技術(shù)最早源于馬鈴薯/土豆品種鑒定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。當(dāng)時(shí)用電泳技術(shù)來(lái)區(qū)別分不同品種土豆。因?yàn)椴煌贩N的土豆在電泳下有不同的蛋白指紋組合。由于人體細(xì)胞蛋白比土豆要復(fù)雜的多，故僅用電泳來(lái)鑒別疾病的蛋白指紋遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測(cè)正常人細(xì)胞、不穩(wěn)定型心絞痛細(xì)胞及急性心肌梗死細(xì)胞在血液中蛋白指紋用途的新方法。
本發(fā)明采用蛋白指紋法對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒別。
蛋白指紋法是通過(guò)鑒別檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)組用于疾病診斷。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)的定義是研究一組蛋白質(zhì)在細(xì)胞終身表達(dá)的變化狀態(tài)。蛋白質(zhì)組學(xué)的目的之一是鑒定和描述由于不同細(xì)胞差異表達(dá)的有機(jī)生物分子。通過(guò)比較表達(dá)情況可以鑒定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別。鑒別出可作為某種疾病標(biāo)志的蛋白質(zhì)組，可用于該疾病的診斷及治療藥物的篩選。
本發(fā)明所述的鑒別檢測(cè)蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。
本發(fā)明用滯留層析法從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出并捕獲到用于檢測(cè)的蛋白質(zhì)組。滯留層析法是將樣品與用于解吸譜分析的多種吸附劑/洗脫劑組合接觸，由此利用其它分離和檢測(cè)系統(tǒng)所無(wú)法達(dá)到的高信息分辨能力鑒定在兩樣品中存在情況不同的分析物(即，兩份細(xì)胞或組織液提取物中差異表達(dá)的蛋白質(zhì))。根據(jù)吸附劑/洗脫劑組合的化學(xué)特性測(cè)定包括分子量在內(nèi)的理化特征的蛋白質(zhì)。詳述本方法如下I 吸附劑包含陰離子，陽(yáng)離子，親水，疏水或配位共價(jià)金屬螯合劑作用吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽(yáng)離子蛋白質(zhì)，配位共價(jià)金屬螯合劑上滯留說(shuō)明多肽分析物內(nèi)存在組氨酸殘基)。更具體的說(shuō)，可以開(kāi)發(fā)出化學(xué)生物特異性吸附劑以檢測(cè)重要的診斷標(biāo)記。在某實(shí)施例中，基質(zhì)可具有為診斷疾病或綜合征所用標(biāo)記組合而選用的吸附位點(diǎn)排列。
II 信息處理在特定洗脫條件下檢測(cè)被吸附結(jié)合的分析物提供了有關(guān)樣品中分析物及其化學(xué)特征的信息。吸附作用在一定程度上取決于吸附劑的結(jié)合特性。與吸附劑結(jié)合的分析物具有使得結(jié)合成為可能性的特性。例如，在特定pH下是陽(yáng)離子的分子在具有該pH的洗脫條件下將與陰離子吸附劑結(jié)合。強(qiáng)陽(yáng)離子分子只有在很強(qiáng)的洗脫條件下才從吸附劑上洗脫。所以，樣品中特定分析物在特定洗脫條件下結(jié)合某種吸附劑的確定不僅通過(guò)分析物的彼此分離和與不具有結(jié)合所需的相應(yīng)化學(xué)特性的分析的分離而分辨了混合物中的分析物，而且鑒定出了具有特定化學(xué)特性的一類(lèi)或單一分析物。采集有關(guān)分析物在多種洗脫條件下在一種或多種吸附劑上的滯留信息不僅可詳細(xì)分辨混合物中的分析物，而且提供有關(guān)分析物的化學(xué)信息，這些信息本身就可以完成對(duì)他們的鑒定。這種數(shù)據(jù)被稱(chēng)為“滯留數(shù)據(jù)”。
用可編程計(jì)算機(jī)分析滯留試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)是最簡(jiǎn)單的。計(jì)算機(jī)程序一般包括一個(gè)儲(chǔ)存編碼的可讀介質(zhì)。某計(jì)算機(jī)編碼進(jìn)入存儲(chǔ)，其中包含了基質(zhì)陣列上各種征點(diǎn)的位置，該處的吸附和用來(lái)洗滌吸附劑的洗脫條件。程序于是可用這些信息鑒定出陣列上確定某選擇性的一組特征。計(jì)算機(jī)還包括這樣的編碼，它們接受來(lái)自探針上特定可定址位置的不同分子量的信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)指示所測(cè)分析物的數(shù)量，可能包括所測(cè)各分析物的信號(hào)強(qiáng)度和測(cè)得的分子量。
