本發(fā)明涉及一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，屬于物理誘變
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：安普霉素是由黑暗鏈霉菌產(chǎn)生的一類氨基糖苷類抗生素，安普霉素是一種廣譜抗生素，作用于細(xì)菌的核糖體而導(dǎo)致mRNA密碼的錯(cuò)讀(misreading)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。安普霉素由于具有獨(dú)特的辛二糖結(jié)構(gòu)，不易被氨基糖苷類抗生素的乙酰化酶、腺苷化酶、磷酸化酶鈍化，對(duì)多種氨基糖苷類抗生素的耐藥菌有抑制和殺滅作用，使用中不易產(chǎn)生交叉耐藥性，同時(shí)具有低毒、低殘留量、安全的特點(diǎn)，由于它具有上述特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于由大腸桿菌、沙門氏菌等引起的畜禽急慢性腹瀉、腸炎等疾病的預(yù)防和治療且療效顯著。安普霉素是近幾年興起的一種新型抗生素，其使用量不斷擴(kuò)大，目前，國(guó)內(nèi)多家企事業(yè)單位對(duì)安普霉素生產(chǎn)工藝進(jìn)行了開發(fā)優(yōu)化，尤其是菌種方面，提升潛能較大。高通量篩選技術(shù)近年來在生物育種領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，能夠成倍的提升菌種的選育數(shù)量，使用傳統(tǒng)的誘變技術(shù)在海量的單菌落中挑選高產(chǎn)菌株成為可能，大大提高了選種效率。低能離子是指能量在104KeV-105KeV之間的離子，它是相對(duì)于傳統(tǒng)輻射生物學(xué)中106KeV-109KeV而言的，能夠引起細(xì)胞性能改變，從而使菌體產(chǎn)生突變。紫外誘變使用紫外照射使細(xì)胞堿基配對(duì)產(chǎn)生錯(cuò)亂，而引起突變的一種常規(guī)誘變方法，與新興的基因技術(shù)相比，具有成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是獲取高產(chǎn)菌株的重要方法。高通量篩選的技術(shù)難點(diǎn)是快速大量測(cè)定單菌產(chǎn)量高低，因一次選育菌種量較大，如何快速測(cè)定效價(jià)高低成為關(guān)鍵因素。利用低能離子注入和紫外誘變時(shí)的主要技術(shù)難點(diǎn)是低能離子的能量低，理論射程很短，黑暗鏈霉菌未使用過低能離子和紫外復(fù)合處理，復(fù)合處理對(duì)黑暗鏈霉菌作用效果受哪些因素影響，目前并未研究清楚。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。該方法可以有效提高安普霉素的選種效率和效果，為后續(xù)篩選高產(chǎn)安普霉素菌株提供技術(shù)支持。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌孢子至無菌水中，混合均勻，制得黑暗鏈霉菌孢子懸液；(2)將步驟(1)制得的黑暗鏈霉菌孢子懸液轉(zhuǎn)接至滅菌后的培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)吹干，制得菌膜，然后進(jìn)行低能離子束的注射誘變，靶室真空度為6.0～8.0×10-3Pa，注射脈沖劑量設(shè)定為70～90×2.6×1014ions/(cm2·s)，注射完成后，再進(jìn)行紫外照射28～32s，紫外燈管功率為15W，照射距離28～32cm，然后使用無菌水洗滌后涂布平板培養(yǎng)基，36～38℃培養(yǎng)7～8天，制得單菌落；(3)將步驟(2)中制得的單菌落，接入孔板內(nèi)的孔板培養(yǎng)基中，在36～38℃震蕩培養(yǎng)5～6天，制得培養(yǎng)液；(4)將步驟(3)中獲取的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至含枯草芽孢桿菌的生測(cè)培養(yǎng)基平板中進(jìn)行抑菌檢測(cè)，36～38℃培養(yǎng)16h，選取抑菌圈直徑大于15mm的單菌進(jìn)行復(fù)篩。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中鏈霉菌孢子為生長(zhǎng)均勻、豐滿的黑暗鏈霉菌的孢子。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，注射脈沖劑量為80×2.6×1014ions/(cm2·s)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，紫外照射時(shí)間30s，照射距離30cm。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，培養(yǎng)條件為：36～38℃培養(yǎng)7天。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，平板培養(yǎng)基組分如下，均為質(zhì)量百分比：可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化鈉0.03～0.07％、硫酸亞鐵0.001％、硫酸鎂0.03～0.07％、磷酸氫二鉀0.03～0.07％、硝酸鉀0.05～0.15％、瓊脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，所述孔板為24孔的孔板。