本發(fā)明屬于藥物篩選模型建立技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種用于檢測紫杉醇亞細胞分布動力學(xué)的方法及模型建立，可應(yīng)用于考察另一種化合物是否能夠影響紫杉醇的細胞藥動學(xué)過程，即其分布于細胞骨架的濃度是否提高。

背景技術(shù)：

藥物代謝動力學(xué)是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄規(guī)律的一門學(xué)科，貫穿于新藥發(fā)現(xiàn)、臨床前研究的整個過程。在藥物研發(fā)過程中，藥效差、毒性強以及藥動學(xué)性質(zhì)不理想是淘汰候選化合物的三個主要原因。相關(guān)調(diào)查顯示，國際上臨床研究淘汰的藥物中，近 50% 研發(fā)失敗的藥物是由于其療效不佳，而另約 40% 候選化合物最終不能進入臨床研究是因為其藥物代謝動力學(xué)特征不理想。

經(jīng)典藥物代謝動力學(xué)理論是建立在血漿藥物濃度測定的基礎(chǔ)上，認為血漿藥物濃度與藥效成正比，并通過建立房室模型等數(shù)學(xué)模型，求算相應(yīng)的藥代動力學(xué)參數(shù)后，描述或預(yù)測藥物的體內(nèi)過程。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)基于血漿藥物濃度的經(jīng)典藥代動力學(xué)研究并不能完全解釋藥物在一些特定組織（如腫瘤、腦組織）中的藥理學(xué)作用，常難以準確有效地預(yù)測體內(nèi)藥物的藥效，出現(xiàn)藥動學(xué)/藥效學(xué)不相關(guān)的問題。目前已知很多藥物的靶點位于細胞內(nèi)，包括DNA、核受體、各種激酶、代謝酶等，所以這些藥物必須穿過多重生物屏障，才能發(fā)揮藥效。細胞內(nèi)藥物的處置過程及藥物與靶點的結(jié)合是藥物治療效果的決定因素。因此，針對這些靶點位于細胞內(nèi)的藥物，研究其細胞/亞細胞器內(nèi)的藥物濃度比研究血漿藥物濃度具有更重要的意義。

紫杉醇（PTX）作為廣譜抗癌藥，自1992年美國FDA批準上市以來，已廣泛應(yīng)用于某些常見惡性腫瘤，如非小細胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等。紫杉醇通過結(jié)合到微管蛋白，穩(wěn)定微管聚合體，抑制微管解聚，抑制有絲分裂，從而抑制細胞分裂增殖。紫杉醇在細胞內(nèi)起效，組織分布具有可飽和性，呈現(xiàn)非線性藥代動力學(xué)特征。因此，測定血漿中紫杉醇的濃度不能準確反映藥物在靶組織的濃度。此外，紫杉醇在靶組織濃度與細胞內(nèi)濃度不相關(guān)。紫杉醇在細胞亞結(jié)構(gòu)單位上的分布可以反映它結(jié)合到微管的能力，因此在亞細胞水平研究紫杉醇的分布很有意義。

目前，在亞細胞水平定量紫杉醇具有難度，因為在治療相關(guān)劑量下，紫杉醇在細胞隔室中濃度低。目前，已有報道使用LC-MS/MS方法，測定用一定濃度紫杉醇孵育后的A549細胞隔室中紫杉醇的濃度。但是，該方法并未篩選出適當?shù)姆跤龝r間及孵育濃度，僅用于測定細胞隔室中紫杉醇濃度，不能有效地篩選出能夠促進紫杉醇與微觀結(jié)合的化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種用于檢測紫杉醇亞細胞分布動力學(xué)的方法，以及其篩選模型的建立。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種用于檢測紫杉醇亞細胞分布動力學(xué)的方法及模型建立，包括如下步驟：

S1. 細胞培養(yǎng)；

S2. 對步驟S1的細胞進行不同時間點給藥后收樣；

S3. 對步驟S2收樣得到的細胞進行細胞亞結(jié)構(gòu)提取物的制備；

S4. 對步驟S3得到的提取物進行蛋白定量；

S5. 檢測步驟S3得到的提取物的紫杉醇含量；

S6. 通過分析紫杉醇含量和蛋白定量的比值，篩選出合適的給藥時間及紫杉醇濃度，建立檢測紫杉醇亞細胞分布動力學(xué)的方法及模型。從而應(yīng)用于考察另一種化合物是否能夠影響紫杉醇的細胞藥動學(xué)過程，即其分布于細胞骨架的濃度是否提高。