計(jì)算機(jī)還具有處理數(shù)據(jù)的編碼。實(shí)施例之一中，處理方法涉及形成一個(gè)分析物識(shí)別特征概況。例如，可將據(jù)分子量測(cè)得的特定分析物的滯留數(shù)據(jù)根據(jù)特定的結(jié)合特性(例如與陰離子吸附劑)分類(lèi)。收集到的數(shù)據(jù)提供某特定分析物化學(xué)特征的概況。滯留特性反映分析物功能，后者繼而反映結(jié)構(gòu)。例如，根據(jù)不同pH洗脫條件下在多種陽(yáng)離子和陰離子吸附劑上的滯留水平數(shù)據(jù)所揭示的信息可以得出某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。這進(jìn)而反映出該蛋白質(zhì)內(nèi)離子氨基酸的大致數(shù)量。所以，計(jì)算機(jī)可能包含將結(jié)合信息轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)信息的編碼。而且，對(duì)分析物的二次處理(例如翻譯后修飾)改變識(shí)別特征，這可以由結(jié)合或質(zhì)量差異反映出來(lái)。
得出的數(shù)據(jù)即蛋白指紋，它可以各種格式顯示。一種格式中，信號(hào)強(qiáng)度顯示成分子量的函數(shù)圖。另一種格式又稱(chēng)“條碼格式”，其中，信號(hào)強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示，得出外觀類(lèi)似商場(chǎng)上所用條碼帶讀取商品名稱(chēng)。
III 滯留層析涉及多種分離方法的組合，包括并行檢測(cè)和描述多種分析物。這些組合方法具有多種用途。發(fā)展靶分析物檢測(cè)法；差異蛋白質(zhì)展示；毒理學(xué)篩選；多種診斷標(biāo)記的同時(shí)檢測(cè)；藥物開(kāi)發(fā)。
實(shí)施例對(duì)該方法進(jìn)行了詳細(xì)的描述。細(xì)胞樣品通常包含數(shù)以百千計(jì)的蛋白質(zhì)。人們可能希望準(zhǔn)確分辨出樣品中的每一種靶蛋白。第一步，用多種選擇性條件建立靶分析物的滯留圖。例如，吸附劑可以是陰離子交換劑。
從該滯留圖可以挑選出至少一種靶分析物被保留的選擇條件?？梢蕴暨x靶分析物發(fā)生最大結(jié)合的選擇性條件。但是，如果該選擇性條件對(duì)靶分析物的選擇性比其他選擇性條件更強(qiáng)，則宜選擇靶分析物吸附并非最大的條件。例如，假設(shè)滯留圖分析顯示，在中性pH附近，靶分析物被陰離子交換保留，但也弱吸附于親水性吸附劑。
IV 鑒定生物材料間差異表達(dá)的分析物的方法本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了鑒定在兩種以上樣品中差異表達(dá)的有機(jī)生物分子，特別是蛋白質(zhì)的方法?！安町惐磉_(dá)”指兩樣品間分析物量或質(zhì)上的差異。這些差異可能緣于蛋白質(zhì)表達(dá)的任一階段，該方法利用了滯留層析的超常分辨能力和靈敏度。首先，使用同一組選擇性條件制備的分辨率越高，所以，可比較的分析物數(shù)量也越多。然后，比較識(shí)別圖以鑒定被兩組吸附劑差異保留的分析物。差異滯留包括定量滯留。這提示表達(dá)的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。差異滯留還包括分析物質(zhì)的差異。例如，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的不同會(huì)造成識(shí)別圖的不同，檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為結(jié)合特性差異(例如，如果蛋白質(zhì)被糖基化與凝集素結(jié)合將不同)或質(zhì)量差異(例如翻譯后切割的不同)。這種分析也可以用可編程計(jì)算機(jī)進(jìn)行。