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，孔板培養(yǎng)基組分如下，均為質(zhì)量百分比：豆餅粉2～6％、葡萄糖2～6％、蛋白胨0.5～1.5％、玉米粉0.5～1.5％、碳酸鈣0.3～0.6％、氯化錳0.02～0.04％、氯化銨0.4～0.6％、硫酸鋅0.002～0.005％、硫酸亞鐵0.003～0.005％、硫酸鎂0.2～0.05％、磷酸二氫鉀0.003～0.005％、豆油0.8～1.20％，余量水，pH自然。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，枯草芽孢桿菌的質(zhì)量含量為0.5％。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述抑菌檢測(cè)采用牛津杯法，每個(gè)平板放6個(gè)牛津杯。有益效果1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)利用低能離子束誘變與紫外誘變復(fù)合進(jìn)行誘變，二者順序結(jié)合后可以顯著提高正向誘變幾率，能夠更好地提高黑暗鏈霉菌的突變幾率，具有操作簡(jiǎn)便，效率高、篩選效果好、可重復(fù)性高，解除了菌種對(duì)常規(guī)物理和化學(xué)誘變的疲勞效應(yīng)；2、本發(fā)明通過對(duì)黑暗鏈霉菌孢子懸液制備菌膜，能夠更好更均勻的使孢子接觸氮離子和紫外線的誘變，提高誘變幾率；3、本發(fā)明采用的24孔板，替代原來的搖瓶培養(yǎng)，極大地提高了菌落篩選數(shù)量，使用抑菌圈直徑代替生物效價(jià)測(cè)定，使大量檢測(cè)成為現(xiàn)實(shí)，大大提高了選種效率，利用本申請(qǐng)所述的方法，可以極大提高安普霉素選種效率，為篩選出高性能菌株奠定了基礎(chǔ)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例中所使用的設(shè)備均按照現(xiàn)有技術(shù)。配制培養(yǎng)基：培養(yǎng)基組分如下，均為質(zhì)量百分比：平板培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化鈉0.03～0.07％、硫酸亞鐵0.001％、硫酸鎂0.03～0.07％、磷酸氫二鉀0.03～0.07％、硝酸鉀0.05～0.15％、瓊脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。斜面培養(yǎng)基配比：可溶性淀粉1.5～2.5％、牛肉膏0.05～0.15％、氯化鈉0.03～0.07％、硫酸亞鐵0.001％、硫酸鎂0.03～0.07％、磷酸氫二鉀0.03～0.07％、硝酸鉀0.05～0.15％、瓊脂1.5～2.0％，余量水，pH自然。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。孔板培養(yǎng)基：豆餅粉2～6％、葡萄糖2～6％、蛋白胨0.5～1.5％、玉米粉0.5～1.5％、碳酸鈣0.3～0.6％、氯化錳0.02～0.04％、氯化銨0.4～0.6％、硫酸鋅0.002～0.005％、硫酸亞鐵0.003～0.005％、硫酸鎂0.2～0.05％、磷酸二氫鉀0.003～0.005％、豆油0.8～1.20％，余量水，pH自然。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。生物效價(jià)測(cè)定培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，磷酸氫二鉀0.3％，牛肉膏0.3％，瓊脂1.5％，余量水，pH7.6～7.8。上述培養(yǎng)基可采用常規(guī)配制方法，采用純化水配制、121℃滅菌30min。菌種：黑暗鏈霉菌Ap15-101，購自沈陽藥科大學(xué)。生測(cè)菌種：枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501，購自山東大學(xué)菌種保藏中心。實(shí)施例1：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：孢子懸液制備：取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；菌膜制備：取0.5mL黑暗鏈霉菌孢子懸液涂布于空白平板內(nèi)，使用無菌風(fēng)吹干，制備多個(gè)黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用。誘變：將黑暗鏈霉菌菌膜在70×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入完成后在15W紫外燈管、距離30cm情況下照射30s，照射完成后取2ml無菌水加至誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36～38℃條件下培養(yǎng)7天，挑選單菌落239個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。初篩：?jiǎn)尉浣尤肟装搴?，在溫?6～38℃的條件下培養(yǎng)144h，搖床轉(zhuǎn)速220～240rpm，然后取200μl，加入含0.5％枯草芽孢桿菌的生測(cè)培養(yǎng)基平板的牛津杯中，每個(gè)平板放6個(gè)牛津杯，36～38℃培養(yǎng)16h，量取抑菌圈直徑，根據(jù)直徑大小，選取直徑大于15mm的菌種，進(jìn)行復(fù)篩。