本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種單堿基突變檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

基因突變，特別是單堿基突變檢測(cè)技術(shù)對(duì)疾病的早期診斷和用藥策略有著重要的意義。在精準(zhǔn)醫(yī)療的背景下，基因突變檢測(cè)已成為一項(xiàng)重要的臨床檢驗(yàn)指標(biāo)?；蛲蛔儥z測(cè)技術(shù)分為測(cè)序型技術(shù)和非測(cè)序型技術(shù)。隨著二代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing)的發(fā)展，測(cè)序的成本大幅下降，使得很多機(jī)構(gòu)都能夠?yàn)榛颊咛峁┗驕y(cè)序服務(wù)。但是二代測(cè)序技術(shù)需要的核酸濃度較高且分析時(shí)間長(zhǎng)，而且受到測(cè)序深度和核酸聚合酶本身屬性的限制，難以在臨床樣品中直接檢出低頻突變。

非測(cè)序型技術(shù)主要以核酸雜交探針為基礎(chǔ)，其分析目標(biāo)為已知突變基因的確認(rèn)和含量測(cè)定。依賴于雜交探針的非測(cè)序型技術(shù)可以與納米技術(shù)、微流控技術(shù)、熒光顯微技術(shù)等相結(jié)合，形式靈活多樣，易于發(fā)展成為臨場(chǎng)檢測(cè)方法(point of care，POC)。但是傳統(tǒng)的雜交型探針在單堿基選擇性上表現(xiàn)較差，這是由核酸雜交的熱力學(xué)障礙導(dǎo)致，即在室溫條件下，探針與野生型和單堿基突變型雜交反應(yīng)的平衡常數(shù)接近。目前，人們已經(jīng)嘗試通過(guò)勢(shì)能陷阱、核酸鏈交換、核酸酶輔助以及非天然堿基等手段提高單堿基選擇性。在動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的研究領(lǐng)域，一種新型的核酸雜交模式-核酸短暫雜交近來(lái)受到關(guān)注。這種雜交模式是指雙鏈核酸在其解鏈溫度附近呈現(xiàn)雜交與解鏈的平衡，在這種狀態(tài)下，它可以突破核酸穩(wěn)定雜交的熱力學(xué)瓶頸，對(duì)單堿基變化非常敏感，在超分辨成像和生化分析領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。在室溫條件下，一般雜交的雙鏈長(zhǎng)度為9-12個(gè)堿基。在這種情況下，完全匹配的核酸雙鏈與單堿基錯(cuò)配的核酸雙鏈存在較大的雜交動(dòng)力學(xué)差異，單堿基錯(cuò)配雙鏈的解鏈動(dòng)力學(xué)常數(shù)比完全匹配雙鏈的高20-100倍。利用核酸短暫雜交發(fā)展了一種靈敏的單分子miRNA計(jì)數(shù)方法，在非信號(hào)放大的條件下，實(shí)現(xiàn)多種miRNA標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)。核酸短暫雜交為雜交型核酸探針的發(fā)展打開了一扇新的大門，在超高靈敏度基因突變檢測(cè)方面有著巨大的應(yīng)用潛力。

生物磁珠具有生物相容性好、提供簡(jiǎn)便的分離平臺(tái)、成本低廉等特點(diǎn)，一直以來(lái)受到生物化學(xué)研究工作者的青睞，在生物分子分離富集、生化檢測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)對(duì)磁珠進(jìn)行特異性的修飾，可以選擇性的捕獲溶液中的目標(biāo)分子。例如在磁珠上修飾抗體，可以用于富集目標(biāo)蛋白；在磁珠上修飾核酸適配體，可以富集腫瘤細(xì)胞以及小分子目標(biāo)物。因此，利用磁珠的分離功能和核酸短暫雜交的特點(diǎn)，開發(fā)高靈敏度的基因突變檢測(cè)方法具有較高的可行性。

綜上所述，高靈敏度基因突變檢測(cè)方法的開發(fā)對(duì)于臨床診斷研究和基礎(chǔ)研究都有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種單堿基突變檢測(cè)方法，該方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)單堿基突變基因序列進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)突變序列具有高度的選擇性，并且能用于低豐度突變的檢測(cè)。