該方法特別適用于檢測(cè)兩種細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白。兩種細(xì)胞可以是正常細(xì)胞和病理細(xì)胞例如癌細(xì)胞，或不同水平的細(xì)胞，或不同發(fā)育或分化階段的細(xì)胞，或細(xì)胞周期內(nèi)不同部分的細(xì)胞。但是。該方法也可用來(lái)檢測(cè)不同條件下的同種細(xì)胞。在這樣的方法中，一份生物樣品與測(cè)試試劑接觸，另一份不接觸。然后，比較兩者的滯留圖。根據(jù)滯留特性或質(zhì)量的不同，該方法可以顯示蛋白質(zhì)或其他生物分子表達(dá)的增加或減少，或發(fā)生了某種改變。
利用滯留圖獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)理化特性信息，用本發(fā)明方法可測(cè)定蛋白質(zhì)的候選特征。
本方法適用于鑒定疾病的診斷標(biāo)記。與正常樣品或細(xì)胞相比，患者樣品或病理培養(yǎng)細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能就是診斷標(biāo)記。
V 通過(guò)分解代謝信號(hào)擴(kuò)增提高靈敏度將大蛋白分裂成小片段然后檢測(cè)這些小片段能夠顯著提高檢測(cè)大蛋白在復(fù)雜混合物差異存在(例如，因?yàn)椴町惐磉_(dá))的靈敏度。靈敏度的提高有幾個(gè)原因。首先，當(dāng)樣品中所有蛋白質(zhì)都被(例如)酶解而片段化時(shí)，大蛋白可能產(chǎn)生更多片段而不是小蛋白。其次，解吸譜法的整體靈敏度在低分子量時(shí)高于高分子量時(shí)。第三，蛋白片段化增加了來(lái)自靶分析物的信號(hào)數(shù)量，因此提高了測(cè)得分析物的可能性。第四，蛋白片段化提高了捕獲可能性，因此提高了測(cè)得靶分析物的可能性。第五，如果蛋白質(zhì)在兩種樣品中差異存在，那么通過(guò)增加來(lái)自該蛋白的信號(hào)數(shù)量，量的差異更可能被測(cè)得。
人體內(nèi)的疾病蛋白標(biāo)志物往往會(huì)受血液中酶的降解。這樣，我們就可以用滯留層析法來(lái)捕獲這種分解代謝信號(hào)，從而提高蛋白指紋的靈敏度。滯留層析分辨的分析物的具體實(shí)例包括生物大分子，例如肽，蛋白質(zhì)，酶，糖，寡糖，多糖；上述生物大分子的片段，例如肽片段和蛋白質(zhì)片段；上述生物大分子復(fù)合物，蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，受體-配體復(fù)合物，酶-底物，酶抑制劑，肽復(fù)合物，蛋白質(zhì)復(fù)合物，糖復(fù)合物和多糖合物；生物小分子，例如氨基酸，藥物，激素，合成小分子，例如藥學(xué)或治療上的有效藥物。
本發(fā)明提供一種統(tǒng)一的操作系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)功能，細(xì)胞功能和生物整體功能的發(fā)現(xiàn)和診斷。
更具體的說(shuō)，根據(jù)分析物在至少兩種不同選擇條件下吸附固定相的能力(例如陰離子/陽(yáng)離子，疏水性/親水性，或特異性生物分子識(shí)別作用)在至少兩種不同的第一維度上分離分析物。然后，用解吸譜(例如激光解吸質(zhì)譜)根據(jù)質(zhì)量在第二維度上分離分析物，進(jìn)一步檢測(cè)已分離的分析物。分析物所吸附的性質(zhì)提供了分析物的物理化學(xué)信息。
在實(shí)施例中，所述的方法包括I)分析物與確切位置上的第一選擇性條件(吸附劑)接觸，使得分析物被吸附劑保留。II)在第一選擇性條件下用解吸譜檢測(cè)滯留的分析物。III)檢測(cè)步驟包括用激光解吸質(zhì)譜測(cè)定分析物的質(zhì)量。
洗脫條件的差異在于pH，緩沖能力，離子強(qiáng)度，水結(jié)構(gòu)特征，除垢劑種類(lèi)，除垢劑強(qiáng)度，疏水性或介電常數(shù)。
本發(fā)明提供一種確定某分析物在第一和第二品中是否差異存在(例如差異表達(dá))的方法。該方法可以用于通過(guò)差異蛋白質(zhì)展示檢測(cè)差異蛋白表達(dá)的組合方法。該方法包括A)測(cè)定分析物在第一樣品中至少一種選擇性條件下的第一滯留圖；B)測(cè)定分析物在第二樣品中相同選擇性條件下的第二滯留圖；和C)比較第一和第二滯留圖之間的差異。兩滯留圖的差異肯定了分析物在第一和第二樣品中的差異存在。
實(shí)施例之一是測(cè)定某種蛋白是否在兩種不同樣品，包含細(xì)胞的第一和第二樣品或來(lái)自細(xì)胞的材料中差異表達(dá)。在實(shí)施例中，第一生物樣品來(lái)自健康者，第二生物樣品來(lái)自某種病癥的患者。樣品可選自例如血液，尿液，血清和組織。以在患者樣品中增加的分析物作為侯選診斷標(biāo)記。通常，確認(rèn)一種診斷標(biāo)記需在多個(gè)受試者中檢測(cè)到該標(biāo)記物。