初篩結(jié)果如表1所示：表1初篩結(jié)果菌種號(hào)直徑(mm)提升率(％)Ap15-10114.750Ap16-1717.7020.0Ap16-2918.2523.7Ap16-6918.9528.5Ap16-7719.2530.5Ap16-9920.0535.9Ap16-13419.7533.9Ap16-15717.8521.0Ap16-17718.1523.1Ap16-19918.9528.5Ap16-21119.0028.8Ap16-23618.2523.7Ap16-26918.5525.8初篩共計(jì)239個(gè)單菌落，提高幅度從高至低排序，選取12個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落，具體結(jié)果如上表，進(jìn)行復(fù)篩。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株46株，正向突變率為19.2％。復(fù)篩：分別從對(duì)應(yīng)菌號(hào)的12支斜面上挖下0.5～1.0cm2的孢子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度36～38℃的條件下培養(yǎng)144h，測(cè)定效價(jià)，挑選出1支效價(jià)明顯提高的菌株，最高效價(jià)達(dá)到8500U/mL，較出發(fā)菌株6000U/mL，提升幅度達(dá)到41.7％，復(fù)篩結(jié)果如表2所示：表2復(fù)篩結(jié)果選取提升幅度最高的Ap16-99進(jìn)行菌種保藏并進(jìn)行穩(wěn)定性考察。連續(xù)傳代：將1支效價(jià)高的菌株用接種針傳F1代，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7天，挖塊接種發(fā)酵瓶，相同條件下培養(yǎng)144h測(cè)定效價(jià)；重復(fù)上述操作分別驗(yàn)證F2、F3、F4、F5搖瓶能力,確認(rèn)新選菌株搖瓶能力穩(wěn)定，對(duì)新選菌株Ap16-99進(jìn)行了菌種保藏。穩(wěn)定性考察：將Ap16-99菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?，得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察，經(jīng)過5代考察，新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定,說明本方法篩選的菌株其有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)8390，F(xiàn)2效價(jià)8257，F(xiàn)3效價(jià)8669，F(xiàn)4效價(jià)8450，F(xiàn)5效價(jià)8299。安普霉素效價(jià)測(cè)定方法：安普霉素效價(jià)采用生物效價(jià)測(cè)定法。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量于100ml容量瓶中，用無鹽水定容，制成濃度為1000U/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取1000U/ml的溶液2ml于100ml容量瓶中，加無菌水定容制成20U/ml的溶液。分別吸取20U/ml的溶液4.55、5.70、7.15、8.95、10.12、14.00、17.50、21.85ml于100ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液(pH7.8)定容制成0.91、1.14、1.43、1.79、2.24、2.80、3.50、4.37U/ml的溶液。在恒溫室36～38℃培養(yǎng)17小時(shí)，量取抑菌圈直徑，以直徑為橫坐標(biāo)，以濃度為縱坐標(biāo)，求斜率，作為發(fā)酵液生物效價(jià)測(cè)定時(shí)的參數(shù)，以濃度(C)對(duì)直徑(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為C＝KA+b，求出斜率K。發(fā)酵液的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取合適體積安普霉素發(fā)酵液濾液于50ml容量瓶中，使用pH7.8的緩沖液定容，配制成2U/ml的樣品溶液，吸取合適體積的上述標(biāo)品溶液于50ml瓶中，使用pH7.8的緩沖液定容，制成2U/ml的標(biāo)品溶液。采用一劑量法測(cè)定效價(jià)：取制備好的雙碟，每份供試品用1只雙碟，在間隔的3個(gè)不銹鋼小鋼管中滴裝供樣品溶液，其余3個(gè)小鋼管滴裝標(biāo)準(zhǔn)品溶液，滴完后，蓋好陶瓦蓋，在恒溫室36～38℃培養(yǎng)16～18小時(shí)。取出雙碟，測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)，并計(jì)算效價(jià)。效價(jià)P(U/ml)＝P0×antlg[(T-S)/3×K]式中：P0供試品估計(jì)效價(jià)；K為斜率標(biāo)準(zhǔn)品所致抑菌圈直徑之和S＝S1+S2+S3供試品所致抑菌圈直徑之和T＝T1+T2+T3實(shí)施例2：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；取0.5mL黑暗鏈霉菌孢子懸液涂布于空白平板內(nèi)，使用無菌風(fēng)吹干，制備黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用；(2)將黑暗鏈霉菌菌膜在80×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入完成后在15W紫外燈管、距離30cm情況下照射30s，照射完成后取2ml無菌水加入誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36～38℃條件下培養(yǎng)8天，挑選單菌落239個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1。