本發(fā)明涉及抗包蟲藥物的高通量篩選方法，具體涉及一種利用生發(fā)層細(xì)胞篩選抗包蟲藥物的方法，特別涉及到的是利用小鼠體內(nèi)繼發(fā)細(xì)粒棘球蚴囊分離生發(fā)層細(xì)胞高通量篩選抗包蟲藥物的方法。

背景技術(shù)：

棘球蚴病俗稱包蟲病，是全球分布的重要人畜共患疾病之一，嚴(yán)重危害人民健康并且給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)包蟲病患者高達(dá)60～70萬，受威脅人群約為達(dá)6600萬以上。包蟲病在患者體內(nèi)發(fā)展緩慢，主要產(chǎn)生占位性病變，使患者喪失勞動(dòng)能力，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重的損害。尤其是泡球蚴病，死亡率高，有“寄生蟲腫瘤”和“第二癌癥”之稱。但是，目前治療包蟲病僅有甲苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑兩個(gè)藥物，且這些藥物的治愈率僅為30％左右。亟待找到新的有效替代藥物，最終達(dá)到提高藥物治療效果，減輕患者疾病痛苦的目標(biāo)。

目前，國(guó)內(nèi)外主要應(yīng)用體外培養(yǎng)和動(dòng)物模型兩種手段進(jìn)行藥效研究。感染動(dòng)物模型建立周期長(zhǎng)，成本高昂，難以應(yīng)用于藥物篩選。體外培養(yǎng)模型則是考察藥物對(duì)于原頭節(jié)(protoscolex)、棘球蚴囊(metacestode)和棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞(germinal cell)的殺滅作用。其中用原頭節(jié)和棘球蚴囊進(jìn)行藥物篩選有著不同程度的缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)藥物的高通量篩選。最近的研究表明，生發(fā)層細(xì)胞的培養(yǎng)和應(yīng)用在很大程度上可以取代動(dòng)物模型，并且具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單和安全的特征。但是目前已報(bào)道的棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞系的建立均基于疫區(qū)的病人或病畜材料，材料的獲得受到限制；目前尚未在該生發(fā)層細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上建立抗包蟲藥物篩選體系；而且，缺乏敏感、高通量 的藥效評(píng)價(jià)方法。上述技術(shù)的缺乏導(dǎo)致目前還沒有基于以小鼠繼發(fā)性生發(fā)層細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選的研究和報(bào)道。

為解決上述問題，本發(fā)明者通過建立原頭節(jié)繼發(fā)感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型收獲棘球蚴囊，從中分離生發(fā)層細(xì)胞以進(jìn)行藥物篩選，以期實(shí)現(xiàn)大范圍內(nèi)的抗包蟲藥物高通量篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種抗包蟲藥物高通量篩選方法，包括如下步驟：

1)建立小鼠繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴感染模型，分離細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞及建立生發(fā)層細(xì)胞系；

2)制備棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴或OD₅₀₈＝0.2；

3)制備貼壁細(xì)胞后與待測(cè)藥物共培養(yǎng)72h；

4)測(cè)定上清液的堿性磷酸酶含量及貼壁細(xì)胞的活性以確定待測(cè)藥物的抗包蟲活性。

本發(fā)明方法中，步驟1)建立小鼠繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴感染模型采用羊源原頭節(jié)感染小鼠后繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠8-10個(gè)月，從而獲得棘球蚴感染模型。

將羊源原頭節(jié)感染8-10個(gè)月的小鼠剖取細(xì)粒棘球蚴，分離生發(fā)層細(xì)胞，于RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO₂的環(huán)境中鋪板培養(yǎng)，21天后進(jìn)行傳代，待傳代穩(wěn)定后每2周傳代一次以建立生發(fā)層細(xì)胞系。

本發(fā)明方法中，步驟2)中棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞懸液的制備方法包括：取貼壁細(xì)胞加入0.25％胰酶消化5～30分鐘后加入培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，得到細(xì)胞懸液。

本發(fā)明方法中，步驟3)將所述棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，使細(xì)胞完全貼壁，制備成貼壁細(xì)胞。

貼壁細(xì)胞與待測(cè)藥物共培養(yǎng)72h，所述待測(cè)藥物是候選抗包蟲藥物。

本發(fā)明方法中，步驟4)為：加入待測(cè)藥物后72h吸取培養(yǎng)液上 清，用常規(guī)方法測(cè)定上清液的堿性磷酸酶含量。

步驟4)中還采用MTT(四甲基偶氮唑鹽)法測(cè)定貼壁細(xì)胞的活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過對(duì)細(xì)胞在常用細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI1640和MEM培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較，最終選擇PRMI1640培養(yǎng)基作為生發(fā)層細(xì)胞適宜的培養(yǎng)介質(zhì)。除此之外，通過觀察細(xì)胞的增殖周期，采用將生發(fā)層細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后進(jìn)行傳代，待傳代穩(wěn)定后每2周傳代一次，從而實(shí)現(xiàn)小鼠繼發(fā)性棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞系的建立。并且，通過同時(shí)采用傳統(tǒng)的細(xì)胞活性測(cè)定方法以及測(cè)定細(xì)胞受損后細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的外溢情況，保證細(xì)胞活性測(cè)定的準(zhǔn)確性和靈敏度。