為此，本發(fā)明提供了一種核酸短暫雜交與磁分離相結(jié)合的單堿基突變檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

A，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)捕獲探針與信號(hào)探針；

B，將與捕獲探針偶聯(lián)的磁球配置成磁球溶液，加入信號(hào)探針和待測(cè)樣本進(jìn)行核酸雜交；

C，核酸雜交結(jié)束后進(jìn)行磁分離，然后將磁球重懸于低金屬離子的溶液中；

D，再次進(jìn)行磁分離，對(duì)獲得上清液進(jìn)行檢測(cè)，判斷待檢樣本中是否存在單堿基突變；

其中，所述捕獲探針與目標(biāo)基因的非突變部分完全互補(bǔ)；所述信號(hào)探針與目標(biāo)基因的突變型基因完全互補(bǔ)，與目標(biāo)基因的野生型基因形成單堿基錯(cuò)配；

所述信號(hào)探針的類型為熒光標(biāo)記的信號(hào)探針、富含G序列的信號(hào)探針或等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針。

根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為熒光標(biāo)記的信號(hào)探針時(shí)，檢測(cè)上清液中的熒光值，若熒光值超過(guò)背景噪音的6倍，則待檢樣本中存在單堿基突變；

當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為富含G序列的信號(hào)探針時(shí)，在上清液中加入氯化血紅素、H₂O₂和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)，若反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色，則待檢樣本中存在單堿基突變；

當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針時(shí)，利用上清液進(jìn)行等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，若擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則待檢樣本中存在單堿基突變。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述磁球溶液中的金屬離子濃度為200-400mM；和/或所述低金屬離子的溶液中的金屬離子濃度為0-10mM。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述的金屬離子為Na和/或K。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述信號(hào)探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為9-12個(gè)。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述捕獲探針的長(zhǎng)度為20-25個(gè)堿基。

根據(jù)本發(fā)明，在捕獲探針上標(biāo)記生物素，在磁球表面包覆親和素，通過(guò)生物素-親和素的相互作用，將捕獲探針偶聯(lián)于磁球上。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述磁球的平均直徑為2μm。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述核酸雜交的溫度為20-27℃，時(shí)間為10-20min。

根據(jù)本發(fā)明，所述方法對(duì)單堿基突變的檢測(cè)限為0.1％。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)單堿基突變基因序列進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)單堿基突變基因序列具有高度的選擇性，可用于低豐度突變檢測(cè)。同時(shí)，所述方法還具有熒光、顯色和等溫?cái)U(kuò)增信號(hào)等多個(gè)檢測(cè)窗口，可以適用于多種檢測(cè)環(huán)境；且檢測(cè)成本低廉、易于制備，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，易于推廣到非專業(yè)人員操作。

附圖說(shuō)明

下面將結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。

圖1為與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為10的信號(hào)探針在不同濃度的NaCl存在時(shí)的單堿基突變區(qū)分因子的示意圖。

圖2為不同豐度的單堿基突變基因與檢測(cè)熒光值的關(guān)系示意圖。

圖3為本發(fā)明采用熒光標(biāo)記的信號(hào)探針進(jìn)行單堿基突變檢測(cè)的原理示意圖；其中，圖中附圖標(biāo)記的含義如下：1目標(biāo)基因的突變型基因；2目標(biāo)基因的野生型基因；3生物素化捕獲探針；4親和素包覆的磁球；5熒光標(biāo)記的信號(hào)探針。

圖4為實(shí)施例1中顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

圖5為實(shí)施例1中等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明容易理解，下面將結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

本發(fā)明涉及一種單堿基突變檢測(cè)方法，具體為一種采用核酸短暫雜交與磁分離相結(jié)合的單堿基突變檢測(cè)方法，其包括以下步驟：

A，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)捕獲探針與信號(hào)探針；

所述捕獲探針為單鏈寡核酸序列，一般為20-25個(gè)堿基，能與目標(biāo)基因的非突變部分完全互補(bǔ)，用于捕獲體系中的目標(biāo)基因序列；室溫下，所述捕獲探針與目標(biāo)基因的突變型基因和野生型基因均能形成穩(wěn)定雜交；將捕獲探針用生物素標(biāo)記后，其能通過(guò)生物素-親和素(例如，鏈霉親和素)相互作用偶聯(lián)在親和素包覆的磁球(平均直徑2微米)上；

