專利名稱：一種多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，死亡率高。腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)使人們對(duì)腫瘤的早期診斷寄予了很大希望，所以腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性與病人的利益密切相關(guān)。
本發(fā)明基于的Luminex xMAP是一個(gè)非常靈活的多功能技術(shù)平臺(tái)。其原理是把微小的乳膠顆粒分別染成不同的熒光色，即熒光編碼微球(Beads)，然后再把針對(duì)不同檢測(cè)物的核酸(互補(bǔ)鏈)或蛋白(如抗原抗體)以共價(jià)方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對(duì)不同檢測(cè)物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測(cè)物(被測(cè)物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等，也可以是PCR產(chǎn)物)。在懸液中的微球與被檢測(cè)物特異性地結(jié)合，并加上熒光標(biāo)記。然后，微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測(cè)物的特異性(定性)；另一束測(cè)定微球上的熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而決定被測(cè)物的量(定量)，所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。
現(xiàn)有技術(shù)中已有多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法，基于的反應(yīng)原理都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的雙抗夾心法，但現(xiàn)有方法中在每一步結(jié)合反應(yīng)完成后都須洗滌以便去除游離的、未結(jié)合的抗原或抗體，因此操作極為繁鎖，且靈敏度和精密度較差。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的操作簡(jiǎn)便，且能夠同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種操作簡(jiǎn)便(無須洗滌)，并且具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)、從而能夠從反應(yīng)到輸出結(jié)果一步完成的多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法及試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法，包括以下步驟(a)將待測(cè)樣品與第一抗體溶液混合，其中所述的第一抗體溶液含有2-50種不同的第一抗體，所述的每一種第一抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物并且偶聯(lián)于不同的微球而形成式I所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，anti1X-bead(I)式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價(jià)鍵；從而使待測(cè)樣品中的腫瘤標(biāo)志物與第一抗體形成“腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有2-50種不同的帶有可檢測(cè)信號(hào)的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物且對(duì)應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對(duì)應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時(shí)結(jié)合于該腫瘤標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2，從而形成“第二抗體-腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；(c)檢測(cè)四元復(fù)合物中不同微球的可檢測(cè)信號(hào)，從而確定待檢測(cè)樣品中各腫瘤標(biāo)志物的存在與否，附加條件是待測(cè)樣品與第一抗體溶液和第二抗體溶液的混合，可依次進(jìn)行，也可同時(shí)進(jìn)行。
在另一優(yōu)選例中，該方法還包括步驟(d)將測(cè)定的可檢測(cè)信號(hào)與質(zhì)控或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待檢測(cè)樣品中各腫瘤標(biāo)志物的存在與否，和/或數(shù)量。
在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)信號(hào)是熒光信號(hào)。
在另一優(yōu)選例中，所述的微球是平均粒徑為2-10μm、且染上不同熒光的聚苯烯微球。
在另一優(yōu)選例中，所述的第一抗體溶液和第二抗體溶液含有針對(duì)以下各組腫瘤標(biāo)志物的第一抗體和第二抗體(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)；(v)總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)。
在另一優(yōu)選例中，所述的第一抗體溶液中，各第一抗體的濃度為1-100ug/ml，在所述的第二抗體溶液中，各第二抗體的濃度為0.1-200ug/ml。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中用Luminex xMAP法進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)多腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，它包括以下組分(a’)第一容器以及裝于該容器中的第一抗體溶液，其中所述的第一抗體溶液含有2-50種不同的第一抗體，所述的每一種第一抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物并且偶聯(lián)于不同的微球而形成式I所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，anti1X-bead(I)式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價(jià)鍵；(b’)第二容器以及裝于該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有2-50種不同的帶有可檢測(cè)信號(hào)的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物且對(duì)應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對(duì)應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時(shí)結(jié)合于該腫瘤標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括(c’)用作質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)液、或質(zhì)控液(或?qū)φ找?。
在另一優(yōu)選例中，所述的第一抗體溶液和第二抗體溶液含有針對(duì)以下各組腫瘤標(biāo)志物的第一抗體和第二抗體(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)；(v)總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)。
在本發(fā)明的第三方面，提供了所述試劑盒的用途，它被用于檢測(cè)體外樣品中是否存在腫瘤標(biāo)志物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，通過控制一抗和二抗的濃度，可以在直接混合而不經(jīng)洗滌的情況下就獲得對(duì)多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果，從而使多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)方法的操作實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)便、快速和有效。
如本文所用，術(shù)語“第一抗體”、“一抗”可互換使用，指可特異性結(jié)合于腫瘤標(biāo)志物的一種抗體。
如本文所用，術(shù)語“第二抗體”、“二抗”可互換使用，指可特異性結(jié)合于腫瘤標(biāo)志物的另一種抗體。對(duì)于同一種腫瘤標(biāo)志物而言，相應(yīng)的第一抗體和第二抗體是不同的，并且可同時(shí)結(jié)合于所述的腫瘤標(biāo)志物的不同表位。
如本文所用，術(shù)語“腫瘤標(biāo)志物”是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。代表性的腫瘤標(biāo)志物包括(但并不限于)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)。
基本原理本發(fā)明的基本原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的雙抗夾心法。常規(guī)的做法是將一抗固定于固相載體，然后一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)有酶的二抗反應(yīng)，洗滌，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。
本發(fā)明方法中，充分利用了一抗固定在不同流動(dòng)微球(Beads)的特點(diǎn)，同時(shí)優(yōu)化藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的二抗的濃度，將交聯(lián)了一抗的微球溶液與血清樣本或抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液、PE標(biāo)記的二抗溶液依次或同時(shí)一并加入反應(yīng)容器中，從而發(fā)生以下反應(yīng)①微球上的一抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原(即腫瘤標(biāo)志物抗原)結(jié)合，形成“腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物，②二抗與血清或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液中相應(yīng)的抗原(即腫瘤標(biāo)志物抗原)結(jié)合，最終形成“第二抗體-腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物(包括微球交聯(lián)的一抗-血清相應(yīng)抗原-PE標(biāo)記的復(fù)合物或微球交聯(lián)的一抗-標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品液的抗原-PE標(biāo)記的復(fù)合物)，反應(yīng)過程中不須離心洗滌，在液相中即可通過LuminexxMAP檢測(cè)復(fù)合物的熒光，達(dá)到從反應(yīng)到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在Luminex檢測(cè)儀上，這些微球被微量液體傳送系統(tǒng)排成單列，通過兩束激光，一束判定微球的編碼從而決定被測(cè)腫瘤標(biāo)志物的種類；另一束測(cè)定微球上PE的熒光強(qiáng)度，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出被測(cè)腫瘤標(biāo)志物的含量。
關(guān)于Luminex xMAP的技術(shù)平臺(tái)詳細(xì)資料，請(qǐng)參見產(chǎn)品說明書或文獻(xiàn)，(1)Cancer Chemotherapy and Pharmacology，51321-327，(2)Journal of/mmunological Methods.22741-52。
第一抗體-微球的二元復(fù)合物本發(fā)明的第一抗體-微球的二元復(fù)合物具有式(I)結(jié)構(gòu)anti1X-bead(I)式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價(jià)鍵；一抗與微球的偶連針對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物抗原的一抗(anti1X，X代表腫瘤標(biāo)志物抗原)與微球共價(jià)交聯(lián)的詳細(xì)操作程序可用常規(guī)方法，例如按照Luminex公司的產(chǎn)品說明書或網(wǎng)站www.luminexcorp.com中所述的方法進(jìn)行偶連，從而得到不同微球與相應(yīng)一抗形成偶連物anti1X-Beads。
分別取針對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物的anti1X-Beads，按一定比例混合就可得到第一抗體溶液(簡(jiǎn)稱為A液)。
二抗的標(biāo)記雖然二抗可用各種本領(lǐng)域已知的可檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記。然而，優(yōu)選的是用熒光信號(hào)進(jìn)行標(biāo)記，尤其是通過生物素-親和素連接方式標(biāo)記PE。
在一優(yōu)選例中，二抗的生物素(Biotin)標(biāo)記方法如下分別取針對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物抗原的二抗(anti2X，X代表腫瘤標(biāo)志物抗原)透析純化后加入生物素二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光反應(yīng)，透析去除未反應(yīng)的生物素，保存?zhèn)溆谩?br> 分別取針對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物抗原的生物素標(biāo)記的anti2X，按比例混合，加入親和素(Streptavidin)標(biāo)記的PE，使生物素與Streptavidin結(jié)合，生成帶熒光素標(biāo)記的第二抗體(即PE-anti2X，其中PE表示藻紅蛋白)，得到第二抗體溶液(簡(jiǎn)稱為C液)。
質(zhì)控或標(biāo)準(zhǔn)為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測(cè)過程中設(shè)置質(zhì)控。此外，為了獲得定量結(jié)果，可以在檢測(cè)過程中設(shè)置含已知濃度的多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品。
例如，抗原標(biāo)準(zhǔn)(STDn，n＝0～5)和質(zhì)控品(質(zhì)控1、質(zhì)控2)溶液的配制可按下表配制表1混合抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品溶液配制表

