用于分析血液以檢測(cè)與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年03月15日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第13/833008號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容以引用方式全文并入于此作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及用于分析血液以檢測(cè)與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的方法。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病是阿爾茨海默氏病。
【背景技術(shù)】
[0004] 阿爾茨海默氏病（AD)是老年人口癡呆的最常見原因，全世界超過(guò)3500萬(wàn)人受到 影響，且若不開發(fā)出有效的療法，到2050年受影響人口預(yù)計(jì)將上升至1億1500萬(wàn)（Barnes 和Yaffe2011)。這種年齡相關(guān)的神經(jīng)變性病癥以淀粉樣蛋白β(Αβ)(包括腦中的老年斑 塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和突觸丟失）為病理特征（Selkoe2001)。雖然AD是一種變性病癥是 明確的，但免疫系統(tǒng)的作用也是突出的（由Britschgi和Wyss-Coray綜述，2007)。在AD 中，有毒的Αβ肽聚集成更高分子量的組裝體，且不僅在細(xì)胞外間隙，也在腦中的血管壁上 蓄積（delaTorre2002;Deane與Zlokovic2007)，增加它們的通透性（Nagababu等人， 2009)，并促進(jìn)將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至腦中（Farkas等人，2003)。巨噬細(xì)胞/小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 吸收Αβ，且為Αβ清除的關(guān)鍵因素（Majumdar等人，2008;Mildner等人，2007;Simard等 人，2006)。嗜中性粒細(xì)胞也通過(guò)血腦屏障破壞滲入AD腦中（Stamatovic等人，2005)。
[0005] 盡管付出了相當(dāng)大的努力，但是既沒(méi)有對(duì)于AD的治療，甚至也沒(méi)有用于可靠地建 立確定的診斷的臨床試驗(yàn)；腦組織的死后檢查是目前確認(rèn)AD診斷的唯一確定方法。實(shí)際 上，目前的診斷標(biāo)準(zhǔn)將"可能的AD"作為具有最高確定度的類別（McKhann等人，2011)，這反 映出死后診斷的局限。簡(jiǎn)單和可靠的試驗(yàn)基于下述幾個(gè)原因?qū)?huì)是重要的：如果入組的個(gè) 體具有明確的診斷，治療性試驗(yàn)將會(huì)更可靠，使得能夠研究更多的同質(zhì)群體。一旦這個(gè)成為 可能，較輕的癡呆（輕度認(rèn)知缺損）病例（其還未達(dá)到對(duì)于AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)），能被正確地分 類為其他原因（例如，血管的）的早期AD，使合適的治療能得到更好的預(yù)測(cè)及建立。
[0006] 從人口健康角度，考慮到AD腦中的生物化學(xué)變化（例如淀粉樣蛋白沉積）開始于 出現(xiàn)臨床癥狀的幾年前到也許數(shù)十年前，當(dāng)可行時(shí)，檢測(cè)早期臨床前疾病并建立預(yù)防措施 是可能的。因此，隨著發(fā)達(dá)國(guó)家準(zhǔn)備開始應(yīng)對(duì)AD不可避免的流行，對(duì)于AD便宜的、非侵入 性的及快速的檢驗(yàn)是至關(guān)重要的。
[0007] 對(duì)于發(fā)展生物標(biāo)記以支持AD診斷，人們已做出了大量的努力。在血液中，焦點(diǎn)集 中于測(cè)定血漿中的Αβ水平。這并未被證實(shí)是可靠的，因?yàn)棣ˇ?0、Αβ42的水平或二者的 比率不能可靠地區(qū)分健康對(duì)照和AD患者（Thambisety與Lovestone2010)。其他方式包括 血漿的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，但是它是昂貴的、復(fù)雜的，無(wú)法經(jīng)受高通量分析的考驗(yàn)且仍需實(shí)驗(yàn) 的。Αβ的CSF分析及（磷酸化的）微觀相關(guān)（tau)水平具有更強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值（vanRossum 等人，2012 ;Senanaron等人，2012)，但與血液相比其是侵入性的，不太可能成為正式研究 試驗(yàn)外的常規(guī)方法。成像標(biāo)記〇\?14]\?1、？06^^1'、淀粉樣蛋白^^1')(拓〇1^2012 ;]\&^811(^ 和Imabayashi2012)全都更昂貴，不是普遍可用的，且要么是非特異的（MRI)要么是高度 專業(yè)化的，只在幾個(gè)中樞（center)可用（例如，淀粉樣蛋白-PET)。因此，用于診斷AD和將 發(fā)展為AD的AD相關(guān)的輕度認(rèn)知缺損的簡(jiǎn)單且便宜的血液檢測(cè)是高度值得期望的。人血小 樣品中進(jìn)行檢測(cè)的能力將是對(duì)目前方法的巨大改進(jìn)，并為發(fā)展簡(jiǎn)單、快速高通量篩選方法 鋪平道路。這樣的方法也適用于于其他以異常蛋白質(zhì)聚集為特征的疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明人描述了用于分析血液以檢測(cè)與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)疾病的新方法。如實(shí)施 例中所述，發(fā)明人已確認(rèn)在非血漿血液成分（例如循環(huán)血白細(xì)胞和血小板）中檢測(cè)與疾病 相關(guān)的致病蛋白質(zhì)聚集物是可能的，所述疾病包括但不限于：阿爾茨海默氏病、牛海綿樣腦 病（BSE)和外傷性腦損傷。此外，帶有結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集物的熒光探針的波譜熒光技 術(shù)的使用已被證明能夠容易地區(qū)分健康對(duì)照的血樣和患有與異常蛋白聚集相關(guān)的疾病的 個(gè)體的血樣。因而，以結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集物的熒光探針對(duì)非血漿血液成分進(jìn)行的波譜 分析使中樞神經(jīng)中通常與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的檢出成為可能。使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模 型，也表明在此所述的方法能夠在腦樣品中觀察到病狀的同時(shí)，在疾病進(jìn)展時(shí)盡早使用血 樣識(shí)別患有阿爾茨海默氏病的個(gè)體。