本發(fā)明在可分析的樣品類(lèi)型上沒(méi)有限制。本發(fā)明特別適用于分辨生物樣品，尤其是生物液體和提取物中的分析物；還特別適用于分辨非生物有機(jī)組合物中的分析物，尤其是有機(jī)分子和無(wú)機(jī)分子的組合物。
滯留層析及蛋白指紋方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的滯留層析及蛋白指紋方法的一個(gè)操作方案實(shí)例。
1.樣品處理將生物樣品稀釋在溶液中。視需要離心澄清樣品。
2.上樣將樣品點(diǎn)樣在基質(zhì)(包括陰離子、陽(yáng)離子、親水、疏水或配位共價(jià)金屬螯合劑)一個(gè)位點(diǎn)上。
3.洗滌用結(jié)合溶劑洗滌。在樣品完全干燥前將第一份2μL洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留15秒。用移液管吸進(jìn)幾次。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份2μL洗滌液重復(fù)以上步驟。
用水徹底洗滌整個(gè)陣列。
自然干燥芯片。
加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。
自然干燥芯片。
用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀用氮激光儀(335nm)和80cm飛行管分析陣列分析滯留與各位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。
本發(fā)明滯留層析及蛋白指紋法可用于細(xì)胞和臨床疾病的診斷，如急性心肌梗死細(xì)胞的診斷。
本發(fā)明提供的方法的特點(diǎn)為(1)準(zhǔn)確滯留層析的一個(gè)特點(diǎn)是能夠從復(fù)雜的樣品混合物中準(zhǔn)確地分辨出分析物。滯留層析中檢測(cè)的是滯留在吸附劑上的分析物。所以，滯留層析可提供有關(guān)滯留分析物化學(xué)或結(jié)構(gòu)特征的直接信息。
滯留層析與常規(guī)層析存在以下區(qū)別。首先，滯留層析中檢測(cè)的是滯留在吸附劑上的分析物。在常規(guī)層析中，分析物先從吸附劑上洗脫，然后進(jìn)行檢測(cè)。用常規(guī)方法檢測(cè)不出吸附劑上洗脫下的分析物。第二，吸附層析與解吸質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合提供了毫微微摩爾級(jí)的優(yōu)良靈敏以及極高的分辨率。第三，在一定程度上，因?yàn)樵试S直接檢測(cè)分析物，滯留層析提供了用多種不同選擇性條件迅速分析滯留物的能力，由此提供多樣品中分析物的快速維度描述。第四，吸附劑可以于預(yù)先確定的排列，可定址位置附著于基質(zhì)上。這就能夠?qū)υ诓煌疵摋l件下接觸不同吸附位置(即，“親合性位置”或“位點(diǎn)”)的分析物進(jìn)行并行處理。
質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的準(zhǔn)確性，一般誤差率只有0.1-1.0Da。例如，檢測(cè)出8131Da及8221Da被配位共價(jià)金屬螯合劑表面的基質(zhì)所捕捉的蛋白，由于質(zhì)譜差率只有0.1-1.0Da，蛋白8131Da及8221Da不可能是一種蛋白質(zhì)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的而氨基酸的平均質(zhì)量為100Da，因此，必須有50Da以上的差距，才可能是第二種蛋白質(zhì)。
(2)方便本方法將血清蛋白分成了幾大類(lèi)，即陰離子、陽(yáng)離子、親水、疏水或配位共價(jià)金屬螯合劑作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。
(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行疾病血清診斷時(shí)，無(wú)需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明采用了計(jì)算機(jī)“條碼格式”，信號(hào)強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示。此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對(duì)比強(qiáng)弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此“蛋白指紋”或條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析。
