專利名稱：通過聚乙二醇的介導(dǎo)將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的改進(jìn)的誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過將單鏈DNA寡核苷酸致誘變核堿基引入細(xì)胞而在靶細(xì)胞中的DNA特定位點(diǎn)上特異性和選擇性改變核苷酸序列的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過使用聚乙二醇(PEG)將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的定向誘變的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有致誘變核堿基和PEG的試劑盒。本發(fā)明還涉及PEG用于增強(qiáng)定向誘變的用途。
背景技術(shù)：
有意地在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中產(chǎn)生改變的過程具有修飾所述細(xì)胞或生物體(所述細(xì)胞形成該生物體的一部分或能夠再生形成該生物體)的一個(gè)或多個(gè)遺傳編碼的生物學(xué)特征的目的。這些改變可以采取下列形式:刪除部分遺傳物質(zhì)、添加外源性遺傳物質(zhì)或改變遺傳物質(zhì)的已有核苷酸序列。人們知道改變真核生物遺傳物質(zhì)的方法已經(jīng)有20多年，所述方法在植物、人和動(dòng)物細(xì)胞和微生物中有廣泛的應(yīng)用，用于農(nóng)業(yè)、人類健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的改進(jìn)。最常見的方法由向細(xì)胞的基因組中加入外源性DNA片段組成，這將賦予所述細(xì)胞或其生物體優(yōu)于或超過已有基因所編碼的性質(zhì)的新性質(zhì)(包括其中已有基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質(zhì)中是有效的，然而這些方法不是十分精確，因?yàn)閷?duì)外源性DNA片段插入至基因組的位置沒有控制(因而對(duì)最終的表達(dá)水平?jīng)]有控制)，并且因?yàn)樗璧男Ч仨毻ㄟ^優(yōu)于原始的和平衡良好的基因組所編碼的天然性質(zhì)表現(xiàn)出來。相反，引起預(yù)先確定的基因組位點(diǎn)中的核苷酸的添加、刪除或轉(zhuǎn)換的定向誘變的方法將允許精確地修飾已有的基因。另外，由于定向誘變的精確特性，可以預(yù)料的是以此方式獲得的新型植物系將更易于被消費(fèi)者接受。
定向誘變是一種定點(diǎn)誘變的方法，其基于將合成的致誘變核堿基(由以其Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)與DNA相似但在化學(xué)上可以不同于DNA的短串核苷酸樣部分(moietie)組成)遞送進(jìn)入真核細(xì)胞核(Alexeev和Yoon NatureBiotechnol 16: 13431998 ; Rice Nature Bi o techno 1.j_￡: 321，2001; Kmi ec，J.Cl in.1nvest.112:632.2003)。一旦被引入細(xì)胞，這樣的致誘變核堿基在靶位點(diǎn)上與互補(bǔ)序列堿基配對(duì)。通過有意地在核堿基中設(shè)計(jì)錯(cuò)配，該錯(cuò)配可以在靶基因組序列中的相應(yīng)位置上引起核苷酸轉(zhuǎn)換。該方法允許在內(nèi)源性位點(diǎn)上轉(zhuǎn)換單個(gè)核苷酸或最多幾個(gè)核苷酸，但是可以應(yīng)用于在已有位點(diǎn)上產(chǎn)生終止密碼子，從而引起其功能的破壞，或產(chǎn)生密碼子改變，從而產(chǎn)生編碼具有改變的氨基酸組成的蛋白的基因(蛋白工程)。在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中已經(jīng)描述了定向誘變。兩類不同的合成性致誘變核堿基已經(jīng)用于這些研究:嵌合的DNA = RNA核堿基或單鏈核堿基。
