本專利主要用于臍帶間充質(zhì)干細胞制劑的質(zhì)量控制，并可為相關(guān)研究提供評估細胞遷移能力的方法，尤其是一種用于篩選強遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式試劑盒。
背景技術(shù)：
：臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSC,umbilicalcordmesenchymalstemcells)是間充質(zhì)干細胞家族的重要成員，屬于多能干細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞具有較高的分化潛能，可向軟骨、脂肪、內(nèi)皮等多個方向分化，并具有一定的免疫調(diào)控作用，此外，UC-MSC與廣為人知的骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC，bonemarrowmesenchymalstemcells)相比，具有來源豐富、制備簡單等優(yōu)點。目前，UC-MSC制劑在骨關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等疾病的治療中均展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景，CFDA也于2015年8月21日發(fā)布了《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》。根據(jù)《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》中“干細胞制劑的質(zhì)量控制—干細胞制劑的檢驗—細胞檢驗”所述，應(yīng)對細胞表面標(biāo)志物進行純度檢測，以確保干細胞治療的安全性和有效性。然而，實踐表明通過流式細胞術(shù)檢測得到相近純度的不同細胞樣本，卻在遷移能力等方面存在較大差異，這將直接影響制劑的有效性。此外，考慮到干細胞制劑涉及到臨床應(yīng)用，最大限度保障患者人身安全更是純度檢測過程中的重中之重。因此確立一套更為精準(zhǔn)有效且能反應(yīng)細胞制劑安全性與有效性的細胞表面標(biāo)志物檢測方法已成為業(yè)內(nèi)公認的難題。目前業(yè)內(nèi)普遍采用P2-P5代臍帶間充質(zhì)干細胞用于臨床前研究，實踐表明每根臍帶經(jīng)剪切分離法平均僅可獲得約1.98*107的P1代臍帶間充質(zhì)干細胞，因此降低質(zhì)量控制過程中對細胞樣本的消耗顯得尤為重要。然而通過流式細胞術(shù)的方法對UC-MSC的表面標(biāo)志物進行檢測時，需滿足以下多種條件方能保證檢查的準(zhǔn)確度。首先，目前業(yè)內(nèi)公認的最優(yōu)檢測體系為每管含0.5mL密度為1*106的細胞樣本，檢測管數(shù)由需要檢測的表面標(biāo)志物種類決定；其次，考慮到使用不同熒光染料進行多色標(biāo)記時，發(fā)射光會溢漏至其他檢測通道中，需要使用單色光對照管和FMO對照管以獲得準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)；若使用單色染料進行檢測，由于臍帶間充質(zhì)干細胞的特性，需檢測多種陽性表面標(biāo)志物，同樣會導(dǎo)致樣本管數(shù)增加，造成樣本損失。此外，考慮到目前流式細胞儀的市場應(yīng)用情況，目前主流的流式細胞儀的配置多為488nm和633nm雙波長激發(fā)光，除兩個散射光檢測通道外，一般只配備4-8個發(fā)射光檢測通道。總的來說，如何在控制細胞樣本消耗量和保證檢測精度之間找到平衡點，設(shè)計出一套適用于主流流式細胞儀的實驗方案成為了臍帶間充質(zhì)干細胞純度檢測的一大難點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種用于篩選具有較強遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式檢測試劑盒。本發(fā)明通過對檢測方法進行優(yōu)化，從而使檢測結(jié)果與細胞樣本的遷移能力與有效性直接關(guān)聯(lián)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于篩選具有較強遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式檢測試劑盒，試劑盒組成：具體說明如下：⑴StandardMixture：將ZPH-MMA30K型30微米標(biāo)準(zhǔn)微球溶于1.5mL蒸餾水，與F-13838型15微米標(biāo)準(zhǔn)微球相混合，超聲處理30s后振蕩混勻，存放于4℃條件下，得到StandardMixture；⑵IsotypeMixture：將350μL的PE-IgG1k(554680)抗體、250μL的APC-IgG1k(554681)抗體、1150μL的FITC-IgG1k(555748)抗體、250μL的PerCP-Cy5.5-IgG1k(550795)抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到IsotypeMixture；⑶PositiveMixture：將295μL的PE-CD105(560839)抗體、295μL的APC-CD73(560847)抗體、115μL的FITC-CD90(555595)抗體、295μL的PerCP-Cy5.5-CD166(562131)抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到PositiveMixture；⑷NegativeMixture：將240μL的FITC-CD11b(562793)抗體、952μL的PE-CD34/FITC-HLA-DR(333181)抗體、952μL的PE-CD45(555483)抗體、952μL的PE-CD19(555413)抗體、952μL的PE-CD80(557227)抗體、952μL的PE-CD86(560957)抗體相混合，避光存放于4℃條件下。而且，操作步驟如下：(1)取1.5*106量的臍帶間充質(zhì)干細胞樣本，經(jīng)離心、洗滌，用PBS重懸后制成密度為5*106cells/mL的細胞懸液A；(2)取4支一次性流式上樣管，分別命名為STD管、ISO管、POS管、NEG管；(3)向STD管加入0.5mLPBS，向ISO管、POS管、NEG管分別加入100μL細胞懸液A；(4)向ISO管、POS管、NEG管分別加入20μLIsotypeMixture、10μLPositiveMixture、50μLNegativeMixture，在15℃條件下避光孵育30min；(5)向ISO管、POS管、NEG管均加入2mLPBS，在15℃條件下200g離心3min后去除上清液，重復(fù)本步驟2次；(6)將StandardMixture超聲處理30s后振蕩混勻后取25μL加入至STD管，向ISO管、POS管、NEG管分別加入500μLPBS，將STD管、ISO管、POS管、NEG管振蕩混勻；(7)依照STD管、ISO管、POS管、NEG管的順序上機檢測。本發(fā)明具有的有益效果：本發(fā)明通過檢測更多種有實際意義的細胞表面標(biāo)志物，從而最大限度的保障臨床患者的安全。本發(fā)明在不影響準(zhǔn)確度且不減少標(biāo)志物種類的前提下減少檢測細胞表面標(biāo)志物過程中對細胞樣本的消耗量。本發(fā)明在不影響準(zhǔn)確度且不減少標(biāo)志物種類的前提下通過優(yōu)化實驗方案降低對儀器設(shè)備的要求。本發(fā)明通過設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)“Gate”和增加檢測CD166使檢測結(jié)果直接與細胞遷移能力與有效性相關(guān)聯(lián)；本發(fā)明確保多種免疫排斥相關(guān)的細胞表面標(biāo)志物如CD80\CD86為陰性，從而保證臨床患者人身安全；本發(fā)明減少了檢測細胞表面標(biāo)志物的過程中對細胞樣本的消耗量。附圖說明圖1為不同樣本遷移能力比較示意圖；圖2為SAM2中STD-FSC/SSC散點圖；圖3為SAM2中ISO-FSC/SSC散點圖；圖4為SAM2中ISO-PE/FITC散點圖；圖5為SAM2中ISO-PerCP-Cy5.5/APC散點圖；圖6為SAM2中POS-PE/FITC散點圖；圖7為SAM2中POS-PerCP-Cy5.5/APC散點圖；圖8為SAM2中NEG-PE/FITC散點圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明通過15μm和30μm標(biāo)準(zhǔn)直徑的微球來輔助設(shè)定FSC-SSC圖中需要采集熒光信號的區(qū)域，即業(yè)內(nèi)稱呼的“Gate”；增加了對于CD166、CD86、CD80的檢測；使用了PE-CD105、APC-CD73、FITC-CD90、PerCP-Cy5.5-CD166的PositiveMixture及FITC-CD11b、PE-CD34、PE-CD45、PE-CD19、PE-CD80、PE-CD86、FITC-HLA-DR的NegativeMixture；StandardMixture、IsotypeMixture、PositiveMixture、NegativeMixture的配方；進行檢測時的實驗步驟及數(shù)據(jù)處理方法，包括但不限于各種試劑與樣本管之間的滴加關(guān)系、純度計算方式、如何通過標(biāo)準(zhǔn)微球來設(shè)定信號采集區(qū)域等。