心肌梗死是心血管疾病中死亡率最高的疾病之一，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重要疾病。目前臨床上診斷急性心肌梗死的標(biāo)準(zhǔn)是①典型的持續(xù)的胸痛史，②典型的心電圖改變，包括ST段抬高和Q波出現(xiàn)，③心肌酶學(xué)的改變。并認(rèn)為以上三項(xiàng)中的二項(xiàng)以上陽(yáng)性可診斷為急性心肌梗死。急性心肌損傷的臨床診斷常依賴(lài)心電圖和病史，但單一心電圖還存在不足，心電圖診斷急性心肌梗死的陽(yáng)性率可達(dá)80％，仍有部分病人必須依靠生化標(biāo)志物確診。而心電圖和心肌酶譜對(duì)心肌梗死確診存在不足，因此尋求靈敏度和特異性均較高的血清學(xué)診斷方法是必要的。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究來(lái)發(fā)現(xiàn)一種靈敏度和特異性均較高且易于臨床檢測(cè)的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 正常人細(xì)胞、不穩(wěn)定型心絞痛細(xì)胞及急性心肌梗死細(xì)胞在血液中蛋白指紋的區(qū)分(1)實(shí)驗(yàn)方法一、材料1.標(biāo)本來(lái)源急性心肌梗死患者組有99例患者，均經(jīng)心電圖和心肌酶譜診斷為急性心肌梗死，其中患者入院時(shí)立即采血45例，3小時(shí)后采血6例，6小時(shí)后采血11，9小時(shí)后采血12例，12小時(shí)后采血12例，24小時(shí)后采血8例，48小時(shí)采血5例；正常人組有45例正常人；不穩(wěn)定型心絞痛患者組有21例患者。三個(gè)組年齡均在40-60歲間，有相似的暴露史。男女比例急性心肌梗死患者組為男性56例、女性43例；不穩(wěn)定型心絞痛組為男性12例、女性9例；正常人組男性30例、女性25例。三組均無(wú)影響血清中蛋白質(zhì)含量的其它相關(guān)性疾病。
2.試劑Cibacron Blue、尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sinapinic acid)均購(gòu)自Sigma公司。
二、方法1.樣品的收集全血采集后立即放入4℃冰箱靜置3h，4℃1000r/min離心、30min后，吸取血清按100μl/管分裝，置于-70℃保存；2.樣品的準(zhǔn)備用Cibacron Blue除去人血清中的白蛋白，后取20μl，按1∶7用pH7.0緩沖液(100mmol/L磷酸鈉，250mmol/L氯化鈉)稀釋至150μl。
3.芯片的預(yù)處理芯片每孔加50μl 100mmol/L硫酸銅，室溫下200r/min振蕩5min，倒除硫酸銅，用去離子水沖洗5次后甩干，每孔中加入50μl 100mmol/L醋酸鈉(pH4.0)室溫下200r/min振蕩5min，以除去沒(méi)有結(jié)合的銅離子，芯片每孔加入150μl結(jié)合/洗脫緩沖液(50mmol/L HEPES pH7.0)，置于振蕩器上，室溫孵育5min后除去緩沖液，重復(fù)1次，后每孔加入50μl稀釋好的樣品，置于振蕩器上，4℃孵育60min后除去緩沖液，接著用150μl結(jié)合/洗脫緩沖液沖洗3次，每次振蕩5min，最后1次用1mM HEPES pH7.0快速?zèng)_洗，取出芯片，在每孔周?chē)檬杷P圈樣品孔并風(fēng)干，在EAM(SPA)中加入75μl乙氰，75μl 1％TFA，充分振蕩5min確保SPA全部溶解，離心1min；每孔分2次加SPA(1μl/次)，2次之間允許各孔風(fēng)干。
4.芯片檢測(cè)用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，設(shè)定儀器參數(shù)，結(jié)果用計(jì)算機(jī)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)以每秒1GHz的速度從所獲得的原始數(shù)據(jù)快速精確的繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對(duì)含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比。