表中第1列為不同的腫瘤標(biāo)志物，STD0表示該標(biāo)準(zhǔn)溶液中的所有腫瘤標(biāo)志物的濃度均為0，為標(biāo)準(zhǔn)曲線的起始點(diǎn)；STD1表示該標(biāo)準(zhǔn)溶液中的不同腫瘤標(biāo)志物的濃度分別為C1-1、C2-1、C3-1……C40-1，為標(biāo)準(zhǔn)曲線的第2點(diǎn)；依此類推STD2、STD3、STD4、STD5的含義；質(zhì)控1表示該標(biāo)準(zhǔn)溶液中的不同腫瘤標(biāo)志物的濃度分別為C1-6、C2-6、C3-6……C40-6，介于STD0和STD5之間，為內(nèi)部質(zhì)控點(diǎn)；質(zhì)控2表示該標(biāo)準(zhǔn)溶液中的不同腫瘤標(biāo)志物的濃度分別為C1-7、C2-7、C3-7………C40-7，介于STD0和STD5之間，為另1內(nèi)部質(zhì)控點(diǎn)。STD0～STD5及質(zhì)控1和質(zhì)控2構(gòu)成質(zhì)控液(檢測(cè)為B液)。
將上述的第一抗體溶液、質(zhì)控液和第二抗體溶液(即A、B和C液)依次或同時(shí)混勻，然后充分反應(yīng)(如在37±5℃反應(yīng)10-100min)，隨后在luminex100上讀數(shù)，即可得到多條標(biāo)準(zhǔn)曲線(具體數(shù)目由腫瘤標(biāo)志物組合中不同的腫瘤標(biāo)志物數(shù)目決定)。
腫瘤標(biāo)志物的組合本發(fā)明人經(jīng)過多年實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，由于眾多腫瘤標(biāo)志物的特性各不相同，因此，為了同時(shí)獲得較佳的檢測(cè)結(jié)果，宜對(duì)各眾多腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行組合。一種優(yōu)選的組合情況如下(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)；(v)總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)。
對(duì)應(yīng)于各組腫瘤標(biāo)志物，第一抗體溶液、第二抗體溶液和質(zhì)控液也含有相應(yīng)的一抗、二抗或腫瘤標(biāo)志物。
例如，當(dāng)待檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物是甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)時(shí)；其對(duì)應(yīng)的A液為anti1AFP-beads、anti1CEA-beads、anti1CA125-beads、anti1CA19-9-beads、anti1PSA-beads、anti1f-PSA-beads、anti1NSE-beads、anti1CA242-beads、anti1CA15-3-beads、anti1β-HCG-beads組成的混合液；其對(duì)應(yīng)的B液為標(biāo)準(zhǔn)液0(STD0)，其中不含任何腫瘤標(biāo)志物；標(biāo)準(zhǔn)液1-5(STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)，含有不同已知濃度的上述10種腫瘤標(biāo)志物抗原；質(zhì)控品液1(質(zhì)控1)，含有上述10種腫瘤標(biāo)志物抗原、質(zhì)控品液2(質(zhì)控2)，含有上述10種腫瘤標(biāo)志物抗原；其對(duì)應(yīng)的C液為PE-anti2APEP、PE-anti2CEA、PE-anti2CA125、PE-anti2CA19-9、PE-anti2PSA、PE-anti2PE-PSA、PE-anti2NSE、PE-anti2CA242、PE-anti2CA15-3、PE-anti2β-HCG組成的混合液。
當(dāng)腫瘤標(biāo)志物為其他組合時(shí)，可依此類推。
樣品的檢測(cè)可用本發(fā)明方法檢測(cè)的樣品沒有特別限制，可以是任何含有腫瘤標(biāo)志物的樣品，代表性的例子包括血清樣本、尿液樣本、唾液樣本等。優(yōu)選的樣品是血清樣品。
在檢測(cè)時(shí)，可將A液、人血清樣本和C液依次或同時(shí)混勻，然后充分反應(yīng)(如在37±5℃反應(yīng)10-100min)，隨后在Luminex100上讀數(shù)，根據(jù)各腫瘤標(biāo)志物的閾值判斷其是否存在，也可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出某個(gè)或某幾個(gè)腫瘤標(biāo)志物的濃度。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于一次實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫綐悠范囗?xiàng)指標(biāo)的定性定量信息，靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，具有較寬的線性范圍且操作簡(jiǎn)單。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例材料抗原和抗體來源