[0009] 因此，本公開涉及一種檢測(cè)個(gè)體中與異常蛋白聚集相關(guān)的疾病的方法。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述方法包括（a)將來(lái)自個(gè)體的非血漿血液成分與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的 探針接觸，及（b)檢測(cè)結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針，其中所述非血漿血液成分中致病 蛋白質(zhì)聚集體的存在表明所述個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。
[0010] 本公開也涉及一種用于檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的血樣中的致病蛋白質(zhì)聚集體的體外方法。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括（a)將來(lái)自血樣的非血液成分與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集 體的探針接觸，及（b)檢測(cè)所述結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在此所述的方法包括從個(gè)體中獲取血樣以及先從所述血樣中 分離出一種或多種非血漿血液成分，再將所述非血漿血液成分與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體 的探針接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非血漿血液成分選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、微泡和血小板。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非血漿血液成分是白細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此所述的 方法包括從個(gè)體中獲取血樣，以及先從所述血樣中分離血沉棕黃色層，再將所述血沉棕黃 層與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接觸。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在此所述的方法包括從個(gè)體中獲取血樣，以及先從所述血樣 中分離白細(xì)胞，再將所述白細(xì)胞與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接觸。
[0013] 在另一實(shí)施方案中，在此所述的方法包括從個(gè)體中獲取包含血沉棕黃層的血樣， 再將所述血沉棕黃層的白細(xì)胞與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接觸。
[0014] 在另一實(shí)施方案中，所述探針是熒光探針，任選構(gòu)象敏感的探針。任選地，所述 探針是剛果紅、剛果紅衍生物、K114、X34、BSB、FSB、頂SB、柯胺-G(Chrysamine-G)、甲氧 基-X34、甲氧基-X04、硫磺素-T、硫磺素-S、匹茲堡化合物B(PittsburghcompoundB)、噻 嗪紅R、金胺-0、P-FTAA或與p-FTAA有關(guān)的發(fā)光共輒聚噻吩（LCP)或發(fā)光共輒寡聚噻吩 (LC0)〇
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針包含選擇性地結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的抗體。任 選地，所述抗體由以可檢測(cè)的標(biāo)記物（例如熒光標(biāo)記物）標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探 針是抗淀粉樣蛋白抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針是抗-微管相關(guān)或抗-高度磷 酸化的微管相關(guān)抗體。
[0016] 在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針包括檢測(cè)結(jié)合至致病蛋 白質(zhì)聚集體的探針的熒光或吸光度。
[0017] 在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)所述探針的熒光或吸光度包括檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度、產(chǎn)生 熒光發(fā)射光譜和/或產(chǎn)生吸收光譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的 探針的熒光包括檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)下的熒光信號(hào)的強(qiáng)度或兩個(gè)多個(gè)波長(zhǎng)下結(jié)合至致 病蛋白質(zhì)聚集體的探針的吸光度。
