本發(fā)明涉及免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

呋喃類(lèi)是人工合成的一類(lèi)共有5-硝基呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、部分真菌都具有抗菌效果。因價(jià)格低廉，被廣泛地應(yīng)用在畜禽和魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中，用于治療由沙門(mén)氏桿菌、大腸桿菌引起的腸炎，球蟲(chóng)病等，并且常作為畜牧動(dòng)物以及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的生長(zhǎng)促進(jìn)劑被添入飼料中。硝基呋喃類(lèi)主要包括：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。但在食品安全中，呋喃唑酮的大量或連續(xù)使用不僅對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有毒性作用，而且具有致癌、致畸、致突變作用，其代謝物還對(duì)人類(lèi)健康有惡性影響。因此，許多國(guó)家已經(jīng)明令禁止在飼養(yǎng)動(dòng)物源性食品過(guò)程中使用呋喃唑酮，并規(guī)定了在動(dòng)物源性食品中的檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)。

目前用于檢測(cè)呋喃唑酮及其代謝物的方法主要有傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如分光光度法、高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)等，以上方法雖然可以精確定量，但由于設(shè)備儀器昂貴，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且需專(zhuān)業(yè)人員操作，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正意義上的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；以及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，此方法具有高特異性和高選擇性的特點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜基質(zhì)痕量組分的分離或檢測(cè)，隨著學(xué)科間的相互滲透，其檢測(cè)方法層出不窮，應(yīng)用范圍亦日益擴(kuò)大，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、快速、技術(shù)要點(diǎn)低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。免疫分析檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)在環(huán)境及食品檢測(cè)等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種新型快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法，現(xiàn)已逐漸成為世界各國(guó)有毒有害殘留物快速篩選檢測(cè)的主要方法之一，也為呋喃唑酮的檢測(cè)提供了新的途徑。

雖然呋喃唑酮代謝物本身具有活性基團(tuán)，但是，由于其分子量較小，空間結(jié)構(gòu)不突出，直接制備的人工抗原存在靈敏度低的重大不足，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)有市場(chǎng)的需求。因此需先通過(guò)化學(xué)方法設(shè)計(jì)出其半抗原，再進(jìn)一步與載體蛋白結(jié)合獲得具有免疫原性的完全抗原。

其中，在發(fā)明專(zhuān)利號(hào)為CN200910085648.2的專(zhuān)利文件中，其檢測(cè)的目標(biāo)物為呋喃唑酮原料藥，但是，由于呋喃唑酮進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后會(huì)代謝為AOZ，而AOZ又對(duì)人體有巨大的傷害，因此只檢測(cè)呋喃唑酮原料藥存在重大缺陷，無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)要求。

另外，在發(fā)明專(zhuān)利號(hào)為CN200810052028.4和CN201210100649.1的專(zhuān)利文件中，其設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)均無(wú)法保留其待測(cè)目標(biāo)物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。

再者，在發(fā)明專(zhuān)利號(hào)為CN200910085645.9的專(zhuān)利文件中，其設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)雖然也保留了硝基端，但半抗原的手臂是內(nèi)酯類(lèi)結(jié)構(gòu)，存在穩(wěn)定性差的缺陷，無(wú)法滿(mǎn)足生產(chǎn)要求。同時(shí)半抗原與AOZ之間是通過(guò)酰胺鍵連接，與苯環(huán)不共軛，使半抗原的電子云密度與檢測(cè)的目標(biāo)物差異大，降低了靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服傳統(tǒng)的AOZ半抗原無(wú)法完整保留競(jìng)爭(zhēng)物的特征結(jié)構(gòu)，提供一種呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應(yīng)用，其可保留競(jìng)爭(zhēng)物硝基端的半抗原，人工抗原，提高競(jìng)爭(zhēng)物的特異性。

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的半抗原，為如下結(jié)構(gòu)式Ⅲ：

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的半抗原的制備方法，步驟如下：

(a)將化合物Ⅰ溶解于乙醇中，所得溶液通過(guò)添加6mol/L的氫氧化鋰溶液將PH值調(diào)至10-11，反應(yīng)獲得化合物Ⅱ；所述化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)式為：