其中，優(yōu)選地，步驟S1所述細胞培養(yǎng)為：取對數(shù)生長期細胞接種至細胞培養(yǎng)皿中，連續(xù)培養(yǎng)。

優(yōu)選地，步驟S2是對S1連續(xù)培養(yǎng)過程中的細胞進行不同時間點給藥后收樣處理。

優(yōu)選地，步驟S3步驟S3進行細胞亞結(jié)構(gòu)提取物的制備時，根據(jù)細胞膜/細胞器、細胞質(zhì)、細胞骨架、細胞核的蛋白溶解性不同，從細胞中提取不同細胞蛋白；且細胞貼壁培養(yǎng)，在提取細胞不同部分的過程中細胞依舊貼壁，防止提取過程中四部分混合。

具體地，是利用ProteoExtract? Subcellular Proteome Extaction Kit 試劑盒進行細胞亞結(jié)構(gòu)提取物的制備。

優(yōu)選地，步驟S4是利用BCA蛋白定量分析試劑盒對步驟S3得到的提取物進行蛋白定量。

優(yōu)選地，步驟S5是利用UPLC-MS/MS方法檢測步驟S3得到的提取物的紫杉醇含量。

其中所述UPLC-MS/MS 方法的具體步驟為：首先配制紫杉醇標準系列溶液和內(nèi)標多西紫杉醇工作溶液，然后待測樣本經(jīng)過預(yù)處理后，上樣進行UPLC-MS/MS分析。

UPLC-MS/MS的條件為：使用超高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的 SRM 模式測定。

UPLC-MS/MS分析時，是以Waters ACQUIT YUPLCTM BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm) 色譜柱進行分離。

UPLC-MS/MS分析時，以甲醇：0.1%甲酸 (80：20，v/v) 流動相進等度洗脫。

所述待測樣本的預(yù)處理方法為：

待測樣本100μL，加入10μL內(nèi)標多西紫杉醇工作溶液，渦旋10s 混勻，加入叔丁基甲醚400 μL，渦旋1min，室溫靜置5min，然后14000rpm 4℃離心5min，吸取有機層，室溫下通風(fēng)揮干，加入100μL 10mM 醋酸銨：甲醇（1：1，v/v）溶液溶解，渦旋1min，14000rpm，4℃，離心5min，取上清液。上清液80μL置進樣瓶中，10μL上樣分析。

本文應(yīng)用UPLC-MS/MS 方法，具有很高的靈敏度，可以用于測定低濃度的紫杉醇，測定了用一定濃度紫杉醇處理后A549細胞隔室中紫杉醇的濃度。

另外，優(yōu)選地，步驟S1所述細胞為非小細胞肺癌A549細胞株。

本發(fā)明所篩選出來的最適給藥時間為：5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h。即連續(xù)培養(yǎng)72h后的給藥時間，即分別在給藥5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h后收樣。

本發(fā)明所篩選出來的最適紫杉醇濃度為0.1μg/mL。

本發(fā)明可應(yīng)用于考察另一種化合物是否能夠影響紫杉醇的細胞藥動學(xué)過程，即考察某化合物是否能夠影響紫杉醇分布于細胞骨架的濃度，具體的方法為：細胞培養(yǎng)72h后，分別進行兩種給藥方式：（1）0.1μg/mL紫杉醇，（2）0.1μg/mL紫杉醇和10μg/mL某化合物；然后按照不同時間點5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h，同一時間收樣處理，進行細胞亞結(jié)構(gòu)提取物的制備，進行UPLC-MS/MS分析紫杉醇含量，利用0.1μg/mL紫杉醇和10μg/mL某化合物處理后紫杉醇在細胞亞結(jié)構(gòu)提取物中隨時間分布變化圖與單獨給藥0.1μg/mL紫杉醇處理后紫杉醇在細胞亞結(jié)構(gòu)提取物中隨時間分布變化圖相比較，分析紫杉醇在細胞骨架的分布有無提高，即可說明待測某化合物是否可提高紫杉醇在細胞骨架的分布。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所涉及的細胞/亞細胞水平藥代動力學(xué)可以更加準確的反映藥物在作用靶點上的濃度，即紫杉醇在細胞微管的結(jié)合分布水平，直觀的反映紫杉醇的藥效。