[0018] 在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含將與非血漿血液成分接觸的探針的熒光 或吸光度和與參比非血漿血液成分接觸的參比探針的熒光或吸光度比較。任選地，所述參 比非血漿血液成分來(lái)自于患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的參比個(gè)體，個(gè)體非血漿血液 成分的熒光或吸光度與參比非血漿血液成分的熒光或吸光度間的一致性表明了所述個(gè)體 患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)所述探針的熒光或吸光度包括檢測(cè)兩個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)下 的熒光發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度，產(chǎn)生包含兩個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)下的測(cè)量的熒光發(fā)射光譜，或產(chǎn)生包含 兩個(gè)或更多個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)量的吸收光譜。
[0020] 在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述熒光發(fā)射光譜與一種或多種參比 熒光發(fā)射光譜比較。任選地，至少一個(gè)參比發(fā)射光譜是來(lái)自患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的 疾病的參比個(gè)體的參比非血漿血液成分的熒光發(fā)射光譜。所述熒光發(fā)射光譜和至少一個(gè)參 比熒光發(fā)射光譜間的一致性表明了所述個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病?？蛇x擇 地，至少一個(gè)參比發(fā)射光譜是來(lái)自于健康對(duì)照參比個(gè)體（例如未患有與異常蛋白質(zhì)聚集相 關(guān)的疾病的個(gè)體）的參比非血漿血液成分的熒光發(fā)射光譜，所述熒光發(fā)射光譜與至少一個(gè) 參比熒光光譜間的一致性表明了所述個(gè)體未患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。任選地， 所述參比發(fā)射光譜包含非神經(jīng)性疾病對(duì)照。
[0021] 在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述吸收光譜與一個(gè)或多種參比吸收 光譜比較。任選地，至少一個(gè)參比吸收光譜是來(lái)自患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的參 比個(gè)體的參比非血漿血液成分的吸收光譜，所述吸收光譜與至少一個(gè)參比吸收光譜間的一 致性表明了所述個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病?？蛇x擇地，至少一個(gè)參比吸收光 譜是來(lái)自健康對(duì)照參比個(gè)體（例如未患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的個(gè)體）的參比非 血漿血液成分的吸收光譜，所述吸收光譜與至少一個(gè)參比吸收光譜間的一致性表明了所述 個(gè)體未患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。
[0022] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解在一些實(shí)施方案中，個(gè)體非血漿血液成分的熒光光譜 或吸收光譜的熒光或吸光度與參比非血衆(zhòng)血液成分的熒光光譜或吸收光譜的熒光或吸光 度的差異或相似點(diǎn)可表明所述個(gè)體患有或未患有與異常蛋白聚集相關(guān)的疾病，這取決于所 述參比非血漿血液成分的疾病狀態(tài)。相似地，個(gè)體非血漿血液成分的熒光光譜或吸收光譜 與參比非血漿血液成分的熒光光譜或吸收光譜的差異或相似點(diǎn)可表明所述樣品具有致病 蛋白質(zhì)聚集體或不具有致病蛋白質(zhì)聚集體，這取決于所述參比非血漿血樣是否具有致病蛋 白質(zhì)聚集體。
[0023] 在另一實(shí)施方案中，所述方法包括將熒光發(fā)射光譜或吸收光譜與多個(gè)參比光譜相 比較。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用兩個(gè)或更多個(gè)不同的激發(fā)波長(zhǎng)產(chǎn)生兩個(gè)或更多個(gè)熒光 發(fā)射光譜，并將其與使用相同或相似的激發(fā)波長(zhǎng)所產(chǎn)生的兩個(gè)或更多個(gè)參比光譜比較。
[0024] 在另一實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括：
[0025] (a)產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜或吸收光譜；
[0026] (b)進(jìn)行光譜分解以確定對(duì)熒光發(fā)射光譜或吸收光譜有貢獻(xiàn)的單個(gè)基礎(chǔ)光譜的權(quán) 重；并
[0027] (c)使用所述權(quán)重確定個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的可能性或使用所 述權(quán)重確定樣品具有致病蛋白質(zhì)聚集體的可能性。
[0028] 在另一實(shí)施方案中，所述單個(gè)基礎(chǔ)光譜確定于（a)已知患有與異常蛋白質(zhì)聚集相 關(guān)的疾病的個(gè)體的樣品，（b)健康對(duì)照個(gè)體的樣品和/或（c)未與探針接觸的樣品。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述樣品是已知具有或不具有特定的致病蛋白質(zhì)聚集體的非血漿血液成分。
[0029] 可使用本領(lǐng)域已知的不同的方法進(jìn)行光譜分解，以確定單個(gè)基礎(chǔ)光譜的權(quán)重。例 如，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用線性代數(shù)法進(jìn)行光譜分解。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用非線性代 數(shù)法進(jìn)行光譜分解。在另一實(shí)施方案中，使用Levenberg-Marquardt算法進(jìn)行光譜分解。