嵌合的DNA: RNA核堿基(嵌合體)是自我互補(bǔ)的分子，其由25bp只有DNA的區(qū)域和25bp的互補(bǔ)序列(由5bp的DNA的核心區(qū)形成，所述DNA兩側(cè)是IObp的2’ -O-甲基化的RNA，其被認(rèn)為可以幫助嵌合體在細(xì)胞中的穩(wěn)定性)組成。5bp核心區(qū)在其中心包括工程化的錯(cuò)配，其帶有在基因組的靶DNA序列中要改變的核苷酸。這兩個(gè)區(qū)都通過4bp的胸腺嘧啶脫氧核苷發(fā)夾連接。當(dāng)引入細(xì)胞時(shí)，認(rèn)為嵌合體與其靶序列形成雙D-環(huán)，在嵌合體和靶核苷酸之間形成錯(cuò)配。然后該錯(cuò)配由內(nèi)源性細(xì)胞DNA修復(fù)蛋白通過轉(zhuǎn)換基因組核苷酸而解決。第一個(gè)使用嵌合體的定向誘變的例子來自于動(dòng)物細(xì)胞(見Igoucheva等人2001GeneTherapy8, 391-399的綜述)，然后后來還用于獲得植物細(xì)胞中的定向誘變(Beetham等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA並:8774-8778; Zhu 等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773; Zhu 等人 2000Nature Biotech.18，555-558; Kochevenko 等人 2003PlantPhvs.132:174-184:Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep.22:509-512) 與人細(xì)胞不同，產(chǎn)生定向誘變事件的植物細(xì)胞可以再生成完整的植物，并且突變可以轉(zhuǎn)移至下一代，使其成為重要食品作物的研究和商業(yè)化誘變的理想工具。但是，許多實(shí)驗(yàn)室的深層次研究顯示使用嵌合體的定向誘變頻率相當(dāng)?shù)筒⑶沂强勺兊模蛏踔敛荒軝z測(cè)到(Ruiter等人2003PlantMol.Biol.53, 715-729, Van der Steege 等人(2001)Nature Biotech.叢:305-306)，并且依賴于這樣的因素:如靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、細(xì)胞在細(xì)胞周期中的位置、靶標(biāo)的序列和嵌合體的質(zhì)量(其是難以合成的)。由于使用本領(lǐng)域中已知方法的定向誘變的頻率相對(duì)較低，所以只有當(dāng)基因組靶標(biāo)的單個(gè)核苷酸的改變引起顯性可選擇性表型時(shí)，這樣的事件才可以被檢查至IJ。在植物細(xì)胞中，將特異性的點(diǎn)突變引入乙酰乳酸合成酶(ALS，在玉米中是AHAS)基因的開放閱讀框中，所述基因催化合成支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的共同最初步驟。在煙草中，單個(gè)核苷酸的改變足以產(chǎn)生密碼子轉(zhuǎn)換P194Q或W571L。在這些密碼子轉(zhuǎn)換后產(chǎn)生的ALS蛋白對(duì)磺酰脲類除草劑的抑制不敏感，因此提供了選擇染色體基因座上的單個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)換的方法。由于使用用嵌合體工作的困難，人們已經(jīng)尋求更可靠的可替代的寡核苷酸設(shè)計(jì)。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究了單鏈(ss)核堿基進(jìn)行定向誘變的能力。發(fā)現(xiàn)它們給出更加可重復(fù)的結(jié)果、合成更簡(jiǎn)單并且還可以包括修飾的核苷酸以改進(jìn)致誘變核堿基在細(xì)胞中的表現(xiàn)(Liu 等人 2002Nucl Acids Res30:2742-2750;review, Parekh-Olmedo 等人 2005Gene Therapyl2:639-646;Dong 等人 2006Plant Cell Rep.25:457-65;De Pi6doue 等人200701igonucIeotides 27:258-263)。在Kmiec 的多個(gè)專利申請(qǐng)(其中有 W00173002, W003/027265, W001/87914, W099/58702，W097/48714，W002/10364)中已經(jīng)描述了定向誘變。在W001/73002中考慮到的是:使
用未修飾的核堿基獲得的基因改變的低頻率相信主要是由于其被存在于反應(yīng)混合物或靶細(xì)胞中的核酸酶所降解。為了解決這一問題，提出摻入經(jīng)修飾的核苷酸以賦予所產(chǎn)生的核堿基對(duì)抗核酸酶的抗性。這種經(jīng)修飾的核苷酸的典型例子包括硫代磷酸酯鍵或2’ -O-甲基-類似物。這些修飾優(yōu)選位于核堿基的末端，留出包圍定向堿基的中心未修飾的結(jié)構(gòu)域。為了支持這個(gè)觀點(diǎn)，專利申 請(qǐng)W002/26967顯示某些增加核堿基細(xì)胞內(nèi)壽命的經(jīng)修飾的核苷酸可以增加定向誘變?cè)隗w外測(cè)試系統(tǒng)中也在哺乳動(dòng)物染色體靶標(biāo)上的效率。不只是核酸酶抗性，ss致誘變核堿基結(jié)合至其互補(bǔ)靶DNA的親和力也具有顯著增加定向誘變頻率的潛力。含有經(jīng)修飾的增加結(jié)合親和力的核苷酸的ss核堿基可以更有效地在復(fù)雜基因組中發(fā)現(xiàn)其互補(bǔ)的靶標(biāo)和/或結(jié)合至其靶標(biāo)更長(zhǎng)的時(shí)間并且被調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的蛋白除去的可能性更低。