微球(Beads)購自美國(guó)Luminex公司，規(guī)格為5.0μm，微球表面為-COOH修飾，其他常規(guī)試劑為市售品。
實(shí)施例110種腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)1.準(zhǔn)備1.1 一抗預(yù)先去除含氨基小分子和雜蛋白(透析或過層析柱)，測(cè)量其濃度。
1.2 在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-hydroxysulfosuccini-mide(NHSS)，備用(防潮)。
1.3 在1.5ml聚丙烯離心管中，精確稱取5mg左右N-ethyl-N′(3-dimethylainopropyl)-carbodiimide(EDC)，備用(防潮)。
2.微球(Beads)活化2.1 微球原液旋渦混旋儀混懸20秒，移取200μL微球(相當(dāng)于2.5×106微球)于1.5ml聚丙烯離心管中。
2.2 15000rpm離心2分鐘(設(shè)置3分鐘)，移去上清液。
2.3 加入100μL蒸餾水，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.4 重復(fù)2.3。
2.5 加入80μL 0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH 6.2，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.6 用蒸餾水將(NHSS)稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.7 取10μL 50mg/ml(NHSS)加到Beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.8 用蒸餾水將EDC稀釋至50mg/ml。(現(xiàn)配現(xiàn)用)2.9 取10μL 50mg/ml EDC加到Beads溶液中，旋渦混旋儀混懸20秒。
2.10 避光、37℃孵育20分鐘。
2.11 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.12 加入250μL 50mmol/L 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)(MES)pH5.0。
2.13 15000rpm離心2分鐘，移去上清液。
2.14 重復(fù)2.12，2.13，馬上進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。
3.交聯(lián)、封閉和儲(chǔ)存3.1 加20μg已處理的一抗到已活化的Beads中，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.2 避光、37℃反應(yīng)2小時(shí)，每十五分鐘混勻一次。
3.3 加入1ml PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液(PBS-TBN的組成為10mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液、0.02％吐溫20、1mg/ml的小牛血清白蛋白和0.05％疊氮鈉)。
3.4 加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒，15000rpm離心2分鐘。移去上清液。
3.5 加入500μL PBS-TBN，旋渦混旋儀混懸20秒。
3.6 2-8℃避光保存。
4.二抗(anti2X)的生物素標(biāo)記4.1二抗預(yù)處理