所述化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)式為：

(b)將所述化合物Ⅱ與呋喃唑酮代謝物AOZ在甲醇條件下反應(yīng)，既得所述呋喃唑酮代謝物的半抗原；為如下結(jié)構(gòu)式Ⅲ：

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的半抗原的制備方法，步驟如下：

(a’)將化合物Ⅰ溶于乙醇中，所得溶液通過(guò)加入6mol/L的氫氧化鋰溶液將PH值調(diào)至10-12，室溫反應(yīng)15～26h，加入純化水，所得溶液用1M的稀鹽酸將PH值調(diào)至4-5，過(guò)濾，得到化合物Ⅱ，所述化合物Ⅰ反應(yīng)生成所述化合物Ⅱ的過(guò)程如下：

(b’)將所述化合物Ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩爾當(dāng)量的呋喃唑酮代謝物AMOZ，在60～70℃反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢，過(guò)濾，既得所述呋喃唑酮代謝物的半抗原；所述半抗原的結(jié)構(gòu)式III及其合成路線(xiàn)如下：

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的人工抗原，是載體蛋白與所述呋喃唑酮代謝物的半抗原偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)式IV如下：

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的的人工抗原的制備方法，步驟如下：

(1)取所述呋喃唑酮代謝物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌充分后，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中，所述半抗原、碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌4-8h，既得半抗原活化酯；

(2)稱(chēng)取載體蛋白，所述載體蛋白與半抗原的摩爾當(dāng)量比為30：1，使所述載體蛋白充分溶解在0.01mol/L的PBS溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載蛋白溶液中，并在室溫下攪拌，16-24h；

(3)將步驟(2)所得溶液通過(guò)0.01mol/L的PBS溶液室溫透析3天，每天換3次透析液；

(4)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)或血藍(lán)蛋白(KLH)中的任意一種。

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，一種呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體的制備方法，步驟如下：

(i)以呋喃唑酮代謝物的人工抗原為免疫原，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫BALB/C小鼠；每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次；

(ii)采步驟(i)處理后的小鼠尾部靜脈血檢測(cè)血清效價(jià)，如抗體效價(jià)不達(dá)60000，需加強(qiáng)免疫，待抗體效價(jià)不再升高后，以100μg免疫原進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫，5天后取小鼠脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞融合；

(iii)融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中篩選，5天后以完全培養(yǎng)基替換成HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

(iv)用ELISA對(duì)步驟(iii)處理后的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)，經(jīng)3次克隆培養(yǎng)檢測(cè)后，均呈陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；

(v)將所述雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)后，接種至小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，既得呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體。

所述制備方法可得到高純度、高特異性的單克隆抗體，所述單克隆抗體在檢測(cè)水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物殘留分析中應(yīng)用。

本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的另一技術(shù)方案是，呋喃唑酮代謝物的人工抗原和呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體在檢測(cè)呋喃唑酮代謝物AOZ中的應(yīng)用，包括如下步驟：將所述的人工抗原作為包被原包被在酶標(biāo)板上，將所述呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體加入微孔板中；采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)待檢樣本中呋喃唑酮代謝物AOZ的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下積極效果：傳統(tǒng)方案的AOZ半抗原結(jié)構(gòu)均無(wú)法保留待測(cè)物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。本發(fā)明中提供了一種新型AOZ衍生物半抗原，以及基于該半抗原制備的一種人工抗原，闡述了兩者的制備方法與應(yīng)用。其思路是將AOZ衍生化，獲得具有活性基團(tuán)和雙鍵剛性支撐手臂的衍生物，同時(shí)還完整的保留了AOZ衍生物的特征結(jié)構(gòu)，對(duì)其電子云密度無(wú)影響，同時(shí)為了增強(qiáng)半抗原的免疫原性制備出高質(zhì)量的抗體，該抗體可以特異性識(shí)別AOZ衍生物。