[0030] 也可使用本領(lǐng)域已知的不同的方法將熒光發(fā)射光譜或吸收光譜與一種或多種參 比波譜進(jìn)行比較，以確定所述波譜間的一致性，或確定所述波譜間的差異或相似點(diǎn)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，合適的方法產(chǎn)生波譜間相似處或差異的定量測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在此所 描述的方法進(jìn)一步包括生成統(tǒng)計(jì)測(cè)量或可能性評(píng)分，即波譜或波譜集表明與異常蛋白質(zhì)聚 集相關(guān)的疾病的存在或致病蛋白質(zhì)聚集體的存在。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用機(jī)器學(xué) 習(xí)（machinelearning)、遺傳算法或主成分分析用于比較波譜或波譜集。
[0031] 在另一實(shí)施方案中，所述與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病選自由下述疾病組成的 組：阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏癥、輕度認(rèn)知缺損、大腦淀粉樣血管病、肌病、神 經(jīng)病、腦外傷、額顳癡呆、皮克氏病、多發(fā)性硬化、朊病毒病、唐氏綜合征和ALS。
[0032] 在另一實(shí)施方案中，所述致病蛋白質(zhì)聚集體包括淀粉樣蛋白、任選地為淀粉 樣蛋白、α-突觸核蛋白、亨廷頓蛋白（huntingtin)、微管相關(guān)蛋白（tauprotein)、高度磷 酸化的微管相關(guān)蛋白（pTau)、H元病毒蛋白、αΒ_晶狀體蛋白（CRYAB)、結(jié)蛋白、砸蛋白、肌動(dòng) 蛋白、肌球蛋白和/或超氧化物歧化酶（S0D)。
[0033] 在另一實(shí)施方案中，所述致病蛋白質(zhì)聚集體包括β-淀粉樣蛋白，所述疾病是阿 爾茨海默氏病。
[0034] 在另一實(shí)施方案中，將來(lái)自個(gè)體的白細(xì)胞與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接觸 的步驟在堿性pH下進(jìn)行。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH高于9、高于10或高于11。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH任選地為約10. 5。在另一實(shí)施方案中，將來(lái)自個(gè)體的白細(xì)胞與結(jié) 合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接觸的步驟在酸性pH下進(jìn)行，任選地pH低于6、低于5或低 于4。
[0035] 在另一實(shí)施方案中，在此所描述的方法包括使用多個(gè)不同的激發(fā)波長(zhǎng)產(chǎn)生多個(gè)熒 光測(cè)量值或多個(gè)熒光光譜。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在兩個(gè)或更多個(gè)激發(fā)波 長(zhǎng)下生成兩個(gè)或更多個(gè)熒光發(fā)射光譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在三、四、五、六、 七、八、九、十或多于十個(gè)的激發(fā)波長(zhǎng)下分別生成三、四、五、六、七、八、九、十或高于十個(gè)焚 光發(fā)射光譜。不限制于任何的理論，變化激發(fā)波長(zhǎng)和分析兩個(gè)或更多個(gè)熒光光譜被認(rèn)為增 加用于血液中致病蛋白質(zhì)聚集體檢測(cè)的在此所述方法的靈敏度和/或特異性。
[0036] 在另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)在近紫外區(qū)內(nèi)，任選約200nm至約400nm。 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)為約300nm至約500nm，任選約375nm或約445nm。在 另一實(shí)施方案中，所述激發(fā)波長(zhǎng)與固定半導(dǎo)體激光二極管的標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)一致。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述激發(fā)波長(zhǎng)包括一種或多種選自約375nm、約405nm、約445nm和約457nm的波長(zhǎng)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)在約200nm和2000nm之間。
[0037] 在另一實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量多個(gè)波長(zhǎng)下的熒光或吸光度強(qiáng)度產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜 或吸收光譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)從約400nm至約700nm或從約200nm至約2000nm進(jìn) 行測(cè)量生成波譜。
[0038] 在另一實(shí)施方案中，將結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針的熒光或吸光度歸一化為 細(xì)胞計(jì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針的熒光或吸光度歸一化 為用于測(cè)量熒光或吸光度（例如在光路內(nèi)或成像場(chǎng)內(nèi)）的樣品中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。用于確定細(xì) 胞計(jì)數(shù)的本領(lǐng)域已知的不同方法包括例如通過(guò)使用熒光團(tuán)（例如DR