專利名稱：基于量子點共振能量轉移檢測hbv dna及單堿基突變的方法
技術領域：
本發(fā)明屬靶DNA或單堿基突變的檢測領域，特別是涉及一種基于量子點共振能量 轉移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法。
背景技術：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)引起的疾病，乙肝病毒的 感染是一個全球性的健康問題。全世界將近有3. 5億HBV慢性攜帶者，我國有1. 2億HBV病 毒攜帶者，并呈上升趨勢。HBV的感染可以引起多種疾病，比如慢性肝炎，肝硬化和原發(fā)性 肝癌。在HBV的治療方面，通過抗HBV藥物來抑制病毒復制是目前治療慢性乙型肝炎(CHB) 最重要和有效的方法。諸如拉米呋啶和阿德福韋等藥物已廣泛用于抗HBV的治療。但藥 物長期應用后，病毒產生基因突變，進而引發(fā)的變異和耐藥性問題已成為臨床中的棘手問 題。因此，定量檢測HBV DNA及堿基突變在HBV基礎研究和臨床實踐中具有重要意義。目前 最常見的檢測HBV感染及單堿基突變的方法包括凝膠電泳聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、分支 DNA 信號擴增法(branched DNA signal ampli-f ication assay)、等位特異的 DNA 雜交方法(allele-specif ic DNA hybridization)、連接或 引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信標的熒光共振能量轉移 (molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer),電化學檢 貝Ij (electroche mical detect-ing)等。但這些方法普遍存在一些缺陷，或者操作過程復雜， 或者靈敏度不高，或者比較費時，缺乏多靶標高通量檢測的能力。因此建立簡單、特異、快速 和高通量的靶DNA及單堿基突變檢測的方法是解決臨床應用的關鍵問題。量子點(quantum dots，QDs)，是一種新型的熒光探針。自從第一批報道使用修飾 的CdSe/ZnS核/殼結構QDs作為熒光標記物標定生物樣品以來，QDs近年來已在眾多的生 物分析和生理過程研究中引起廣泛的關注和應用。QDs具有許多獨特的光物理性質，如寬 廣的吸收光譜和狹窄的發(fā)射光譜，這使得它們可以作為良好的能量供體應用于基于熒光共 振會邑量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)的傳感器中。這是因為這 些熒光特性允許我們能夠在QDs寬廣的吸收光譜中選擇某個激發(fā)波長進行激發(fā)，從而避免 對染料受體(如Cy5)的直接激發(fā)；并可以選擇適當的濾光片對供體和受體發(fā)射的熒光進 行有效的分離。迄今為止，研究者們已構建了多種以FRET為基礎的QDs納米傳感器。這些 傳感器已被成功用于多種分析物的檢測，包括營養(yǎng)物質、爆炸物、蛋白質、酶以及PH值的變 化等。與此同時，也有研究集中在基于FRET的QDs-DNA納米傳感器應用于寡核苷酸(DNA) 的識別，通過寡核苷酸雜交后引起的FRET熒光發(fā)射信號的變化從而達到對寡核苷酸(DNA) 的識別和檢測。但是許多QDs-DNA傳感器的制備過程復雜，代價高，而且制備得到的探針不 能夠長期保存。絕大多數情況下，構建的QDs-DNA FRET傳感器是在常規(guī)的熒光儀上實現對 靶DNA的檢測的，但是利用普通熒光儀進行檢測的方法通常都比較繁瑣和費時。也有一些 研究者通過將QDs植入到納米管上或者結合單分子熒光檢測技術，可以獲得檢測靈敏度很高的DNA傳感器，然而這些方法中傳感器制備過程的復雜性，以及需要精貴復雜的儀器，都 使得這些方法的應用受到了限制。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種基于量子點熒光共振能量轉移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，以解決現有技術中的缺陷。本發(fā)明的一種基于量子點共振能量轉移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包 括(一 )檢測探針的制備及HBV DNA臨床樣本的制備(1)巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結構量子點的制備取0. 