譜的 權(quán)重。然后使用這些權(quán)重因子以計(jì)算多個(gè)指數(shù)，所述指數(shù)表明了任何一個(gè)源于健康或患病 個(gè)體的樣品的可能性。
[0120] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：
[0121] a.從個(gè)體非血漿血液成分中產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜或吸收光譜；
[0122] b.進(jìn)行光譜分解，以確定貢獻(xiàn)至熒光發(fā)射光譜或吸收光譜的單個(gè)基礎(chǔ)光譜的權(quán) 重；并
[0123]c.使用所述權(quán)重確定所述個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)疾病的可能性。
[0124] 如在此所使用的，術(shù)語"光譜分解"指將單個(gè)基礎(chǔ)光譜從復(fù)合熒光發(fā)射光譜或吸收 光譜中分離的任何方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用Levenberg-Marquardt算法進(jìn)行光譜分 解。在另一實(shí)施方案中，使用線性分離算法進(jìn)行光譜分解。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方案中，從樣品（a)已知患有與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病的個(gè)體， (b)健康對(duì)照個(gè)體和（c)未與探針接觸的樣品中確定單個(gè)基礎(chǔ)光譜。任選地，從非血漿血液 成分（例如白細(xì)胞）中確定單個(gè)基礎(chǔ)光譜。
[0126] 在另一實(shí)施方案中，在此所描述的方法包括使用機(jī)器學(xué)習(xí)、遺傳算法或主成分分 析，比較熒光發(fā)射光譜與吸收光譜與一種或多種參比熒光發(fā)射光譜或參比吸收光譜。例如， 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用代表具有特定疾病狀態(tài)的個(gè)體的非-血漿血液成分的光譜數(shù)據(jù) 集，訓(xùn)練遺傳算法，以便基于非血漿血液成分，任選地與結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的探針接 觸的光譜數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)個(gè)體疾病的狀態(tài)。
[0127] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠容易地使用上述的方法評(píng)估個(gè)體患有與異常蛋白質(zhì)聚 集相關(guān)疾病的個(gè)體的可能性。
[0128] 在另一實(shí)施方案中，非血漿血液成分（例如白細(xì)胞）的樣品的波譜分析可在不同 的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行以檢測(cè)沉淀物成熟的不同，從而預(yù)測(cè)潛在疾病的階段、嚴(yán)重性或進(jìn)展速率。
[0129] 也可使用致病蛋白質(zhì)聚集體抗體來檢測(cè)非血漿血液成分中致病蛋白質(zhì)聚集體的 存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗-β-淀粉樣蛋白抗體，例如6E10、4G8、AB5078P、 12F4、AB9234或OMAB。AB9234和0ΜΑΒ是結(jié)合至β-淀粉樣蛋白低聚體的抗體。
[0130] 雖然上述的方法意在檢測(cè)完整的聚集體，任選滲透的細(xì)胞，但在另一個(gè)實(shí)施方案 中，在溶解的和/或凍干的細(xì)胞中檢測(cè)聚集體。
[0131] 在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含檢測(cè)已知與異常蛋白質(zhì)聚集體相關(guān)的疾 病相關(guān)的額外的蛋白質(zhì)。例如任選地檢測(cè)高度磷酸化微管相關(guān)蛋白、朊病毒蛋白、αΒ_晶 狀體蛋白和α-突觸核蛋白。任選地，使用抗-磷-微管相關(guān)蛋白檢測(cè)高度磷酸化微管相 關(guān)蛋白并使用6Η4抗體檢測(cè)朊病毒蛋白。也可使用與ALS相關(guān)的S0D的致病形式的抗體。