該思路的有益效果體現(xiàn)在：(1)引入具有剛性支撐作用的雙鍵手臂，使得AOZ的結(jié)構(gòu)特征明顯增強(qiáng)，利于決定簇的良好呈現(xiàn)；(2)制備的半抗原完整的保留了AOZ衍生物的特征結(jié)構(gòu)，對(duì)其電子云密度無(wú)影響，使得小分子半抗原的免疫原性明顯增強(qiáng)，有利于刺激動(dòng)物免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的抗體；(3)本發(fā)明提供的AOZ的快速檢測(cè)方法最低檢測(cè)限可達(dá)0.05ng/g。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的呋喃唑酮代謝物的半抗原的合成路線(xiàn)。

圖2是本實(shí)施例1中化合物Ⅱ的ESI-MS圖譜。

圖3是本實(shí)施例1中化合物Ⅱ的核磁共振氫譜圖譜。

圖4是本實(shí)施例1中呋喃唑酮代謝物的半抗原的ESI-MS圖譜。

圖5是本實(shí)施例1中呋喃唑酮代謝物的半抗原的核磁共振氫譜圖譜。

圖6是本實(shí)施例4中的呋喃唑酮代謝物的的人工抗原為免疫原制備的抗體建立的對(duì)AOZ衍生物的抑制曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

如圖1-圖5所示，本實(shí)施例1的呋喃唑酮代謝物AOZ衍生化半抗原通過(guò)以下方法制備，步驟如下：

(a)將2.0g(即7.1mmol)的化合物Ⅰ溶于10ml乙醇中，加入6mol/L的氫氧化鋰溶液將化合物Ⅰ的乙醇溶液的PH值調(diào)至10-12，室溫反應(yīng)15～26h，然后加入40ml純化水，所得溶液通過(guò)1M的稀鹽酸將PH值調(diào)至4～5，過(guò)濾，烘干得到1.1g化合物Ⅱ。

ESI-MS：167[M-CH2CH2CH2COOH-1]，252[M-1]，288[M+2H2O-1]，315[2×167-H2O-1]，505[2M-1]，537[2M+MeOH-1]；

1H NMR(600MHz，CDCl₃，TMS)：δ10.50(s，1H)，8.20(d，1H)，7.35(d，1H)，7.15-7.19(dd，1H)，4.23(t，2H)，2.66(t，2H)，2.26(m，2H)。

(b)將0.5g(即2.0mmol)的化合物Ⅱ溶解于10ml甲醇中，加入0.24g(即2.4mmol)的呋喃唑酮代謝物AOZ，于60～70℃反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，過(guò)濾，得0.32g呋喃唑酮代謝物的半抗原。所述半抗原的結(jié)構(gòu)式III及其合成路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

ESI-MS：338[M+1]；

1H NMR(600MHz，DMSO，TMS)：δ12.16(s，1H)，8.18(s，1H)，8.16(d，1H)，7.39(d，1H)，7.23(dd，1H)，4.55(m，2H)，4.19(t，2H)，3.98(t，2H)，2.45(t，2H)，2.04(m，2H)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2是呋喃唑酮代謝物AOZ的人工抗原，所述人工抗原包括免疫原和包被原。免疫原與包被原的不同之處在于偶聯(lián)的載體蛋白種類(lèi)，所述免疫原采用實(shí)施例1的半抗原，載體蛋白采用牛血清蛋白(BSA)；所述包被原采用實(shí)施例1的半抗原，載體蛋白采用卵清蛋白(OVA)。

本實(shí)施例2是呋喃唑酮代謝物AOZ的包被原通過(guò)以下方法制備，其步驟依次如下：

(1)取10.0mg實(shí)施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌充分后，加入8.0mgEDC和6.0mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2)稱(chēng)取30.6mg卵清蛋白(OVA)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/L的PBS溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將所述半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；

(3)步驟(2)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

(4)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例1的半抗原與卵清蛋白(OVA)的摩爾比為30：1。