具體來說，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用小鼠繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞進(jìn)行抗包蟲藥物的高通量篩選方法，步驟如下：

1)小鼠細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞的分離及細(xì)胞系的建立：

用羊源原頭節(jié)感染昆明鼠以建立繼發(fā)性細(xì)粒棘球蚴感染模型，接種8-10個(gè)月后，剖取細(xì)粒棘球蚴分離生發(fā)層細(xì)胞于RPMI1640培養(yǎng)基中在37℃，5％CO₂的環(huán)境中鋪板培養(yǎng)。將生發(fā)層細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后進(jìn)行傳代，待傳代穩(wěn)定后每2周傳代一次以建立細(xì)胞系。

2)篩選抗包蟲藥物：

棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞懸液的制備：取貼壁細(xì)胞加入0.25％胰酶進(jìn)行消化5～30分鐘后加入培養(yǎng)基進(jìn)行吹打成為細(xì)胞懸液；

棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞濃度的調(diào)試：用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整至5×10⁴或OD₅₀₈＝0.2；

篩選待測(cè)藥物：將上述懸液接種于96孔培養(yǎng)板，24h后待細(xì)胞完全貼壁后加入待測(cè)藥物；

檢測(cè)：加入藥物后72h吸取培養(yǎng)液上清測(cè)定堿性磷酸酶含量，同時(shí)用MTT(四甲基偶氮唑鹽)法測(cè)定貼壁細(xì)胞的活性。通過測(cè)定吸光度值的變化評(píng)價(jià)藥物的作用效果，計(jì)算該待測(cè)藥物對(duì)生發(fā)層細(xì) 胞活性抑制率。

MTT法測(cè)定貼壁細(xì)胞的活性：

細(xì)胞活性抑制率＝[(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％

堿性磷酸酶法測(cè)定：

細(xì)胞活性抑制率＝[(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％

按上述方法培養(yǎng)的生發(fā)層細(xì)胞24h后可見細(xì)胞貼壁并向四周伸出梭狀偽足，細(xì)胞形態(tài)多樣，為梭形，三角形，圓形等，見圖1。

本發(fā)明的的有益效果是：基于生發(fā)層細(xì)胞活性測(cè)定的高通量篩選體系的建立，為在更大范圍內(nèi)尋找抗包蟲的藥物奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，不僅大大降低了待測(cè)藥物的用量，而且提高了篩選效率、降低篩選成本消耗。

附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1顯示生發(fā)層細(xì)胞形態(tài)(A.染色后細(xì)胞；B.未染色細(xì)胞)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1)生發(fā)層細(xì)胞的制備：

(1)繼發(fā)棘球蚴小鼠模型的建立：在流行區(qū)采集棘球蚴囊，吸取含有原頭節(jié)的囊液，將此囊液傾至容量為50ml的圓底離心管中，自然沉淀10min后，去上清液，隨后用生理鹽水將含原頭節(jié)的沉淀物洗滌5-8次，每次10min。將一定量的含青霉素鈉鹽50萬u/L的生理鹽水加至洗滌完畢的原頭節(jié)中，混懸均勻后吸取10-20μl，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，并觀察原頭節(jié)存活狀況，若存活數(shù)占95％以上時(shí)可用于接種。接種時(shí)將原頭節(jié)稀釋至4000只/ml備用。在盛有準(zhǔn)備接種的細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)懸液的燒杯內(nèi)加入攪拌子，將燒杯放置 在磁性攪拌器的平臺(tái)上，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，以保持原頭節(jié)和囊組織混懸。用1ml注射器吸取原頭節(jié)懸液0.5ml(2000只原頭節(jié))，用75％酒精擦涂小鼠皮膚，將原頭節(jié)注入小鼠腹腔內(nèi)。該模型建立8-10月后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(2)生發(fā)層細(xì)胞的分離：剖檢上述小鼠，取出其體內(nèi)的棘球蚴囊，用生理鹽水清洗囊3-5次后將其剪碎后加入0.25％胰酶，37℃消化10-30分鐘，取上清液500rpm離心5分鐘后棄去上清，用1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液。

(3)生發(fā)層細(xì)胞傳代培養(yǎng)：將生發(fā)層細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后進(jìn)行傳代，待傳代穩(wěn)定后每2周傳代一次以建立細(xì)胞系.