[0132] 本公開也提供用于分析血液以檢測(cè)與異常蛋白質(zhì)聚集體相關(guān)的疾病或用于在血 樣中檢測(cè)或識(shí)別致病蛋白質(zhì)聚集體的存在或類型的試劑盒。
[0133] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含在非-血漿血液成分中檢測(cè)致病蛋白質(zhì)聚集 體存在的探針以及使用說明。
[0134] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述使用說明提供了怎樣進(jìn)行任何在此所描述的方法的說 明。
[0135] 所述探針任選是結(jié)合至致病蛋白質(zhì)聚集體的熒光探針。在另一實(shí)施方案中，所述 探針是構(gòu)象-敏感性熒光探針。用于檢測(cè)淀粉樣肽的構(gòu)象-敏感性熒光探針的具體實(shí)例包 括但不限于：剛果紅、剛果紅衍生物和雙-苯乙烯基苯（如：K114、X34、BSB、FSB、頂SB、柯 胺-G、甲氧基-X34、甲氧基-X04)、硫磺素類似物（硫磺素-T、硫磺素-S、匹茲堡化合物B)、 噻嗪紅R、金胺-0、五聚甲酰噻吩乙酸（P-FTAA)和相關(guān)的發(fā)光共輒聚噻吩（LCP)或發(fā)光共 輒寡聚噻吩（LC0)。
[0136] 在其他的實(shí)施方案中，所述探針是致病蛋白質(zhì)聚集體抗體，例如抗淀粉樣蛋 白抗體，如6Ε10。
[0137] 所述試劑盒用于分析血液以檢測(cè)多種與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病，所述疾病包 括但不限于：阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏癥、輕度認(rèn)知缺損、大腦淀粉樣血管 病、肌病、神經(jīng)病、腦外傷、額顳癡呆、皮克氏病、多發(fā)性硬化、朊病毒病、唐氏綜合征和肌萎 縮側(cè)索硬化。
[0138] 以下非限制性實(shí)施例是本公開的例證： 實(shí)施例
[0139] 實(shí)施例1.使用熒光光譜法從血液中檢測(cè)阿爾茨海默氏病
[0140] 許多神經(jīng)疾病，例如AD、帕金森氏癥、亨廷頓氏病和朊病毒疾病與蛋白質(zhì)從它們的 可溶功能態(tài)至具有高折疊含量的高度有序的纖維組裝體的錯(cuò)折疊和聚集相關(guān)。這些病 理上不相關(guān)的疾病具有的相同點(diǎn)為特異的結(jié)合至經(jīng)典的淀粉樣蛋白探針，剛果紅，因此被 稱為"嗜剛果紅"疾病。特異性地結(jié)合淀粉樣蛋白纖維原的構(gòu)象-敏感性熒光探針已被廣 泛用于蛋白質(zhì)聚集的調(diào)查研究（Styren等人，2000 ;Klunk等人，2002 ;Mathis等人，2002 ; Aslund等人，2009;Nilsson等人，2005;Hammarstrom等人，2010)。一些更新的探針具有 額外的檢測(cè)可溶低聚物類別的性質(zhì)，并基于它們所結(jié)合至的蛋白聚集體改變它們的發(fā)射光 譜，并使它們識(shí)別構(gòu)象的微小的沉積或細(xì)微的改變。
[0141] 先進(jìn)的光譜成像使光譜高度量化的分離成為可能，其包括結(jié)合至不同類型聚集體 的淀粉樣蛋白探針的細(xì)微變化。使用這些技術(shù)，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)AD小鼠模型（Oakley等人， 2006)或人類AD患者的腦和血液中錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)（Αβ或其他）的實(shí)驗(yàn)。在CNS和血液中 研究了以探針Χ-34 (剛果紅衍生物）標(biāo)記的蛋白質(zhì)聚集體的光譜特征。