本實(shí)施例2是呋喃唑酮代謝物AOZ的免疫原通過(guò)以下方法制備，其步驟依次如下：

(1’)取10.0mg實(shí)施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌充分后，加入8.0mgEDC和6.0mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2’)稱(chēng)取50.4mg牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/L的PBS溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；

(3’)步驟(2’)制得的溶液用0.01mol/L的PBS室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

(4’)分裝，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例1的半抗原與牛血清白蛋白的摩爾比為30：1。

其中，以下提及的免疫原式(Ⅲ)-BSA即本實(shí)施例2的呋喃唑酮代謝物AOZ的免疫原；包被原式(Ⅲ)-OVA即本實(shí)施例2的呋喃唑酮代謝物AOZ的包被原。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體通過(guò)以下方法制備，其步驟如下：

將實(shí)施2的免疫原式(Ⅲ)-BSA，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫BALB/C小鼠。每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部靜脈血檢測(cè)血清效價(jià)。如抗體效價(jià)不達(dá)60000，需加強(qiáng)免疫，待抗體效價(jià)不再升高后，以100μg免疫原進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫，5天后取小鼠脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中篩選，5天后以完全培養(yǎng)基替換成HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用ELISA對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)，經(jīng)3次克隆培養(yǎng)檢測(cè)后，均呈陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)后，接種至小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即可得到高純度、高特異性的單克隆抗體。

ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗體陽(yáng)性滴度以3倍于陰性血清的測(cè)定值為準(zhǔn)，結(jié)果表明包被原式(Ⅲ)-OVA對(duì)應(yīng)的抗血清(Ab-式(Ⅲ))效價(jià)為1：81000。

實(shí)施例4

單克隆抗體的特異性及靈敏度。

4.1酶標(biāo)板的制備方法

用PH9.6的碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將實(shí)施例2的式(Ⅲ)-OVA稀釋至0.2μg/ml，按100μL/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過(guò)夜，甩干，按250μL/孔加入含1％BSA，磷酸鹽緩沖液中37℃封閉1h，甩干，干燥后真空包裝保存。

4.2抗體的配制

用含0.05％疊氮鈉，PH7.4的磷酸鹽緩沖液，將實(shí)施例3的單克隆抗體稀釋至0.05μg/ml，4℃保存。

4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液為精確稱(chēng)量呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物標(biāo)準(zhǔn)品10mg，先用乙腈1ml溶解，再用PH7.4的磷酸鹽緩沖液配制系列濃度為0μg/L，0.05μg/L，0.1μg/L，0.2μg/L，0.4μg/L，以及0.8μg/L的呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4.4評(píng)價(jià)結(jié)果

向包被有(Ⅲ)-OVA的微孔酶標(biāo)板中加入呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL/孔，再加入配制好的單克隆抗體溶液50μL/孔，37℃反應(yīng)0.5h；甩干后，加入洗液300μL/孔，洗滌3次后拍干；再加入酶標(biāo)二抗100μL/孔，37℃反應(yīng)0.5h；再次洗滌3次后拍干，分別加入50μL/孔的顯色液A和顯色液B，37℃反應(yīng)15min；加入2M硫酸50μL/孔終止，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的OD值。結(jié)果如表1和圖6。

表1：ELISA測(cè)試不同濃度呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物標(biāo)準(zhǔn)品OD值

其中，B/B0是指不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試孔OD值與含量為0的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試孔OD值的比值。從表1中可看出，當(dāng)呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物含量為0.05μg/L時(shí)，其B/B0值為73.17％，說(shuō)明其檢測(cè)OD與含0μg/L濃度的呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物測(cè)試孔OD值有明顯差異，故ELISA對(duì)呋喃唑酮代謝物AOZ的衍生物檢測(cè)靈敏度均可達(dá)0.05μg/L。

以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例所提供的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的原理以及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只適用于幫助理解本發(fā)明實(shí)施例的原理；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，在具體實(shí)施方式以及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。