體外定向誘變分析已經(jīng)用于測(cè)試許多經(jīng)修飾的核苷酸以增加誘變過程的效率。鎖定的核酸(LNA)和C5-丙炔嘧啶分別具有糖部分和堿基的修飾，可以穩(wěn)定雙鏈的形成并提高雙鏈的熔解溫度。當(dāng)將這些經(jīng)修飾的核苷酸摻入至ss核堿基上時(shí)，其相對(duì)于使用相同序列的未經(jīng)修飾的核堿基獲得的定向誘變效率增加達(dá)13倍。這一方面見本申請(qǐng)人名下的 W02007073166 和 W02007073170。本發(fā)明人已經(jīng)開始通過優(yōu)化用于向植物細(xì)胞中引入致誘變核堿基的方法而增加植物細(xì)胞中定向誘變的頻率。最廣泛使用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法(土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)將其誘導(dǎo)腫瘤(Ti)的質(zhì)粒的一部分即所謂的T-DNA轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞中，在植物細(xì)胞中其有效地在隨機(jī)的位置上整合進(jìn)入植物基因組中。T-DNA兩個(gè)末端上的旁側(cè)是與靶序列無同源性的源自Ti質(zhì)粒的達(dá)22bp的“邊界”序列?？紤]到用于定向誘變的ss致誘變核堿基的長(zhǎng) 度較短，邊界序列將干擾這一過程。因此，只能使用化學(xué)或物理的方法通過直接DNA轉(zhuǎn)移而在植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)定向誘變。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了幾個(gè)這樣的直接DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，其包括電穿孔、聚乙二醇(PEG)處理原生質(zhì)體、基因槍轟擊(biolistic bombardment)植物愈傷材料和將DNA顯微注射至單個(gè)原生質(zhì)體或組織中。本領(lǐng)域未給出轉(zhuǎn)移ss核堿基以進(jìn)行定向誘變的優(yōu)選方法，特別是DNA轉(zhuǎn)移至植物或植物原生質(zhì)體的優(yōu)選方法的啟示。為了盡可能高地獲得植物中定向誘變的效率，在研究過程中本發(fā)明人鑒定了四個(gè)要優(yōu)化的因素。第一，優(yōu)選以高轉(zhuǎn)化效率引入致誘變核堿基，即，引入盡可能多的許多植物細(xì)胞中。第二，優(yōu)選地，處理對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞不是致死的，保證盡可能多被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也可以在轉(zhuǎn)化過程后存活(存活效率)。第三，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化方法對(duì)于經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞隨后分裂形成微愈傷組織是無害的(再生/植板效率)。最后優(yōu)選地是可能不需要應(yīng)用選擇而鑒定源自定向誘變事件的單個(gè)再生植物(鑒定效率)。大多數(shù)將DNA轉(zhuǎn)化至單個(gè)植物細(xì)胞的方法使用原生質(zhì)體，所述原生質(zhì)體源自葉(葉肉原生質(zhì)體)或源自細(xì)胞懸浮液(見Sheen, J.(2001)Plant Phys.127:1466-1475的綜述)。原生質(zhì)體可以用于瞬時(shí)表達(dá)研究，在這種情況下可以在轉(zhuǎn)化后不久評(píng)估基因的表達(dá)或蛋白定位，或者當(dāng)原生質(zhì)體生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上以促進(jìn)愈傷組織形成和器官發(fā)生時(shí)，原生質(zhì)體可以用于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。以前已經(jīng)報(bào)道過使用電穿孔轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA迎:5824-5828;Nishiguchi 等人(1986)Plant Cell Rep.5:57-60;Ou-Lee等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:6815-6819:Hauptmann 等人(I987)PlantCell R印.