[0142] 從以Χ-34標(biāo)記的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦斑塊中獲取了強(qiáng)和特異的信號(hào)，并可在單一的 老年斑塊中區(qū)分"成熟"和聚集的多種狀態(tài)（圖1)。也對(duì)人類AD患者的腦施用這種策略。 在此，能在石蠟包埋的切片中，從神經(jīng)元纖維纏結(jié)和自體熒光脂褐質(zhì)區(qū)分淀粉樣蛋白斑塊。 β-淀粉樣蛋白特征與AD小鼠腦中的那些非常相似。這些結(jié)果一起表明所述方法能夠進(jìn)行 蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊/聚集的靈敏和潛在AD特異性檢測(cè)。
[0143] 具有抗Αβ抗體6Ε10的免疫染色的AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦顯示出具有6Ε10免疫-陽 性典型形態(tài)的老年斑塊（圖2a)。此外，也在血管周圍觀察到6Ε10-陽性血細(xì)胞（圖2a和 b)，顯示出細(xì)胞攝取的物質(zhì)與所述斑塊中發(fā)現(xiàn)的非常相似。不被理論所限制，認(rèn)為循環(huán)的白 細(xì)胞充當(dāng)"哨兵"，在通過患病的腦后，作為它們經(jīng)歷的"記憶"，所述循環(huán)的白細(xì)胞具有運(yùn)輸 錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的能力。
[0144] 然而分析死后的腦是AD診斷的事實(shí)標(biāo)準(zhǔn)，這是非常不現(xiàn)實(shí)的。因此需要尋求非侵 入性的技術(shù)。支持白細(xì)胞充當(dāng)"循環(huán)哨兵"的假設(shè)，AD小鼠血液中許多這樣的細(xì)胞對(duì)X-34 呈強(qiáng)陽性，具有與大腦斑塊中的那些非常相似的光譜特征，表明可在血液中檢測(cè)相似的"類AD病狀"（圖3d)。這些陽性白細(xì)胞中的許多對(duì)Αβ也呈免疫陽性（圖3a-c)，支持如下的 概念：所述陽性白細(xì)胞通行至AD腦和/或經(jīng)腦血管轉(zhuǎn)運(yùn)、然后將它們中錯(cuò)折疊形態(tài)的Αβ 吸收并輸出至體循環(huán)。野生型（同窩對(duì)照）白細(xì)胞的探針信號(hào)是可忽略的。
[0145] 而后在人類AD血樣中測(cè)試該方法。對(duì)從臨床診斷的AD和對(duì)照（健康、腦卒中、克 雅氏?。–JD))患者中新鮮分離的血沉棕黃層進(jìn)行類似的分析。所有的AD樣品顯示出具有 Χ-34的強(qiáng)陽性細(xì)胞，展現(xiàn)出特征性發(fā)射光譜，這些幾乎不存在與所有的對(duì)照中（圖4a-b)。 僅在AD白細(xì)胞中看到強(qiáng)AD-特異性熒光型號(hào)（圖4c)。這些結(jié)果也表明使用具有用于該分 析（尤其是選作檢測(cè)AD)的基礎(chǔ)光譜的探針X-34，CJD蛋白質(zhì)聚集體是無法檢出的，這些結(jié) 果也表明不同的熒光探針和/或不同的特異放射光譜的檢測(cè)（對(duì)CJD是唯一的，但對(duì)AD不 是），對(duì)檢測(cè)單一推定的與CJD相關(guān)的錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)將是必要的。最后，以抗Αβ共標(biāo)記所 有的Χ-34-陽性白細(xì)胞（圖5)，表明在AD小鼠中，可在循環(huán)人血白細(xì)胞中檢測(cè)"類-AD病 理"。
[0146] 總之，這些觀察表明可在循環(huán)白細(xì)胞中檢測(cè)AD病狀。這樣的外周異常反映出AD 腦中的相關(guān)的病狀，因此構(gòu)成了對(duì)于AD的可靠檢測(cè)。
[0147] 實(shí)施例2 :使用探針Κ114在白細(xì)胞中檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集體
[0148] 使用熒光探針Κ114,一種淀粉樣蛋白-特異性染料和剛果紅的類似物在人類白細(xì) 胞中檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集體。此外，使用算法（例如，基于Levenberg-Marquardt阻尼最小二乘 非線性曲線擬合算法的算法）處理來自于標(biāo)記的白細(xì)胞的熒光信號(hào)，以從背景和自體熒光 發(fā)射中分離所述疾病-特異性信號(hào)。計(jì)算基于熒光發(fā)射的計(jì)數(shù)，反映出源于患者的測(cè)試細(xì) 胞樣品的可能性，所述患者來源于與異常蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病。