5mL熒光發(fā)射峰為575 615nm的三辛基氧化磷(TOPO)包裹的CdSe/ZnS核 /殼結構QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巰基丙酸(MPA)溶液，室 溫攪拌30 60分鐘，加入5 SmL水，反復震蕩，分去有機層，在水層中加入丙酮，離心沉 淀后，將得到的QDs溶于Milli-Q超純水中，制備得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnSQDs ；(2) HBV DNA檢測探針的設計及合成HBV多聚酶位點rtM204I/V(YMDD)的變異與血清中HBV DNA的反彈及轉氨酶水平 有關。當M變?yōu)閂或I時可導致氨基酸側鏈的柔性減低，并在HBV聚合酶和拉米呋啶三磷酸 鹽之間形成空間位阻，使其與拉米呋啶三磷酸的結合力下降，導致病毒對拉米呋啶的耐藥。 本發(fā)明根據YMDD (rtM204M)及變異型YVDD (rtM204V)的DNA序列設計檢測探針，其中每個 位點設計兩個相連接的探針，兩個探針的長度都是15個堿基，單堿基多態(tài)位點設計在第一 個探針的3’端，并在5’端修飾Cy5(為信號探針)，另一個探針將用作QDs-DNA交聯探針， 探針的3’未端經過氨基功能化修飾，以便與修飾了羧基的量子點結合，所有用到的DNA序 列見表1，探針的合成由大連寶生物(TAKARA)有限公司完成；表1. HBVDNA靶序列及探針
權利要求
1. 一種基于量子點共振能量轉移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包括(一)檢測探針的制備及HBVDNA臨床樣本的制備(1)巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結構量子點的制備取0. 5mL熒光發(fā)射峰為575 615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/殼結 構QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 4mL巰基丙酸MPA溶液，室溫攪拌 30 60分鐘，加入5 SmL水，反復震蕩，分去有機層，在水層中加入丙酮，離心沉淀后，將 得到的QDs溶于Milli-Q超純水中，制備得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs ；(2)HBV DNA擴增引物及檢測探針的設計合成 PCR擴增引物PCR 上游引物5’ -ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC-3’ ； PCR 下游引物5，-CAGAGCAGAGGCGGTGTCG-3，； 檢測探針-NH2 修飾的單鏈 DNA 探針5，-TGG ATG ATG TGG TAT (T)10(CH2)3- (NH2) -3'； -Cy5 標記的信號 DNA 探針-1 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATA-3，； -Cy5 標記的信號 DNA 探針-2 :5，_Cy5_TGG CTT TCA GTT ATG-3，；(3)QDs-DNA探針交聯物的制備將0. 5g/L的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺EDC、0. 5g/L的N-羥基琥珀 酰亞胺NHS和0. 05 μ M的MPA包裹的QDs按體積比為1 2 1 2 2 6的比例混合， 活化0. 5 2小時，然后加入上述-NH2功能化修飾過的單鏈DNA探針，于37°C孵化0. 5 2小時，制備得到QDs-DNA探針交聯物；(4)HBV DNA臨床樣本的制備采用裂解法抽提陽性血清樣品中HBV基因組DNA，然后對HBV DNA進行PCR擴增，制得 HBV DNA臨床待測樣本；(二)使用酶標儀對互補靶HBVDNA及單堿基突變的檢測(1)互補靶HBVDNA及單堿基突變的檢測將10 μ L的HBV DNA的PCR待測樣本加入到115 μ L(20mM)的Taq聯接緩沖液中，在 PCR儀上經95°C變性5分鐘，使其解為單鏈；隨后將該混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴 5分鐘；然后向該混合液中加入70 μ L上述(一)/ (3)中的QDs-DNA探針、10 μ L的Cy5標 記的信號探針-1 (10 μ Μ)、5 μ L(1個單位)的Taq DNA聯接酶；將該混合液共210 μ L于42°C下反應15 30分鐘，在聯接反應完成后，將該反應混合 液于Eppendorf PCR儀上在85°C下加熱變性5分鐘，使雙鏈解離變?yōu)閱捂?