所述信號(hào)探針為一段帶有標(biāo)記的核苷酸序列，與目標(biāo)基因的突變型基因完全互補(bǔ)，與目標(biāo)基因的野生型基因形成單堿基錯(cuò)配；一般，信號(hào)探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為9-12個(gè)；

根據(jù)信號(hào)探針?biāo)鶐У臉?biāo)記不同，所述信號(hào)探針的類型包括熒光標(biāo)記的信號(hào)探針、富含G序列的信號(hào)探針或等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針；

本發(fā)明所述用語(yǔ)“熒光標(biāo)記的信號(hào)探針”是指在信號(hào)探針的端部連接一熒光素，所述的熒光素可以為FAM熒光素、VIC熒光素等。

本發(fā)明所述用語(yǔ)“富含G序列的信號(hào)探針”是指在信號(hào)探針的端部連接一段富含鳥嘌呤(G)序列的信號(hào)探針，富含鳥嘌呤(G)序列的DNA能通過(guò)Hoogsteen氫鍵，形成G-四聯(lián)體(DNA的一種二級(jí)結(jié)構(gòu))，G-四聯(lián)體可以與氯化血紅素(hemin)結(jié)合，形成具有過(guò)氧化氫酶活性的DNA模擬酶。這種模擬酶可以催化H₂O₂與2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)的反應(yīng)，生成的產(chǎn)物具有特征的綠色并在410nm處有特征吸收；所述富含鳥嘌呤(G)的序列僅用來(lái)形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，不與目標(biāo)基因序列形成任何互補(bǔ)；

本發(fā)明所述用語(yǔ)“等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針”，是指短信號(hào)探針的端部連接一段可以用于等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(IEXPAR)擴(kuò)增的序列，這段序列僅用來(lái)作為等溫?cái)U(kuò)增的模板，不與目標(biāo)序列形成任何互補(bǔ)。

所述等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR)是Galas等建立的一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。IEXPAR可以在等溫條件下，利用聚合酶和切刻酶的協(xié)同作用，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)目標(biāo)核酸分子擴(kuò)增10⁶-10⁹倍，該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速的顯著優(yōu)點(diǎn)。

B，將與捕獲探針偶聯(lián)的磁球配置成磁球溶液，加入信號(hào)探針和待測(cè)樣本進(jìn)行核酸雜交；

磁球溶液中具有較高的金屬離子濃度，一般為200-400mM，圖1為與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為10的信號(hào)探針在不同濃度的NaCl存在時(shí)的單堿基突變區(qū)分因子。從圖1可以看出，當(dāng)NaCl的濃度在200-400mM時(shí)，信號(hào)探針的單堿基突變區(qū)分因子較好，這是由于金屬離子(例如Na、K、Mg和Ca等)的存在可以減弱核酸雙鏈雜交時(shí)的靜電排斥，從而促進(jìn)雙鏈的形成；

本發(fā)明所述用語(yǔ)“區(qū)分因子”為發(fā)生單堿基突變的突變型與野生型所產(chǎn)生的信號(hào)之比。

信號(hào)探針可以在金屬離子的驅(qū)動(dòng)下與目標(biāo)基因的突變型基因形成較為穩(wěn)定的雙鏈，而與野生型基因形成不穩(wěn)定的雙鏈；由于探針堿基數(shù)少，即使在較高的鹽濃度下，其與目標(biāo)基因序列之間的雜交也屬于短暫雜交；核酸短暫雜交的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)對(duì)于互補(bǔ)堿基數(shù)和錯(cuò)配堿基非常敏感，因此在突變型基因存在時(shí)，磁球能夠結(jié)合更多的信號(hào)探針，而野生型只能結(jié)合非常少的信號(hào)探針。