4.1蛋白質(zhì)質(zhì)荷比結(jié)合EAM后的蛋白質(zhì)在激光的轟擊下電離，帶有電荷的蛋白質(zhì)在加速電場(chǎng)的作用下，不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)在長(zhǎng)度一定的真空管中飛行所需的時(shí)間不同，蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比(M/Z)與離子飛行時(shí)間的平方成正比。
由E＝UZ＝1/2mv2；t=Lv]]>推出M/Z=Kt2=2UL2t2]]>其中Z為離子所帶電荷數(shù)，U為電壓，v為飛行速度，L為加速飛行電場(chǎng)電壓，K為常數(shù)。
4.2蛋白質(zhì)相對(duì)含量帶有正電荷的蛋白質(zhì)離子束在到達(dá)檢測(cè)器的一瞬間，電子倍增器將產(chǎn)生的瞬時(shí)電流(瞬時(shí)電流It＝Q/t，其中Q為t時(shí)刻檢測(cè)器檢測(cè)到的電荷數(shù))轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計(jì)算機(jī)讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿蛋白指紋著線性軸的暗度強(qiáng)度值信號(hào)，此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對(duì)比強(qiáng)弱。通過(guò)分析幾千種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述3種蛋白指紋可以用于區(qū)分正常人細(xì)胞、不穩(wěn)定型心絞痛細(xì)胞及急性心肌梗死細(xì)胞。
1.質(zhì)譜圖分析設(shè)定參數(shù)分別對(duì)三組所得質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，共測(cè)三組有差異的蛋白質(zhì)峰為38個(gè)，心肌梗死組與不穩(wěn)定型心絞痛組及正常人組在33處蛋白質(zhì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。
2.三組蛋白質(zhì)的對(duì)比99例急性心肌梗死患者與45例正常人和21例不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8149.84±1Da，4649.63±1Da，3778.71±1Da三個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物可將急性心肌梗死患者與正常人及不穩(wěn)定型心絞痛患者準(zhǔn)確的分組。用這個(gè)生物標(biāo)志物分析數(shù)據(jù)共產(chǎn)生4個(gè)終節(jié)點(diǎn)其中終節(jié)點(diǎn)1只包含急性心肌梗死患者，共99例，滿足M8149.84≤3.042(M代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，下同)為終節(jié)點(diǎn)1；終節(jié)點(diǎn)2只包含正常人，其41例，滿足M4649.63≤2.603為終節(jié)點(diǎn)；終節(jié)點(diǎn)3只包含正常人，共4例，滿足M3778.71≤0.263為終節(jié)點(diǎn)3；終節(jié)點(diǎn)4只包含變異型心絞痛，其21例，滿足M3778.71≥0.263為終節(jié)點(diǎn)4。錯(cuò)誤分率為0％。
3.三組8149Da蛋白質(zhì)含量差異正常人質(zhì)荷比為8149Da蛋白質(zhì)含量明顯高于不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者，而不穩(wěn)定型心絞痛患者又比急性心肌梗死患者要高。經(jīng)方差分析，三組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)。
表1三組在質(zhì)荷比為8149Da處蛋白質(zhì)的相對(duì)含量

注三組蛋白質(zhì)相對(duì)含量比較(P≤0.01)。
4.預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三組，結(jié)果顯示用這3個(gè)蛋白質(zhì)組成的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)99/99例急性心肌梗死患者與45/45例正常人及21/21例不穩(wěn)定型心絞痛患者被正確分組，準(zhǔn)確率為100％(165/165)。
5.特異性和敏感度99例急性心肌梗死患者用本方法均被診斷為急性心肌梗死患者，45例正常人用本方法均被診斷為正常人，不穩(wěn)定型心絞痛患者均被本方法診斷為不穩(wěn)定型心絞痛患者。靈敏度和特異性分別為100％(99/99)，100％(66/66)。