；變性后，立即?反應混合液置于冰水中冰浴5分鐘；冰浴后將反應混合液迅速轉移至96孔板酶標儀中，在Wallac 1420型酶標儀上采用 485nm光激發(fā)，檢測雜交反應液670nm處的熒光發(fā)射強度，從而實現對完全互補的或單堿基 突變的HBV DNA臨床樣本的檢測；(2)互補靶HBVDNA及單堿基突變檢測的結果判斷①基于QDs-Cy5熒光共振能量轉移的HBV DNA野生型的定量檢測 將上述(二)/(1)中670nm處熒光發(fā)射強度的檢測結果與不加PCR待測樣本的空白試 樣的檢測結果進行對比，若上述(1)中670nm處的熒光發(fā)射強度比空白試樣有明顯增強，則判斷該樣本中的HBV DNA未發(fā)生突變，即為野生型，這時可將該樣本于670nm處的熒光發(fā)射 強度與標準曲線進行對比，可以確定樣本中HBV DNA的濃度，從而實現了對野生型HBV DNA 的定量檢測；②基于QDs-Cy5熒光共振能量轉移的HBVDNA單堿基突變的檢測將上述(1)中670nm處熒光發(fā)射強度的檢測結果與不加PCR待測樣本的空白試樣的 檢測結果進行對比，若樣本的熒光強度與空白噪聲的熒光強度相當，則判斷該樣本中的HBV DNA發(fā)生了單堿基突變；③HBV單堿基突變樣本的突變類型的判斷替換步驟(二)/(1)中的待測樣本為上述②中的HBV DNA的單堿基突變樣本，并將該 步驟中的Cy5標記的信號探針-1替換為Cy5標記的信號探針_2，其他方法相同進行檢測；將突變樣本于670nm處熒光發(fā)射強度的檢測結果與不加PCR待測樣本的空白試樣的檢 測結果進行對比，若樣本的熒光強度比空白試樣有明顯增強，則判斷該樣本中的HBVDNA發(fā)生了 YVDD突變，反之則為其他突變。
2.根據權利要求1所述的一種基于量子點共振能量轉移檢測HBVDNA及單堿基突變 的方法，其特征在于所述步驟(一)/(1)中的巰基丙酸溶液為巰基丙酸的甲醇溶液，濃度 30mmol/L，用四甲基氫氧化銨調pH值為9 11。
3.根據權利要求1所述的一種基于量子點共振能量轉移檢測HBVDNA及單堿基突變的 方法，其特征在于所述步驟(一)/ (3)中的-NH2功能化修飾過的單鏈DNA探針與MPA-QDs 的摩爾比為10 500 1。
4.根據權利要求1所述的一種基于量子點共振能量轉移檢測HBVDNA及單堿基突變的 方法，其特征在于所述步驟(一)/⑷中的PCR擴增體系為10X緩沖液1.5 μ 1，Taq酶 (1 個單位)，25mmol/L MgCl2O. 8 μ l、25mmol/L dNTP 1 μ 1，上下游引物各0. 5 μ 1，引物終濃 度為0. 5pmol/L ；擴增條件94°C變性4分鐘；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，35個循環(huán)， 72 °C延伸4分鐘。
5.根據權利要求1所述的一種基于量子點共振能量轉移檢測HBVDNA及單堿基突變的 方法，其特征在于所述步驟(二)/(1)中的QDs-DNA探針與Cy5標記的信號探針的摩爾比 為 1 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于量子點共振能量轉移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包括巰基丙酸MPA包裹的CdSe/ZnS核/殼結構量子點的制備；HBV DNA檢測探針的設計及合成；QDs-DNA探針交聯物的制備；HBV DNA臨床樣本的制備；使用酶標儀對互補的及單堿基突變的HBV靶DNA的高通量檢測。該方法操作簡單，不需要對雜交體系中未聯接的DNA進行分離純化；由于Cy5在所選的激發(fā)光(485nm)下不會直接產生熒光信號，因此背景干擾小，信號強；該方法還具有特異、快速、高分辨率、高靈敏度和高通量的特點，可應用于臨床醫(yī)學中HBV DNA及單堿基突變的高通量和多靶標的檢測。
文檔編號G01N21/64GK101993956SQ20101000304
公開日2011年3月30日 申請日期2010年1月3日 優(yōu)先權日2010年1月3日
發(fā)明者毛紅菊, 王祥, 趙建龍, 金慶輝, 鐘新華 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所;華東理工大學