[0149] 方案
[0150] 從患者抽取血液至EDTA管并置于冰中。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離血沉棕黃層（白細(xì)胞）。 簡(jiǎn)要地，在室溫，1700RCF下離心所述血樣，移除濃縮的白細(xì)胞帶（中白層）。在室溫下，用 ACK裂解液裂解受污染的紅細(xì)胞3-5min，以PBS洗滌白細(xì)胞樣品。
[0151] 將白細(xì)胞在10%中性緩沖福爾馬林中固定。將小等分試樣的固定白細(xì)胞置于載玻 片上并干燥。以熒光探針K114或X-34將干燥樣品染色。
[0152] 以緩沖液洗滌探針，用水為基礎(chǔ)的載體介質(zhì)覆蓋，并在激光掃描顯微鏡下成像。
[0153] 所述成像均在不同和多個(gè)波長(zhǎng)下，使用連續(xù)波激光照射（帶有共聚焦檢測(cè)的1-光 子激發(fā)）或使用2-質(zhì)子激發(fā)進(jìn)行。任選地，也可使用多質(zhì)子激發(fā)。
[0154] 使用光譜成像系統(tǒng)獲取數(shù)百個(gè)細(xì)胞的數(shù)張圖像中的每一張，所述光譜成像系統(tǒng)要 求跨越400-750nm的光譜解析數(shù)據(jù)的32個(gè)通道（典型的）。
[0155] 所述細(xì)胞成像用于分析熒光包涵體（在對(duì)照和AD/MCI(輕度認(rèn)知缺損）樣品中均 存在）和用于白細(xì)胞胞漿中增強(qiáng)的熒光。這些包涵體通過尺寸和作為初始步驟的手動(dòng)提取 的特征熒光光譜進(jìn)行分類。這些"基礎(chǔ)光譜"代表了樣品中的多種發(fā)射體：自體熒光、激光 后向散射制品、數(shù)個(gè)來自于每個(gè)熒光探針的特征發(fā)射。這些光譜因激發(fā)波長(zhǎng)而不同，并在每 個(gè)波長(zhǎng)下被重新測(cè)定（通常使用2個(gè)不同的激發(fā)波長(zhǎng)）。
[0156] 使用這些基礎(chǔ)光譜，處理組合圖像中的組合熒光以檢測(cè)每個(gè)樣品的每個(gè)基礎(chǔ)光譜 的相對(duì)權(quán)重/貢獻(xiàn)，對(duì)每個(gè)基礎(chǔ)光譜產(chǎn)生數(shù)值系數(shù)。軟件部分基于Levenberg-Marquardt 阻尼最小二乘非線性曲線擬合算法。
[0157] 使用系數(shù)的比率計(jì)算每個(gè)類別的"疾病指數(shù)":對(duì)照、MCI(輕度認(rèn)知缺損）、AD和其 他的神經(jīng)障礙。不同的障礙，例如CDJ\BSE需要不同的熒光探針和/或不同的基礎(chǔ)光譜，以 檢測(cè)單一推定的折疊蛋白質(zhì)。
[0158] 結(jié)論
[0159] 在以K114標(biāo)記的AD患者的白細(xì)胞中觀察到AD-特異性信號(hào)。以K114標(biāo)記的健 康細(xì)胞的發(fā)射光譜與以K114標(biāo)記的AD細(xì)胞是可區(qū)分的（圖6b)。
[0160] 圖7是簡(jiǎn)化的復(fù)合指數(shù)，其反映出個(gè)體患有AD或輕度認(rèn)知缺損（MCI)的可能性 ("ADR指數(shù)"S卩"AD相關(guān)的指數(shù)")。白細(xì)胞從健康對(duì)照（HealthyCont)、未患有AD/MCI的 腦卒中患者（腦卒中）、患有"其他神經(jīng)障礙"(〇ND)的患者和患有阿爾茨海默氏?。ˋD)、輕 度認(rèn)知缺損（MCI)和大腦淀粉樣血管?。–AA)的患者中取樣。所述0ND患者患有CJD。
[0161] 所有的非-ADR對(duì)照（健康對(duì)照、腦卒中和CJD)全部呈陰性，所有的ADR患者 (AD+MCI)全部為陽性。此外，四分之三的大腦淀粉樣血管?。–AA)患者呈陽性。該數(shù)據(jù)表 明所述方法清晰地識(shí)別出患有阿爾茨海默氏病和相關(guān)障礙的患者。
[0162] 實(shí)施例3.MS患者腦中淀粉樣蛋白的存在
[0163] 普遍認(rèn)為AD是具有次級(jí)先天炎癥的神經(jīng)變性障礙，但是對(duì)于多發(fā)性硬化的觀點(diǎn) 尚不明確。最初，證據(jù)有力地支持原發(fā)自身免疫性障礙，其產(chǎn)生的炎性攻擊引發(fā)脫髓鞘和皮 質(zhì)萎縮。但是，近期來自于詳細(xì)的病理檢查的數(shù)據(jù)和有效的抗炎治療的經(jīng)驗(yàn)對(duì)該結(jié)論產(chǎn)生 懷疑（Stys等人，2012)。