初篩結(jié)果如表3所示，239個(gè)單菌落中選取15個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落。表3初篩結(jié)果菌種號(hào)直徑(mm)提升率(％)Ap15-10115.000Ap16-24420.1534.3Ap16-26619.9533.0Ap16-26718.9526.3Ap16-30019.2528.3Ap16-31120.1534.3Ap16-31620.2535.0Ap16-32619.6531.0Ap16-34420.2034.7Ap16-36620.0533.7Ap16-36921.2541.7Ap16-37621.0040.0Ap16-40621.3542.3Ap16-43619.8532.3Ap16-46919.5530.3Ap16-47022.2548.3經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株40株，正向突變率為16.7。將15支提高幅度高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表4復(fù)篩結(jié)果由表4可以看出，Ap16-470效價(jià)幅度提升最明顯，效價(jià)達(dá)到9400，提升幅度為52.5％，Ap16-470進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-470菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察,新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定,說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)9000U/ml，F(xiàn)2效價(jià)9250U/ml，F(xiàn)3效價(jià)9300U/ml，F(xiàn)4效價(jià)9450U/ml，F(xiàn)5效價(jià)9000U/ml。實(shí)施例3：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；取0.5mL黑暗鏈霉菌孢子懸液涂布于空白平板內(nèi)，使用無菌風(fēng)吹干，制備多個(gè)黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用。(2)將黑暗鏈霉菌菌膜在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入完成后在15W紫外燈管、距離28cm情況下照射28s，照射完成后取2ml無菌水加入誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36～38℃條件下培養(yǎng)7天，挑選單菌落239個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1。初篩結(jié)果如表5所示，239個(gè)單菌落中選取10個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落。表5初篩結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株43株，正向突變率為18.0％。將10支較高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表6復(fù)篩結(jié)果菌種號(hào)效價(jià)(U/ml)提升率(％)Ap15-10161000Ap16-499865041.8Ap16-503777927.5Ap16-566926651.9Ap16-577874243.3Ap16-601900047.5Ap16-634789029.3Ap16-666865041.8Ap16-6771000063.9Ap16-699976060.0Ap16-711992641.8由上表可以看出，Ap16-677提升最明顯，效價(jià)達(dá)到10000U/ml，選取Ap16-677進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-677菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察,新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定,說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)9600U/ml，F(xiàn)2效價(jià)9926U/ml，F(xiàn)3效價(jià)9850U/ml，F(xiàn)4效價(jià)9000U/ml，F(xiàn)4效價(jià)9630U/ml。