本發(fā)明可用于考察另一種化合物是否能夠影響紫杉醇的細胞藥動學(xué)過程，即其分布于細胞骨架的濃度是否提高。對于提高紫杉醇生物利用度具有重要意義。篩選方法簡單，易于操作。

附圖說明

圖1是A549細胞用0.5μg/mL PTX 處理后各細胞亞結(jié)構(gòu)中紫杉醇濃度的變化圖。

圖2是A549細胞用0.01μg/mL PTX 處理后在四部分提取物中隨時間分布變化圖。

圖3是A549細胞用0.1μg/mL PTX 處理后紫杉醇在四部分提取物中隨時間分布變化圖。

圖4是A549細胞用 1μg/mL PTX 處理后紫杉醇在四部分提取物中隨時間分布變化圖。

圖5是A549細胞用0.1μg/mL紫杉醇+10μg/mL金松雙黃酮處理后紫杉醇在四部分提取物中隨時間分布變化圖。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1 細胞培養(yǎng)

1、取A549細胞（人非小細胞肺癌細胞A549細胞株），在配制好的 DMEM 培養(yǎng)基（高糖型）中，在100mm培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)（5% CO₂、37℃ 培養(yǎng)箱）。

2、取對數(shù)生長期細胞，棄培養(yǎng)基，用2mL PBS沖洗培養(yǎng)皿，用2mL胰酶消化3min后，加入4mL培養(yǎng)基終止反應(yīng)，之后1000rpm離心3min，棄上清，加2mL 培養(yǎng)基混勻之后加入到含有20mL培養(yǎng)基的離心管中稀釋，按 1×10⁶ 個/每皿細胞的密度種到直徑 60mm的細胞培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)基到4mL，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。

實施例2 藥物處理及細胞亞結(jié)構(gòu)提取物的制備

1、實施例1中細胞培養(yǎng)72h 后，進行如下實驗：

實驗一：按照不同時間點（5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h）給藥紫杉醇，0.5μg/mL；

實驗二：按照不同時間點（5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h）分別給藥紫杉醇，0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL；

實驗三：按照不同時間點（5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h）給藥，0.1μg/mL紫杉醇+10μg/mL金松雙黃酮（Sci），同一時間收樣處理。

2、根據(jù)亞細胞部分（細胞膜/細胞器、細胞質(zhì)、細胞骨架和細胞核）的蛋白溶解性不同，通過ProteoExtract? Subcellular Proteome Extaction Kit 試劑盒從 A549 細胞中提取不同細胞蛋白。細胞貼壁培養(yǎng)，在提取細胞不同部分的過程中細胞依舊貼壁，防止提取過程中四部分混合。

按照試劑盒說明書，提取過程為：

（1）細胞質(zhì)部分的制備：用 400μL 提取緩沖液Ⅰ 孵育細胞，4℃ 搖床振蕩 10min，轉(zhuǎn)移至 1.5mL EP管；

（2）細胞膜/細胞器部分的制備：用 400μL 提取緩沖液Ⅱ孵育細胞，4℃ 搖床振蕩 30min，轉(zhuǎn)移至 1.5 mL EP管；

（3）細胞核部分的制備：用 200μL 提取緩沖液Ⅲ孵育細胞，4℃ 搖床振蕩 10min，轉(zhuǎn)移至 1.5mL EP管；

（4）細胞骨架部分的制備：用 200μL 提取緩沖液Ⅲ孵育細胞，4℃ 搖床振蕩 5min，轉(zhuǎn)移至 1.5mL EP管。

3、制備的樣品然后經(jīng)超聲（4×30s on half-power），9000×g，4℃ 離心20min，上清分裝100μL 于新的 EP 管，置于 -80℃ 冰箱，用于 UPLC – MS/MS 檢測各部分紫杉醇含量，上清剩余部分進行蛋白含量測定。

4、空白樣品的制備：A549細胞（10⁶）培養(yǎng)三天，棄去培養(yǎng)基，加入 wash buffer 2mL，用細胞刷將細胞刮下，按上述步驟處理，用于方法確證中。置于-80℃ 儲存。