C，核酸雜交結(jié)束后進(jìn)行磁分離，然后將磁球重懸于低金屬離子的溶液中中；此時(shí)結(jié)合在突變型基因上的信號(hào)探針與其發(fā)生解離，游離在水溶液中。

D，再次進(jìn)行磁分離，對(duì)獲得上清液進(jìn)行檢測(cè)，判斷待檢樣本中是否存在單堿基突變。

根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為熒光標(biāo)記的信號(hào)探針時(shí)，檢測(cè)上清液中的熒光值，若熒光值超過(guò)背景噪音的6倍，則待檢樣本中存在單堿基突變；不同豐度的單堿基突變基因與檢測(cè)熒光值的關(guān)系如圖2所示；檢測(cè)過(guò)程的原理示意圖如圖3所示。

當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為富含G序列的信號(hào)探針時(shí)，在上清液中加入氯化血紅素、H₂O₂和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)，生成的產(chǎn)物具有特征的綠色，并在410nm處有特征吸收；若顯色反應(yīng)后的反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色，則待檢樣本中存在單堿基突變。

在目標(biāo)基因序列濃度較低的情況下，在第二次磁分離后，獲得的上清液中的探針濃度也較低，普通的熒光和顯色方法難以檢測(cè)到，此時(shí)采用的信號(hào)探針的類型為等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針。

當(dāng)所述信號(hào)探針的類型為等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的信號(hào)探針時(shí)，利用上清液進(jìn)行等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，若擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則待檢樣本中存在單堿基突變。

根據(jù)本發(fā)明，所述低金屬離子的溶液中的金屬離子濃度為0-10mM；在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述低金屬離子的溶液優(yōu)選為純水溶液，即所述低金屬離子的溶液中不含有金屬離子。

根據(jù)本發(fā)明，所述磁球溶液及低金屬離子的溶液中的金屬離子為Na、K等一價(jià)金屬離子中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明，所述核酸雜交的溫度為20-27℃，時(shí)間為10-20min。

根據(jù)本發(fā)明，所述方法對(duì)單堿基突變的檢測(cè)限為0.1％。

實(shí)施例

為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明中所使用的原料或組分若無(wú)特殊說(shuō)明均可以通過(guò)商業(yè)途徑或常規(guī)方法制得。

實(shí)施例1：DNA中單堿基A>G突變的檢測(cè)

使用與目標(biāo)基因有10個(gè)堿基互補(bǔ)的信號(hào)探針對(duì)目標(biāo)單鏈DNA中的A>G基因突變進(jìn)行檢測(cè)。

具體步驟：

(1)磁球偶聯(lián)生物素化捕獲探針

①將表面包覆親和素的磁球的溶液置于漩渦儀渦旋振蕩30s，使表面包覆親和素的磁球充分混勻。移液槍吸取100μl的磁球溶液到1.5ml離心管中。將離心管置于磁性分離器上，靜置2min，吸去上清液。

②取下離心管，加入1ml緩沖液I(10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA，1M NaCl，0.1％Tween-20)，渦旋混勻，磁性分離，去除上清。重復(fù)此操作一次。

③加入500μl含有1.6μΜ生物素化捕獲探針的緩沖液I，使磁球濃度為2mg/ml，渦旋混勻。將離心管置于水平搖床，在室溫下以80rpm的速度旋轉(zhuǎn)混合30min(期間每隔5min渦旋混勻一次，確保磁球懸浮)。

④反應(yīng)完成后，磁性分離，收集上清于新的1.5ml EP管，測(cè)OD260處值。

⑤用適量緩沖液I清洗三次，磁性分離，去除上清，加入1ml PBS(pH＝7.4)溶液，重懸磁球，獲得偶聯(lián)捕獲探針的磁球，置于4℃冰箱備用。

⑥通過(guò)測(cè)定反應(yīng)前后核酸的濃度，計(jì)算結(jié)合到磁球上核酸的量。

(2)核酸雜交

①上述偶聯(lián)捕獲探針的磁球磁性分離，去除上清，用適量緩沖液(pH＝7.5)清洗，磁性分離。

②加入50μl含有突變型/野生型基因序列、信號(hào)探針和含有400mM NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH＝7.5)；室溫下，置于水平搖床，80rpm下雜交10min，期間每隔5min渦旋一次，確保磁球懸浮，然后進(jìn)行磁性分離。