一種用于篩選具有較強活性的臍帶間充質(zhì)干細胞的流式檢測試劑盒，具體說明如下：一、試劑盒組成：1.StandardMixture：將ZPH-MMA30K型標(biāo)準(zhǔn)微球溶于1.5mL蒸餾水，與F-13838型15微米標(biāo)準(zhǔn)微球相混合，超聲處理30s后振蕩混勻，存放于4℃條件下，得到StandardMixture(共2.5mL，100tests，25μL/test)；2.IsotypeMixture：將350μL的554680抗體、250μL的554681抗體、1150μL的555748抗體、250μL的550795抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到IsotypeMixture(各組分品牌均為BD，共2mL，100tests，20μL/test)；3.PositiveMixture：將295μL的560839抗體、295μL的560847抗體、115μL的555595抗體、295μL的562131抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到PositiveMixture(各組分品牌均為BD，共1mL，100tests，10μL/test)；4.NegativeMixture：將240μL的562793抗體、952μL的333181抗體、952μL的555483抗體、952μL的555413抗體、952μL的557227抗體、952μL的560957抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到NegativeMixture(各組分品牌均為BD，共5mL，100tests，50μL/test)。二、實驗步驟1、取1.5*106量的臍帶間充質(zhì)干細胞樣本，經(jīng)離心、洗滌，用PBS重懸后制成密度為5*106cells/mL的細胞懸液A；2、取4支一次性流式上樣管，分別命名為STD管、ISO管、POS管、NEG管；3、向STD管加入0.5mLPBS，向ISO管、POS管、NEG管分別加入100μL細胞懸液A；4、向ISO管、POS管、NEG管分別加入20μLIsotypeMixture、10μLPositiveMixture、50μLNegativeMixture，在15℃條件下避光孵育30min；5、向ISO管、POS管、NEG管均加入2mLPBS，在15℃條件下200g離心3min后去除上清液，重復(fù)本步驟2次；6、將StandardMixture超聲處理30s后振蕩混勻后取25μL加入至STD管，向ISO管、POS管、NEG管分別加入500μLPBS，將STD管、ISO管、POS管、NEG管振蕩混勻；7、依照STD管、ISO管、POS管、NEG管的順序上機檢測。三、數(shù)據(jù)處理1.以BD-Diva7.0系統(tǒng)為例，首先檢測STD管，設(shè)立FSC/SSC散點圖(圖2)，調(diào)整電壓至令STD管中兩群顆粒的FSC值分布于50*103-150*103之間，以FSC值為50*103-150*103，SSC值為20*103-200*103設(shè)定“Gate”為P1；2.在STD管的電壓下檢測ISO管，取P1內(nèi)高密度的區(qū)域為P2(圖3)，在P2下創(chuàng)建PE/FITC散點圖(圖4)和PerCP-Cy5.5/APC散點圖(圖5)，調(diào)整電壓將細胞群的熒光強度控制于3*103左右；3.在上述電壓下檢測POS管，調(diào)節(jié)單色光補償后，分別記錄PE/FITC散點圖(圖6)中雙陽性區(qū)域的數(shù)值為A1，PerCP-Cy5.5/APC散點圖(圖7)中全部APC陽性區(qū)域的數(shù)值為A2，PerCP-Cy5.5/APC散點圖中全部PerCP-Cy5.5陽性區(qū)域的數(shù)值為A3；4.在上述電壓下檢測NEG管，記錄PE/FITC散點圖(圖8)中雙陽性區(qū)域的數(shù)值為A4。四、數(shù)據(jù)分析與參考標(biāo)準(zhǔn)1、活性計算公式為：活性％＝[P1*P2*(100-A4)*A1*A2*A3]％(注：此公式中，若Pn/An的值為X％，運算時直接采用X來計算)1.判定標(biāo)準(zhǔn)為：①若活性大于70％，且A4小于2％，且A1*A2大于95％，則判定該細胞樣本為合格；②若活性小于70％，或A4大于2％，或A1*A2小于95％，則判定該細胞樣本為不合格。五、實驗舉例及結(jié)果驗證1.選取三例典型樣本分別命名為SAM1、SAM2、SAM3，檢測數(shù)據(jù)如下：樣本號P1P2A1A2A3A4活性SAM186.9％91.6％96.9％99.2％98.7％1.2％74.61％SAM271.4％86.8％97.2％98.9％96.7％1.0％57.03％SAM384.2％88.3％97.3％99.0％82.3％1.2％58.23％2.通過細胞遷移實驗驗證細胞活性，結(jié)果如下(結(jié)果比較見附圖1)：當(dāng)前第1頁1 2 3