實施例3 蛋白含量測定

使用BCA蛋白定量分析試劑盒對上述實施例2的各細胞亞結(jié)構(gòu)提取物進行蛋白定量：

（1）取上述上清14μL 加入含有 100μL PBS 的 EP 管中，渦旋混勻；

（2）取 96 孔酶標板，每個樣本加2 個復(fù)孔，再加入200μL 雙縮脲試劑 AB 液/孔（A：B = 50：1）；

（3）37℃ 孵育 30 min，除去氣泡，用酶標儀檢測蛋白含量。

實施例4 紫杉醇的檢測

1、溶液配制

（1）紫杉醇儲備液

稱取0.560mg 紫杉醇對照品，加入到25mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀釋，定容到刻度，配制成22.4μg/mL 的紫杉醇儲備液。

（2）標準系列溶液

取紫杉醇儲備液適量，用甲醇梯度稀釋為濃度為 8.75、17.5、35、70、140、280、560、1120ng/mL 與 0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2、38.4、76.8ng/mL 的紫杉醇標準系列溶液。

（3）內(nèi)標多西紫杉醇儲備液及工作溶液

稱定25.0mg多西紫杉醇對照品，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，加甲醇溶解，并用甲醇稀釋、定容到刻度，配制成1mg/mL多西紫杉醇的儲備液，取適量多西紫杉醇儲備液用甲醇稀釋成濃度為 2μg/mL的內(nèi)標工作溶液。

2、樣品的預(yù)處理

待測樣本100μL，置于1.5mL EP管中，加入10μL內(nèi)標溶液（多西紫杉醇），渦旋10s 混勻，加入叔丁基甲醚400 μL，渦旋1min，室溫靜置5min，14000rpm，4℃，離心5min，吸取有機層至另一干凈離心管中，室溫下放置通風(fēng)廚中揮干，加入100μL 10mM 醋酸銨：甲醇（1：1，v/v）溶液溶解，渦旋1min，14000rpm，4℃，離心5min，取上清液80μL置進樣瓶中，10μL上樣分析。

3、UPLC-MS/MS測定方法和條件

UPLC-MS/MS條件：使用超高效液相-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的 SRM 模式測定。以 Waters ACQUIT YUPLCTM BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm) 色譜柱進行分離，以甲醇：0.1%甲酸 (80：20，v/v) 流動相進等度洗脫。

4、紫杉醇在細胞亞結(jié)構(gòu)提取物中濃度的測定

根據(jù)所建立的 UPLC-MS/MS 分析方法，進樣進行定量測定，結(jié)果分別如附圖1～5所示。

圖1是A549細胞用0.5μg/mL PTX 處理后各細胞亞結(jié)構(gòu)中紫杉醇濃度的變化圖。結(jié)果顯示，在各細胞亞結(jié)構(gòu)中紫杉醇濃度均在1h之前達到峰值，時間在 3h 之后基本到了繼續(xù)下降沒有新的變化趨勢，因此選擇時間點：5min、10min、20min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h 作為該檢測模型時間點。

圖2、圖3、圖4分別是A549細胞用0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL PTX 處理后在四部分提取物中隨時間分布變化圖。結(jié)果顯示，比較包括圖1在內(nèi)的四種不同濃度紫杉醇處理后各細胞亞結(jié)構(gòu)中紫杉醇濃度變化情況，可以看出用0.5 μg/mL紫杉醇處理細胞組細胞的藥動學(xué)過程最為理想，紫杉醇在微管中濃度最高?？褂薪z分裂藥物可以通過減少微管蛋白的溶解性、引起蛋白從細胞質(zhì)（可溶性）到細胞骨架（不溶性）的再分布穩(wěn)定微管，測得的分布結(jié)果與上述理論一致。微管蛋白是細胞骨架的動態(tài)結(jié)構(gòu)成分，因此紫杉醇結(jié)合到細胞骨架聚合的微管的量可以反映紫杉醇對微管聚合的作用。由于該模型用于考察另一種化合物能否提高紫杉醇在細胞骨架的分布，所以最終選擇0.1μg/mL作為給藥濃度。

圖5是A549細胞用0.1μg/mL紫杉醇+10μg/mL金松雙黃酮處理后紫杉醇在四部分提取物中隨時間分布變化圖。對比圖3可看出，紫杉醇在細胞骨架的分布明顯提高，即說明金松雙黃酮可提高紫杉醇在細胞骨架的分布。