對(duì)比例1：一種選育方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；(2)將步驟(1)制得的黑暗鏈霉菌孢子懸液，取10ml加入帶轉(zhuǎn)子的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放入紫外誘變箱，開啟紫外燈，距離15cm，照射30s，照射液逐步稀釋至10-6，取每個(gè)梯度誘變稀釋液0.1ml涂平板放置于溫度36-38℃條件下培養(yǎng)8天，挑選單菌落239，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1，初篩結(jié)果如下：表7初篩結(jié)果菌種號(hào)直徑(mm)提升率(％)Ap15-10114.750Ap16-72917.0015.3Ap16-79616.4511.5Ap16-80115.555.4Ap16-86616.008.5Ap16-87916.159.5Ap16-89615.958.1Ap16-90615.857.5Ap16-93615.706.4Ap16-94015.152.7Ap16-95415.253.4經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株26株，正向突變率為10.9％。將10支效價(jià)較高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表8復(fù)篩結(jié)果菌種號(hào)效價(jià)(U/ml)提升率(％)Ap15-10162500Ap16-729700012.0Ap16-796725016.0Ap16-801710013.6Ap16-866695011.2Ap16-879695611.3Ap16-89663291.3Ap16-90664353.0Ap16-93665084.1Ap16-94064693.5Ap16-95466496.4由上表可以看出，Ap16-796效價(jià)幅度提升較明顯，效價(jià)達(dá)到7250U/ml，提升幅度為16.0％，選取，Ap16-796進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-796菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察,新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定,說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)7000U/ml，F(xiàn)2效價(jià)7100U/ml，F(xiàn)3效價(jià)7300U/ml，F(xiàn)4效價(jià)7200U/ml，F(xiàn)5效價(jià)7300U/ml。對(duì)比例2：一種選育方法，步驟如下：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；將黑暗鏈霉菌孢子懸液取0.5mL涂布在空白平板內(nèi)，使用無菌風(fēng)吹干，制備多個(gè)黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用。(2)將黑暗鏈霉菌菌膜在100×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入完成后在15W紫外燈管、距離30cm情況下照射30s,照射完成后取2ml無菌水加入誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36-38℃條件下培養(yǎng)8天，挑選單菌落49個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入500ml發(fā)酵瓶中，搖瓶培養(yǎng)，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1。初篩結(jié)果如表9所示，49個(gè)單菌落中選取3個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落。其他步驟同實(shí)施例1。對(duì)比例2選取49個(gè)單菌落進(jìn)行初篩，初篩結(jié)果如下：表9初篩結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株6株，正向突變率為12.2％。將3支效價(jià)較高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表10復(fù)篩結(jié)果由上表可以看出，Ap16-996效價(jià)幅度提升較明顯，效價(jià)達(dá)到8100U/ml，提升幅度為33.6％，選取Ap16-996進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-996菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察，新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定，說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)8000U/ml，F(xiàn)2效價(jià)7965U/ml，F(xiàn)3效價(jià)8225U/ml，F(xiàn)4效價(jià)8742U/ml，F(xiàn)5效價(jià)8200U/ml。對(duì)比例3一種選育方法，步驟如下：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；將黑暗鏈霉菌孢子懸液取0.5mL涂布在空白平板內(nèi)，使用無菌風(fēng)吹干，制備多個(gè)黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用。