(4)單層細(xì)胞懸液的制備：取貼壁細(xì)胞加入0.25％胰酶消化5～30分鐘后，加入培養(yǎng)基進(jìn)行吹打，形成細(xì)胞懸液，并用血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整至5×10⁴或用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并調(diào)整OD₅₀₈值至0.2。

(5)生發(fā)層細(xì)胞的鑒定：將細(xì)胞鋪板于96孔板，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等手段進(jìn)行測(cè)定。

(6)生發(fā)層細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇：按照細(xì)胞的常規(guī)凍存和復(fù)蘇方法保存生發(fā)層細(xì)胞。

2)模擬篩選抗包蟲藥物甲苯達(dá)唑：

篩選待測(cè)藥物：將調(diào)試好的生發(fā)層細(xì)胞懸液100μl進(jìn)行鋪板，24h后待細(xì)胞貼壁后加入甲苯達(dá)唑儲(chǔ)備液，使其終濃度分別為10μg/ml，5μg/ml和1μg/m(n＝6)。

檢測(cè)：分別于給藥后24h，72h和144h取30μl細(xì)胞培養(yǎng)基，加入170μl堿性磷酸酶測(cè)定體系(其中包含0.67M磷酸對(duì)硝基苯酯、1.0M二乙醇胺以及0.50mM氯化鎂,pH 9.8)，置于室溫避光1h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量405nm波長(zhǎng)下的吸光度。按下式計(jì)算該待測(cè)藥物對(duì)生發(fā)層細(xì)胞活性的抑制率，結(jié)果見表1。

細(xì)胞活性抑制率＝[(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％。

表1 不同濃度甲苯達(dá)唑?qū)ιl(fā)層細(xì)胞的活性抑制率

從表1中可以看出：隨著給藥濃度和藥物作用時(shí)間的增加，甲苯達(dá)唑?qū)ιl(fā)層細(xì)胞的抑制率也相應(yīng)增加，這種現(xiàn)象亦和甲苯達(dá)唑的作用機(jī)制和特點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。

實(shí)施例2

1)取實(shí)施例1生發(fā)層細(xì)胞的制備。

2)模擬篩選抗包蟲藥物甲苯達(dá)唑：

篩選待測(cè)藥物：同實(shí)施例1。

檢測(cè)：分別于給藥后24h，72h和144h后棄去培養(yǎng)基，加入5mg/ml的MTT溶液(MTT 0.5克溶于100ml磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，避光保存于4℃)50μl，置于37℃，2h后加入100μl DMSO，待甲臜全部溶解后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量570nm波長(zhǎng)下的吸光度。按下式計(jì)算該待測(cè)藥物對(duì)生發(fā)層細(xì)胞活性的抑制率，結(jié)果見表2。

細(xì)胞活性抑制率＝[(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％

表2 不同濃度甲苯達(dá)唑作用后生發(fā)層細(xì)胞活性變化

從表2中可以看出，MTT法測(cè)定與堿性磷酸酶測(cè)定活性的結(jié)果基本一致，即隨著給藥濃度和藥物作用時(shí)間的增加，甲苯達(dá)唑?qū)ιl(fā)層細(xì)胞的抑制率也相應(yīng)增加。

實(shí)施例3

1)取實(shí)施例1生發(fā)層細(xì)胞的制備。

2)模擬篩選殺滅原頭節(jié)藥物硝唑尼特：

篩選待測(cè)藥物：96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板，按照實(shí)施例1的模式，在培養(yǎng)孔中加入一定濃度的硝唑尼特于37℃，5％CO₂的環(huán)境中作用72h。

檢測(cè)：取30μl細(xì)胞培養(yǎng)基，加入170μl堿性磷酸酶測(cè)定體系(同實(shí)施例1)，于室溫避光1h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量405nm波長(zhǎng)下的吸光度。按下式計(jì)算該待測(cè)藥物對(duì)生發(fā)層細(xì)胞活性的抑制率，結(jié)果見表3。

胞活性抑制率＝[(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％

表3 不同濃度硝唑尼特作用后生發(fā)層細(xì)胞活性變化

從此表中可以看出：硝唑尼特對(duì)棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞幾乎沒有抑制效果，從而印證了其作為殺滅原頭節(jié)而非抗生發(fā)層細(xì)胞活性的抗包蟲藥物的作用效果。

實(shí)施例4

1)取實(shí)施例1生發(fā)層細(xì)胞的制備。

2)模擬篩選殺滅原頭節(jié)藥物硝唑尼特：

篩選待測(cè)藥物：96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行鋪板，按照實(shí)施例1的模式，在培養(yǎng)孔中加入一定濃度的待篩選藥物于37℃，5％CO₂的環(huán)境中作用72h。

檢測(cè)：分別于給藥后24h，72h和144h后棄去培養(yǎng)基，加入5mg/ml的MTT溶液(MTT 0.5克溶于100ml磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，避光保存于4℃)50μl，置于37℃，2h后加入100μl DMSO，待甲臜全部溶解后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量570nm波長(zhǎng)下的吸光度。按下式計(jì)算該待測(cè)藥物對(duì)生發(fā)層細(xì)胞活性的抑制率，結(jié)果見表2。

細(xì)胞活性抑制率＝[(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)-(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)]/(對(duì)照度吸光度值-調(diào)零孔吸光度值)×100％

表4 不同濃度硝唑尼特對(duì)生發(fā)層細(xì)胞的活性抑制率

從表4中可以看出，MTT法測(cè)定與堿性磷酸酶測(cè)定的結(jié)果基本一致，硝唑尼特對(duì)生發(fā)層細(xì)胞沒有明顯作用。