③將磁球重懸于純水溶液，磁性分離，保留上清。

④根據(jù)所使用的信號(hào)探針類型分析③步中上清液的信號(hào)。

a.若采用的是熒光標(biāo)記的信號(hào)探針，則在熒光酶標(biāo)儀(多功能酶標(biāo)儀EnVision PerkinElmer，英國(guó))上直接分別測(cè)定野生型組和突變型組的熒光強(qiáng)度。

b.若采用富含G序列的信號(hào)探針，則進(jìn)行顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。?、鄄街猩锨逡?6μl加入新的離心管，再加入4μl 62.5mΜHemin，37℃孵育1h；孵育完成后，再向上述溶液中分別加入143μl 50mM HEPES緩沖液(pH＝5.2)，2μl 4mM ABTS，5μl 4mM H₂O₂，室溫反應(yīng)10min，觀察野生型組和突變型組的溶液顏色。

c.若采用等溫指數(shù)擴(kuò)增的引物的信號(hào)探針，則取2μl③步中上清液加入到含有1×SYBY Green I、0.05U/μl Vent(exo-)DNA聚合酶、0.3U/μl Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶、0.02μΜ擴(kuò)增模板、250μΜdNTPs的緩沖液中(22mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，50mM NaCl，10mM KCl，3.5mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，pH 8.3)的溶液，在55℃下，反應(yīng)2h，并在熒光酶標(biāo)儀(多功能酶標(biāo)儀EnVision PerkinElmer，英國(guó))上檢測(cè)其熒光變化曲線。

實(shí)施例中所采用的核酸的序列如表1所示：

表1：實(shí)施例中所采用的核酸的序列

注：FAM表示熒光素，P表示磷酸標(biāo)記

(3)檢測(cè)結(jié)果：

a.在熒光測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，突變型組和野生型組的檢測(cè)熒光值分別為7734和785，突變組的熒光值顯著高于野生型組的熒光值。

b.顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，突變型組呈現(xiàn)特征深綠色，而野生型組沒有呈現(xiàn)該顏色。

C.在等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，突變型組在1h內(nèi)熒光信號(hào)得到增強(qiáng)，展現(xiàn)出特征的擴(kuò)增曲線；而野生型組的熒光信號(hào)沒有增強(qiáng)，如圖5所示。

應(yīng)當(dāng)注意的是，以上所述的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。通過(guò)參照典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解為其中所用的詞語(yǔ)為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯?？梢园匆?guī)定在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出修改，以及在不背離本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修訂。盡管其中描述的本發(fā)明涉及特定的方法、材料和實(shí)施例，但是并不意味著本發(fā)明限于其中公開的特定例，相反，本發(fā)明可擴(kuò)展至其他所有具有相同功能的方法和應(yīng)用。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京化工大學(xué)

<120> 一種核酸短暫雜交與磁分離相結(jié)合的單堿基突變檢測(cè)方法

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 生物素化捕獲探針

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccttatca atattgatcg 40

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 目標(biāo)基因的野生型基因

<400> 2

acggatcgca tcaacttacg caattgcgta cgatcaatat tgataaggat 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 目標(biāo)基因的突變型基因

<400> 3

acggatcgca tcgacttacg caattgcgta cgatcaatat tgataaggat 50

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 10-nt熒光標(biāo)記的核酸探針

<400> 4

aagtcgatgc 10

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 11-nt熒光標(biāo)記的核酸探針

<400> 5

taagtcgatg c 11

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 12-nt熒光標(biāo)記的核酸探針

<400> 6

taagtcgatg cg 12

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 富含G序列的核酸探針

<400> 7

aagtcgatgc aaagggtagg gcgggttggg a 31

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 等溫指數(shù)擴(kuò)增引物的核酸探針

<400> 8

aagtcgatgc cagctggagc 20

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 等溫?cái)U(kuò)增模板

<400> 9

gctccagctg gcatcgactt aacagactca gctccagctg gcatcgactt a 51