(2)將黑暗鏈霉菌菌膜在15W紫外燈管、距離30cm情況下照射30s,照射完成后在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入成后取2ml無菌水加入誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36-38℃條件下培養(yǎng)8天，挑選單菌落239個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1。初篩結(jié)果如表11所示，239個(gè)單菌落中選取6個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落。其他步驟同實(shí)施例1。對(duì)比例3選取239個(gè)單菌落進(jìn)行初篩，初篩結(jié)果如下：表11初篩結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株21株，正向突變率為8.79％。將6支效價(jià)較高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表12復(fù)篩結(jié)果由上表可以看出，Ap16-1154效價(jià)幅度提升較明顯，效價(jià)達(dá)到7600U/ml，提升幅度為26.7％，選取Ap16-1154進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-1154菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察，新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定，說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)7800U/ml，F(xiàn)2效價(jià)7965U/ml，F(xiàn)3效價(jià)8000U/ml，F(xiàn)4效價(jià)8100U/ml，F(xiàn)5效價(jià)7900U/ml。對(duì)比例4一種選育方法，步驟如下：一種獲取安普霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，步驟如下：(1)取黑暗鏈霉菌Ap15-101生產(chǎn)斜面一支，在超凈臺(tái)下向斜面內(nèi)加入100mL無菌水，將斜面孢子刮下，轉(zhuǎn)入250mL滅過菌的三角瓶中，向里加入適量滅過菌的玻璃珠，放置于搖床上震蕩30min，將孢子液打碎，使用含有滅菌濾紙的漏斗過濾，得黑暗鏈霉菌孢子懸液；將黑暗鏈霉菌孢子懸液取0.4mL涂布在空白平板內(nèi)，并加入0.1ml的0.5％氯化鋰溶液，混勻，使用無菌風(fēng)吹干，制備多個(gè)黑暗鏈霉菌菌膜以備誘變使用。(2)將黑暗鏈霉菌菌膜在90×2.6×1014ions/(cm2·s)的脈沖劑量下進(jìn)行氮離子注入，注入成后取2ml無菌水加入誘變后的菌膜上洗滌，取洗滌液0.1ml涂平板放置于溫度36-38℃條件下培養(yǎng)8天，挑選單菌落239個(gè)，對(duì)照一個(gè)，接入含發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，共接10個(gè)孔板，同步傳斜面，做好菌落編號(hào)。其他步驟同實(shí)施例1。初篩結(jié)果如表12所示，239個(gè)單菌落中選取5個(gè)明顯高于對(duì)照的單菌落。其他步驟同實(shí)施例1。對(duì)比例4選取239個(gè)單菌落進(jìn)行初篩，初篩結(jié)果如下：表13初篩結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，正向突變菌株19株，正向突變率為7.95％。將5支效價(jià)較高的單菌落斜面，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)完成后測(cè)定效價(jià)，結(jié)果如下表：表14復(fù)篩結(jié)果由上表可以看出，Ap16-1319效價(jià)幅度提升較明顯，效價(jià)達(dá)到7995U/ml，提升幅度為33.3％，選取Ap16-1319進(jìn)行菌種保藏，并進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察：將Ap16-1319菌種進(jìn)行斜面?zhèn)鞔?得到的各子代斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵能力考察,經(jīng)過5代考察，新篩選菌株遺傳能力穩(wěn)定，說明本方法篩選的菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代五次，驗(yàn)證發(fā)酵效價(jià)為：F1效價(jià)8000U/ml，F(xiàn)2效價(jià)7965U/ml，F(xiàn)3效價(jià)8100U/ml，F(xiàn)4效價(jià)8000U/ml，F(xiàn)5效價(jià)8200U/ml。結(jié)果分析由上述實(shí)施例1～3和對(duì)比例1和對(duì)比例4的數(shù)據(jù)可以看出，低能離子束和紫外復(fù)合誘變黑暗鏈霉菌，顯著提高正突變率，且遺傳性能穩(wěn)定；由實(shí)施例1～3和對(duì)比例2的數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)脈沖劑量超過本發(fā)明所保護(hù)的范圍后，正突變率會(huì)顯著下降；由實(shí)施例1～3和對(duì)比例2的數(shù)據(jù)可以看出，低能離子束和紫外復(fù)合誘變二者的順序也會(huì)對(duì)正突變率產(chǎn)生顯著的影響。當(dāng)前第1頁1 2 3