6.實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性從我們的試驗(yàn)結(jié)果看，重復(fù)性很好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，兩樣品孔測(cè)定的結(jié)果滿足y＝0.9865x+0.098；R2＝0.9583。
(2)結(jié)論本研究利用IMAC3-Cu芯片對(duì)99例確診為急性心肌梗死患者與45例正常人血清和21例結(jié)不穩(wěn)定型心絞痛患者血清進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中質(zhì)荷比4kDa至10kDa中的11個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)含量三組有明顯的差異，三組在質(zhì)荷比為8149Da的蛋白質(zhì)相對(duì)含量有明顯差異，并且3個(gè)蛋白質(zhì)所組合成的分組標(biāo)準(zhǔn)診斷急性心肌梗死的靈敏度為100％(99/99)，特異性為100％(66/66)。
本實(shí)驗(yàn)中心肌梗死患者組有發(fā)病后不同時(shí)間的血清標(biāo)本，但結(jié)果仍與正常人與不穩(wěn)定型心絞痛可以完全分開(kāi)，表明在急性心肌梗死病程的不同時(shí)期都有相同的血清蛋白質(zhì)的變化。
權(quán)利要求
1.一種用滯留層析法捕獲生物樣品中蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分析方法，其特征是采用蛋白指紋法對(duì)樣品中蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒別檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的鑒別檢測(cè)中蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。分析所得數(shù)據(jù)的形式是可用計(jì)算機(jī)讀取的條碼格式(蛋白指紋)—蛋白指紋法，其質(zhì)譜分析范圍為0～500kDa。每一條碼帶代表一種分子量，其顏色深淺代表蛋白質(zhì)量多與少。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的蛋白指紋(條碼格式或質(zhì)譜分子量的函數(shù)圖)可以被編程計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)和用軟件分析。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，在滯留層析法中所用的吸附劑包括陰離子、陽(yáng)離子、親水、疏水或配位共價(jià)金屬螯合劑作用吸附劑。
5.權(quán)利要求1中滯留層析法所用吸附劑的支持物可以是金屬片，玻璃片，陶瓷片，陶瓷珠，磁性微?；蚨嗑垠w。
6.權(quán)利要求1所述生物樣品來(lái)源于血液。
7.權(quán)利要求1所述蛋白指紋圖譜在定期監(jiān)測(cè)生物樣品中蛋白指紋動(dòng)態(tài)變化的用途。
8.用權(quán)利要求1的方法分析生物樣品中特異的蛋白質(zhì)組以檢測(cè)正常人細(xì)胞、不穩(wěn)定型心絞痛細(xì)胞及急性心肌梗死細(xì)胞在血液中蛋白指紋的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析的蛋白指紋法。本方法用質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別檢測(cè)蛋白質(zhì)組。分析所得數(shù)據(jù)的形式是可用計(jì)算機(jī)讀取的條碼格式(蛋白指紋)。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)血液中正常人細(xì)胞、不穩(wěn)定型心絞痛細(xì)胞及急性心肌梗死患者細(xì)胞的蛋白指紋。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。
文檔編號(hào)G01N30/95GK1737567SQ20041005813
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月16日
發(fā)明者許洋, 高春芳 申請(qǐng)人:北京賽爾迪科技開(kāi)發(fā)有限公司