4.2 生物素標(biāo)記反應(yīng)取上述預(yù)處理的二抗25μL，加入25μL的1mg/ml NHSS-biotin DMSO溶液，混勻，4℃冰箱避光反應(yīng)2小時(shí)。
5.混合抗原標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品(B液)的配制

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
6.A液的配制取10種不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1PEree-PSA-Beads，anti1total-PSA-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA242-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液，按4×105個(gè)/種混合，加在pH7.4 PBS中，體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 7.混合二抗-PE混合物(℃液)配制分別取標(biāo)記好biotin的PEree-PSA，total-PSA，NSE，CA242，CA19-9，CA125，β-HCG，CA15-3，APEP，CEA二抗加入pH7.4 PBS中，每種二抗終濃度為5μg/ml，同時(shí)加入PE總濃度為60μg/ml，混合二抗-PE混合物總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.病人血清消化道腫瘤標(biāo)志物含量檢測(cè)8.1 收集病人血樣10份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
8.2 分別加入A液于96孔酶標(biāo)板，50μl/孔；然后加入標(biāo)準(zhǔn)品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、質(zhì)控品(Contol1、Contol2)、血清樣品1-9號(hào)，5μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋渦混旋儀上充分混勻，放入37℃搖床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻在Luminex100上讀數(shù)。
8.4 檢測(cè)結(jié)果見下表

注表格中粗斜體部分為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，其他為樣本檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果表明，用本發(fā)明方法可同時(shí)獲得多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的定量測(cè)定結(jié)果，例如第7號(hào)樣品中存在大量的腫瘤標(biāo)志物t-PSA，從而可為臨床診斷提供輔助性的參考指標(biāo)。
實(shí)施例26種腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)1～4操作步驟同實(shí)施例1。
5.混合抗原標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品(B液)的配制