[0164] 因此，存在MS也可能是原發(fā)變性障礙，具有異常突出的炎癥次級(jí)反應(yīng)的可能性。 那么什么可能是MS的根源呢？而后慢性MS的病理（其中炎性反應(yīng)不太突出）表明脫髓鞘 病變隨時(shí)間而發(fā)展（可能從斑塊中離散的病灶傳播？），腦室周圍和皮質(zhì)的病理顯示一些 可溶的因子（可能在CSF中循環(huán)？）可能負(fù)有責(zé)任。淀粉樣蛋白具有這樣的性質(zhì)：它們可 傳播和錯(cuò)折疊額外的蛋白，作為有毒的可溶種類循環(huán)（例如AD中的Αβ低聚物），而后壓縮 成不溶的聚集體。圖8示出了以剛果紅，淀粉樣蛋白探針染色的人MS腦。這些數(shù)據(jù)顯示慢 性MS斑塊具有淀粉樣蛋白沉積。這些沉積可能是引起髓鞘質(zhì)和神經(jīng)元損傷的MS的主要特 征，如Αβ在AD中所為，或它們對(duì)炎癥的慢性發(fā)作具有反應(yīng)性。不管怎樣，MS腦中淀粉樣 蛋白斑塊的存在表明與AD相類似的，MS患者的循環(huán)白細(xì)胞也可能攜帶可檢測(cè)的淀粉樣蛋 白質(zhì)聚集體。
[0165] 實(shí)施例4.更大規(guī)模研究：使用熒光光譜對(duì)于AD的血液測(cè)試
[0166] 獲取來自于30個(gè)AD和30個(gè)年齡匹配的健康對(duì)照，以及其他非AD-神經(jīng)變性障礙 的血樣。分離血沉棕黃層和以構(gòu)象敏感探針標(biāo)記的白細(xì)胞。得到光譜2-光子和1-光子圖 像，并使用算法處理來自于白細(xì)胞的熒光信號(hào)以從背景和自體熒光發(fā)射中分離AD-特異性 信號(hào)。AD個(gè)體的白細(xì)胞淀粉樣蛋白探針熒光的光譜特征實(shí)際上與人和小鼠的老年斑塊的相 同，這有力地表明特定的白細(xì)胞亞群1-2% )包含與大腦斑塊中發(fā)現(xiàn)的那種相似的物 質(zhì)。此外，這些探針-陽性的白細(xì)胞對(duì)抗Αβ抗體強(qiáng)烈地共標(biāo)記，與下述理解相一致：途徑 腦（微脈管系統(tǒng)和/或?qū)嵸|(zhì)）的特定白細(xì)胞暴露于富含Αβ的環(huán)境，給它們帶來這種暴露 的"記憶"，即通過本發(fā)明的方法是可檢測(cè)的。然后計(jì)算基于不同熒光發(fā)射的計(jì)分，反映出源 于AD患者的樣品的可能性。在所選的個(gè)體中進(jìn)行死后神經(jīng)病理學(xué)檢查以明確地確診。
[0167] 有證據(jù)表明白細(xì)胞的"激活"，例如通過感染，也增強(qiáng)探針的熒光，雖然光譜的特征 不同。因此本發(fā)明也包括具有多種感染、自身免疫疾病和淋巴組織增生障礙（白血病、淋巴 瘤）的人類個(gè)體，以確保所述方法的特異性。
[0168] 也有證據(jù)表明可使用1-質(zhì)子熒光激發(fā)（共聚焦），大大地簡(jiǎn)化了技術(shù)并為相對(duì)便 宜的高通量?jī)x器的未來發(fā)展開辟道路。
[0169] 實(shí)施例5.使用熒光光譜法對(duì)牛海綿狀腦病（BSE)的血液檢測(cè)
[0170] 使用來自羊瘙癢病-感染的和健康小鼠的血液，通過滲透性沖擊移除紅細(xì)胞 (RBCs)，分離非RBC血液成分。用構(gòu)象敏感的淀粉樣蛋白探針對(duì)細(xì)胞染色。僅在羊瘙癢病 血液成分中觀察到強(qiáng)陽性信號(hào)，而在未感染小鼠中為發(fā)現(xiàn)信號(hào)。此外，來自于瘙癢病-感染 的血樣的光譜特征與抗蛋白酶K、抗-PRP-陽性區(qū)域中的羊瘙癢病的脾完全相同。
[0171] 然后在實(shí)驗(yàn)BSE樣品中測(cè)試所述方法。使用兩種不同的構(gòu)象敏感的淀粉樣蛋白 探針，對(duì)冷凍分離的血沉棕黃層進(jìn)行相似的分析，所述血沉棕黃層來自于神經(jīng)病理學(xué)證明 的BSE和非-BSE對(duì)照，連同健康牛和那些具有其它疾病的牛（例如骨髓灰質(zhì)炎、腦膿腫）。 所有的BSE樣品均呈強(qiáng)陽性，而所有的其他樣品呈明顯的陰性。該數(shù)據(jù)顯示在此所描述的 光譜熒光法能可靠地檢測(cè)血液中的標(biāo)記物