β:265-270; Jones 等人(1989)Plant Mol.Biol.13:503-511 )0 通常，給予最高轉(zhuǎn)化效率的場(chǎng)強(qiáng)(V/cm)引起〈50%的原生質(zhì)體存活(Jones等人(1989)Plant Mol.Biol.l3:503-511)o在煙草電穿孔研究中我們發(fā)現(xiàn)樣品中只有約10%的總煙草原生質(zhì)體被表達(dá)GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,在擬南芥屬(Arabidopsis)原生質(zhì)體的電穿孔后也觀察到這一相對(duì)的低轉(zhuǎn)化效率(Miao等人(2007)NatureProtocolsl^:2348-2353)。通常，對(duì)于每個(gè)植物物種必須經(jīng)驗(yàn)性地確定最佳的電穿孔條件，且這些條件還根據(jù)電穿孔儀器的類型和用于原生質(zhì)體分離的方法和緩沖液而變化。雖然電穿孔已經(jīng)被成功地應(yīng)用于許多植物物種，其仍然是有著幾個(gè)嚴(yán)重局限性(特別是在重現(xiàn)性方面)的困難技術(shù)(如http://Renetics.mRh.harvard, edu/sheenweb/fag, html中討論的)。因此,為了增加定向誘變的TNE的總效率，電穿孔是不太合意的。使用基因槍遞送的直接基因轉(zhuǎn)移在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因作物植物中已經(jīng)是非常成功的，并常規(guī)地用于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合。細(xì)胞懸浮液被轉(zhuǎn)移至用于誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基中，通過高壓氣體源驅(qū)動(dòng)的金顆粒轟擊該材料。已經(jīng)報(bào)道該轉(zhuǎn)化頻率低，約0.01%的總細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。由于低轉(zhuǎn)化效率，難以評(píng)價(jià)經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活。相反，由于經(jīng)處理的材料強(qiáng)烈分裂，所以轟擊后的再生效率有可能是高的。但是，因?yàn)門NE將發(fā)生在單個(gè)愈傷組織的單個(gè)細(xì)胞中，所以，如果不選擇的話這樣的事件將會(huì)容易地丟失，或者，再生的植物將是定向誘變事件的嵌合體。因此，對(duì)于在非選擇性位點(diǎn)上進(jìn)行定向誘變，轟擊是不現(xiàn)實(shí)的。相反，使用原生質(zhì)體找回定向誘變事件是可能的，因?yàn)槊總€(gè)微愈傷組織源自單個(gè)原生質(zhì)體。在ALS上通過嵌合體誘導(dǎo)的單個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)換已經(jīng)證明定向誘變可以在煙草、玉米和水稻細(xì)胞中被檢測(cè)到。轟擊已經(jīng)被用于煙草(Beetham等人1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:8774-8778;Kochevenko 等人 2003Plant Phvs.132:174-184).玉米(Zhu 等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773)和水稻(Okuzaki 等人 2004Plant CellRep.22:509-512)o Beetham等人(1999)報(bào)道與背景突變率相比(假定是10_7至10_8)，直接轉(zhuǎn)移嵌合體后的除草劑抗性的頻率增加20倍。Kochevenko等人也使用電穿孔以在煙草葉肉原生質(zhì)體中進(jìn)行定向誘變實(shí)驗(yàn)。與Beetham等人獲得的頻率相比，本發(fā)明人能夠以
0.0001%的頻率獲得除草劑抗性的煙草愈傷組織。這顯示當(dāng)用相同的植物物種和在這一情況下相同的靶核苷酸處理時(shí)，直接DNA遞送方法對(duì)定向誘變效率沒有大的影響，效率仍然維持在不理想的低水平上。但是Ruiter等人(2003Plant Mol.Biol.53, 715-729)在煙草和油菜含油種子中進(jìn)行了轟擊和電穿孔實(shí)驗(yàn)，不能檢測(cè)到嵌合體的任何作用。已經(jīng)報(bào)道對(duì)玉米和水稻愈傷組織的轟擊的效率是被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的0.01% (Zhu等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773;Okuzaki 等人(2004 (Plant CellRep.22:509-512)。