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
6.A液的配制取6種不同Beads的下列anti1CA19-9-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CA72-4-Beads，anti1CA50-Beads，anti1APEP-Beads，anti1CEA-Beads溶液按4×105個(gè)/種混合，加在pH7.4 PBS中，體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分別取標(biāo)記好biotin的CA19-9，CA125，CA72-4，CA50，APEP，CEA二抗加入pH7.4 PBS中每種二抗終濃度為5μg/ml，同時(shí)加入PE總濃度為60μg/ml，混合二抗-PE混合物總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.病人血清消化道腫瘤標(biāo)志物含量檢測(cè)8.1 收集病人血樣6份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
8.2 分別加入A液于96孔酶標(biāo)板，50μL/孔；然后加入標(biāo)準(zhǔn)品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、質(zhì)控品(Contol1、Contol2)、血清樣品1-6號(hào)，50μL/孔；再加入C液，50μL/孔。在旋渦混旋儀上充分混勻，放入37℃搖床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻在Luminex100上讀數(shù)。
8.4 檢測(cè)結(jié)果見下表

注表格中粗斜體部分為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，其他為樣本檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果表明，用本發(fā)明方法可同時(shí)獲得多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的定量測(cè)定結(jié)果，例如第7號(hào)樣品中存在大量的腫瘤標(biāo)志物APEP，從而可為臨床診斷提供輔助性的參考指標(biāo)。
實(shí)施例37種腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)1～4操作步驟同實(shí)施例1。
5.混合抗原標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品(B液)的配制

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
6.A液的配制取7種不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1SCCA-Beads，anti1CYPERA21-1-Beads，anti1NSE-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CEA-Beads，anti1CA50-Beads溶液按4×105個(gè)/種混合，加在pH7.4 PBS中，體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分別取標(biāo)記好biotin的CA50，CYPERA21-1，SCCA，NSE，CA125，β-HCG，CEA二抗加入pH7.4 PBS中每種二抗終濃度為5μg/ml，同時(shí)加入PE總濃度為60μg/ml，混合二抗-PE混合物總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.病人血清消化道腫瘤標(biāo)志物含量檢測(cè)8.1 收集病人血樣9份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
8.2 分別加入A液于96孔酶標(biāo)板，50ul/孔；然后加入標(biāo)準(zhǔn)品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、質(zhì)控品(Contol1、Contol2)、血清樣品1-7號(hào)，20μl/孔；再加入混合二抗-PE混合物(C液)，50μl/孔。在旋渦混旋儀上充分混勻，放入37℃搖床孵育40min。
8.3 孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻在Luminex100上讀數(shù)。
8.4 檢測(cè)結(jié)果見下表

注表格中粗斜體部分為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，其他為樣本檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果表明，用本發(fā)明方法可同時(shí)獲得多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的定量測(cè)定結(jié)果，例如第11號(hào)樣品中存在大量的腫瘤標(biāo)志物SCCA，從而可為臨床診斷提供輔助性的參考指標(biāo)。
實(shí)施例45種腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)1～4操作步驟同實(shí)施例1。
5.混合抗原標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品(B液)的配制

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液按上表配制B液。
6.A液的配制取5種不同Beads的下列anti1β-HCG-Beads，anti1SCCA-Beads，anti1CA15-3-Beads，anti1CA125-Beads，anti1CEA-Beads溶液按4×105個(gè)/種混合，加在pH7.4 PBS中，體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 7.混合二抗-PE混合物(C液)配制分別取標(biāo)記好biotin的SCCA，CA15-3，CA125，β-HCG，CEA二抗加入PH7.4PBS中每種二抗終濃度為5μg/ml，同時(shí)加入PE總濃度為60μg/ml，混合二抗-PE混合物總體積為5ml，4℃避光保存?zhèn)溆谩?br> 8.病人血清消化道腫瘤標(biāo)志物含量檢測(cè)8.1 收集病人血樣6份2ml/份，5000rpm×5min，取上清，備用。
8.2 分別加入A液于96孔酶標(biāo)板，50μl/孔；然后加入標(biāo)準(zhǔn)品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5)、質(zhì)控品(Contol1、Contol2)、血清樣品1-6號(hào)，20μl/孔；再加入C液，50μl/孔。在旋渦混旋儀上充分混勻，放入37℃搖床孵育40min.
8.3 孵育完成后于旋渦混旋儀上充分混勻在Luminex100上讀數(shù)。
8.4檢測(cè)結(jié)果見下表

注表格中粗斜體部分為標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果，其他為樣本檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)果表明，用本發(fā)明方法可同時(shí)獲得多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的定量測(cè)定結(jié)果，例如第8號(hào)樣品中存在大量的腫瘤標(biāo)志物CA153，從而可為臨床診斷提供輔助性的參考指標(biāo)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將待測(cè)樣品與第一抗體溶液混合，其中所述的第一抗體溶液含有2-50種不同的第一抗體，所述的每一種第一抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物并且偶聯(lián)于不同的微球而形成式I所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，anti1X-bead (I)式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價(jià)鍵；從而使待測(cè)樣品中的腫瘤標(biāo)志物與第一抗體形成“腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”三元復(fù)合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，其中所述的第二抗體溶液含有2-50種不同的帶有可檢測(cè)信號(hào)的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物且對(duì)應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對(duì)應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時(shí)結(jié)合于該腫瘤標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2，從而形成“第二抗體-腫瘤標(biāo)志物-第一抗體-微球”四元復(fù)合物；(c)檢測(cè)四元復(fù)合物中不同微球的可檢測(cè)信號(hào)，從而確定待檢測(cè)樣品中各腫瘤標(biāo)志物的存在與否，附加條件是待測(cè)樣品與第一抗體溶液和第二抗體溶液的混合，可依次進(jìn)行，也可同時(shí)進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(d)將測(cè)定的可檢測(cè)信號(hào)與質(zhì)控或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而確定待檢測(cè)樣品中各腫瘤標(biāo)志物的存在與否，和/或數(shù)量。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測(cè)信號(hào)是熒光信號(hào)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微球是平均粒徑為2-10μm、且染上不同熒光的聚苯烯微球。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗體溶液和第二抗體溶液含有針對(duì)以下各組腫瘤標(biāo)志物的第一抗體和第二抗體(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)；(v)總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗體溶液中，各第一抗體的濃度為1-100ug/ml，在所述的第二抗體溶液中，各第二抗體的濃度為0.1-200ug/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中用Luminex xMAP法進(jìn)行檢測(cè)。
8.一種用于檢測(cè)多腫瘤標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，它包括以下組分(a’)第一容器以及裝于該容器中的第一抗體溶液，其中所述的第一抗體溶液含有2-50種不同的第一抗體，所述的每一種第一抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物并且偶聯(lián)于不同的微球而形成式I所示的第一抗體-微球的二元復(fù)合物，anti1X-bead(I)式中，X表示腫瘤標(biāo)志物，anti1X表示抗腫瘤標(biāo)志物X的第一抗體，bead表示微球，-表示第一抗體與微球之間的共價(jià)鍵；(b’)第二容器以及裝于該容器中的第二抗體溶液，其中所述的第二抗體溶液含有2-50種不同的帶有可檢測(cè)信號(hào)的第二抗體，所述的每一種第二抗體分別抗一種腫瘤標(biāo)志物且對(duì)應(yīng)于第一抗體溶液中相應(yīng)的第一抗體，而且對(duì)應(yīng)的第二抗體與第一抗體可同時(shí)結(jié)合于該腫瘤標(biāo)志物且第一抗體與第二抗體的摩爾比為1∶0.1-1∶2。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括(c’)用作質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)液、或質(zhì)控液。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的第一抗體溶液和第二抗體溶液含有針對(duì)以下各組腫瘤標(biāo)志物的第一抗體和第二抗體(i)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)；(ii)甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、糖抗原72-4(CA72-4)、糖抗原50(CA50)；(iii)胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、糖抗原50(CA50)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)、CYFRA21-1；(iv)癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、癌抗原(CA15-3)、人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)；(v)總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)。
10.如權(quán)利要求7所述試劑盒的用途，其特征在于，用于檢測(cè)體外樣品中是否存在腫瘤標(biāo)志物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多腫瘤標(biāo)志物并行檢測(cè)的方法，它包括步驟(a)將待測(cè)樣品與第一抗體溶液混合，形成“腫瘤標(biāo)志物－第一抗體－微球”三元復(fù)合物；(b)將步驟(a)形成的溶液與第二抗體溶液混合，形成“第二抗體－腫瘤標(biāo)志物－第一抗體－微球”四元復(fù)合物；(c)檢測(cè)四元復(fù)合物中不同微球的可檢測(cè)信號(hào)，從而確定待檢測(cè)樣品中各腫瘤標(biāo)志物的存在與否。本發(fā)明方法可簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地同時(shí)定性和定量檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物。
文檔編號(hào)G01N33/533GK1743849SQ20041005425
公開日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月3日
發(fā)明者周雪雷, 羅朝領(lǐng), 蔡勇華, 茅柳娟 申請(qǐng)人:上海透景生命科技有限公司