但是，這只在可選擇性位點(diǎn)是可行的。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化本身從1985年已經(jīng)為人所知。第一個(gè)用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法使用了 PEG (Krens 等人(1982)Nature296:72-74;Potyrykus 等人(1985)Plant皿01.8丨01.1 印.2:117-128;恥81'肚丨11等人(1987)Plant Mol.Biol.363-373)。該技術(shù)可用于來自許多不同植物的原生質(zhì)體(Rasmussen等人(1993)Plant Sc1.型:199-207)。PEG被認(rèn)為在二價(jià)陽離子存在時(shí)通過將DNA沉淀在原生質(zhì)體的表面上(然后DNA在其中被沉淀)而刺激轉(zhuǎn)化(Maas & Werr (1989) Plant CellRep.8:148-151 )0 PEG轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化擬南芥屬原生質(zhì)體的選擇方法(http: //genetics, mgh.harvard, edu/sheenweb/faq.html) (Mathur 等人 Methods in molecular biology, vol.82，267-276),符合有效 TNE 的轉(zhuǎn)化方法所限定的四個(gè)要求。當(dāng)用PEG處理煙草原生質(zhì)體時(shí)，在所有被檢查的細(xì)胞中可以檢測(cè)到生物素標(biāo)記的ss寡核苷酸。通過使用二乙酸熒光素活體染色評(píng)估的PEG處理后的存活率是>90%。不是所有的原生質(zhì) 體都保留了分裂和形成微愈傷組織的能力。在非處理的煙草原生質(zhì)體的典型分離體中，大約25%形成微愈傷組織。PEG處理確實(shí)對(duì)再生效率有輕微的影響，再生效率下降約10%，但是與其它轉(zhuǎn)化方法相比，這并不是顯著的。以上描述的現(xiàn)有技術(shù)中沒有一個(gè)考慮到使用PEG轉(zhuǎn)化用于定點(diǎn)誘變特別是TNE。本發(fā)明人已經(jīng)開始改進(jìn)直接DNA轉(zhuǎn)移的方法以在植物細(xì)胞中獲得有效的定向誘變。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從本文其它地方所述的轉(zhuǎn)化技術(shù)中，PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化相對(duì)于電穿孔和基因槍顯著地增加了總的定向誘變的效率。這是令人驚訝的，因?yàn)橹两裼糜谥参镏卸ㄏ蛘T變的技術(shù)似乎傾向于具有低效率的電穿孔。另外，技術(shù)中的大多數(shù)改進(jìn)旨在改進(jìn)致誘變核堿基，而不是將致誘變核堿基遞送至基因組靶DNA的遞送系統(tǒng)。為了比較，本發(fā)明人使用了 ss致誘變核堿基，其被設(shè)計(jì)為在ALS基因座上產(chǎn)生P194Q轉(zhuǎn)換，從而引起除草劑抗性。使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或電穿孔將相同的ss致誘變核堿基引入煙草葉肉原生質(zhì)體中，使用相同的選擇條件選擇除草劑抗性細(xì)胞。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與已知的轉(zhuǎn)化方法相比，PEG介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化是在植物細(xì)胞中進(jìn)行定向誘變的最有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞原生質(zhì)體中定向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括將雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列與ss致誘變核堿基結(jié)合，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有第一DNA序列和與第一 DNA序列互補(bǔ)的第二 DNA序列，其中供體ss致誘變核堿基相對(duì)于要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列，優(yōu)選相對(duì)于第一 DNA序列包含至少一個(gè)錯(cuò)配，其中所述方法進(jìn)一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將ss致誘變核堿基引入細(xì)胞原生質(zhì)體的步驟。使用基于PEG轉(zhuǎn)化技術(shù)將ss致誘變核堿基與待轉(zhuǎn)化植物的原生質(zhì)體接觸。PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)本身是廣為人知的和必需的，可以不背離本發(fā)明的精髓而由技術(shù)人員做出對(duì)特定規(guī)程的小的修改。用于本發(fā)明的ss致誘變核堿基的長(zhǎng)度與用于定向誘變的其它(嵌合體)ss致誘變核堿基相一致，即通常為10-60 個(gè)核苷酸，優(yōu)選為20-55個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為25-50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明中使用的ss致誘變核堿基可以被修飾，例如通過申請(qǐng)人的W02007073166和W02007073170所述的LNA和/或丙炔修飾。因此，在某些具體實(shí)施方式
中，ss致誘變核堿基含有位于距離定向錯(cuò)配的位置的至少一個(gè)LNA，優(yōu)選為位于距離錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的兩個(gè)LNA。另外，這些LNA與ss致誘變核堿基的5’和/或3’末端距離至少3、4或5個(gè)核苷酸。在一些具體實(shí)施方式
中，ss致誘變核堿基可以含有一個(gè)或更多丙炔置換，基本上如W02007073166和W02007073170中所述。在一些具體實(shí)施方式
中，可以將供體ss致誘變核堿基偶聯(lián)至蛋白如核定位信號(hào)上。在這一具體實(shí)施方式
中，將本發(fā)明中使用的寡核苷酸通過常規(guī)(連接子)技術(shù)偶聯(lián)至核定位信號(hào)上，例如已知的SV40大T抗原的(NLS)肽、GATA轉(zhuǎn)錄因子11、DNA修復(fù)解螺旋酶XBP1、光介導(dǎo)的蛋白DET1、ERF轉(zhuǎn)錄因子、PR-相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活子PTI6和核卷曲蛋白(nuclear coiled protein),基本上如同一申請(qǐng)人的申請(qǐng)PCT/NL2007/000279所述。寡核苷酸核定位信號(hào)偶聯(lián)物可以用于本文所述的基于PEG的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的改變是刪除、置換或插入至少一個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，改變是置換?？梢栽谝粋€(gè)寡核苷酸中改變更多的核苷酸，但是可以預(yù)料到效率將下降，因此改變一個(gè)核苷酸是優(yōu)選的。靶DNA (或雙鏈?zhǔn)荏wDNA)可以來自任何來源，但是優(yōu)選靶DNA來自植物。優(yōu)選靶DNA來自基因組DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA、游離型DNA。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)至野生型而改正突變、誘導(dǎo)突變、通過打亂編碼區(qū)而使酶失活、通過改變編碼區(qū)而修飾酶的生物活性、通過打亂編碼區(qū)而修飾蛋白。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在增加植物原生質(zhì)體中定向誘變效率中的用途。不被理論所束縛，認(rèn)為使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將DNA沉淀在原生質(zhì)體的細(xì)胞膜上。經(jīng)沉淀的DNA被細(xì)胞膜封裝并以隔離的形式引入原生質(zhì)體中。在正常細(xì)胞周期的過程中，原生質(zhì)體在通過去除細(xì)胞壁而形成之后，直接開始其正常細(xì)胞壁的再生過程。細(xì)胞分裂通常開始較晚(從幾個(gè)小時(shí)至幾天)。定向核苷酸交換通常在細(xì)胞分裂過程中通過細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制發(fā)生。在將供體DNA引入原生質(zhì)體和細(xì)胞分裂開始之間的時(shí)間內(nèi)，供體DNA傾向于受到細(xì)胞防御機(jī)制如核酸外切酶的攻擊，有可能退化，因此變得對(duì)于TNE無效。通過使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，供體DNA通過內(nèi)吞作用而被封裝，并且以這一方式至少暫時(shí)地隔離于核酸外切酶的退化作用。當(dāng)DNA從其封裝的形式中釋放出來時(shí)，其具有增加的機(jī)會(huì)存在于細(xì)胞分裂的時(shí)刻或大約在這一時(shí)刻前后，在這一期間DNA (即ss致誘變核堿基)能夠找到受體細(xì)胞DNA中的其互補(bǔ)物并以通常的定向誘變機(jī)制交換核苷酸。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例:使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或電穿孔的定向i秀變頻率的比較

原生質(zhì)體的分離在25° C 和 60-70%RH，在 16/8h20001ux 光周期下，煙草(Nicotiana tabacum)Cv Petit Havana系SRl的體外芽培養(yǎng)物保持在高玻璃瓶中的含有0.8%Difco瓊脂的MS20培養(yǎng)基中。MS20培養(yǎng)基是基本Murashige和Skoog氏培養(yǎng)基(Murashige, T.和Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15:473-497, 1962),其含有 2%(w/v)鹿糖，不添加激素和0.8%Difco瓊脂。收集完全展開的3-6周齡的芽培養(yǎng)物的葉。將葉切成Imm厚的條，然后將其轉(zhuǎn)移至含有45ml MDE基本培養(yǎng)基的大(100mm x 100mm)皮氏培養(yǎng)皿中進(jìn)行預(yù)質(zhì)壁分離處理30分鐘。MDE基本培養(yǎng)基含有0.25g KCl, 1.0g MgSO4.7H20, 0.136g KH2PO4, 2.5g聚乙烯吡咯酮(MW10，000)，6mg萘乙酸和2mg6_芐氨基嘌呤，總體積為900ml。將溶液的重量克分子滲透壓濃度(osmolality)用山梨糖醇調(diào)整至600m0sm.kg_\pH為5.7。然后加入5mL的酶儲(chǔ)存液SRl。每IOOml酶儲(chǔ)存液由750mg纖維素酶Onozuka R10, 50011^崩解酶((11'丨861386)和250mg離析酶(macerozyme)RlO組成,經(jīng)Whatman紙過濾并過濾除菌。在黑暗中25。C進(jìn)行消化過夜。經(jīng)消化的葉通過50 μ m尼龍濾網(wǎng)過濾進(jìn)入無菌燒杯中。等體積的冷KCl洗滌培養(yǎng)基用于洗滌濾網(wǎng)并與原生質(zhì)體懸浮液合并。KCl洗滌培養(yǎng)基由每升2.0g CaCl2.2H20和使重量克分子滲透壓濃度為540m0sm.kg—1的足夠量的KCl組成。將懸浮液轉(zhuǎn)移至IOml管中，在85x g4° C沉淀原生質(zhì)體10分鐘。棄去懸浮液，將原生質(zhì)體沉淀小心地重懸于5mL冷的MLm洗滌培養(yǎng)基中，其是一半正常濃度的MS培養(yǎng)基(Murashige, T.和Skoog, F.，PhysiologiaPlantarum, 15:473-497, 1962)的主要營養(yǎng)素、每升2.2g CaCl2.2H20和使重量克分子滲透壓濃度為54011108111.1 -1的量的甘露醇。將2管的內(nèi)含物合并，在85xg4° C離心10分鐘。棄去上清液，將原生質(zhì)體沉淀小心地重懸于5mL冷的MLs洗滌培養(yǎng)基(其是蔗糖代替甘露醇的MLm培養(yǎng)基)中。
將2管的內(nèi)含物合并，小心取出加在蔗糖溶液上的ImL KCl洗滌培養(yǎng)基，不擾動(dòng)下層相。在85xg4° C離心原生質(zhì)體10分鐘。小心收集在蔗糖和KCL溶液之間含有活的原生質(zhì)體的中間相。加入等體積的KCl洗滌培養(yǎng)基并小心地混合。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定原生質(zhì)體的密度。PEG 轉(zhuǎn)化在5° C85xg離心原生質(zhì)體懸浮液10分鐘。棄去上清液，將原生質(zhì)體沉淀重懸于KCl洗滌培養(yǎng)基至終濃度106.mL'在IOmL的管中，將250 μ L原生質(zhì)體懸浮液，1.6nmole的ss致誘變核堿基和250 μ I PEG溶液輕柔地但充分地混合。20分鐘后，在室溫孵育，逐滴加入5mL冷的0.275M Ca(N03)2。在4° C85xg離心原生質(zhì)體懸浮液10分鐘。棄去懸浮液，將原生質(zhì)體沉淀小心地重懸于1.25mL Ttl培養(yǎng)基，其補(bǔ)充了 SOyg.mL—1頭孢噻廂和50μ g.mL—1萬古霉素。ss致誘變核堿基的培養(yǎng)基含有(每升，pH5.7)950mg KNO3, 825mg NH4NO3, 220mgCaCl2.2H20, 185mg MgSO4.7H20, 85mg KH2PO4, 27.85mgFeSO4.7H20, 37.25mg Na2EDTA.2H20,根據(jù) Heller 氏培養(yǎng)基(Heller, R.，Ann Sci Nat BotBiol Vegl1: 1223, 1953)的微量營養(yǎng)素，根據(jù) Morel 和 Wetmore 氏培養(yǎng)基(Morel, G.和 R.H.ffetmore, Amer.J.Bot.38:138 - 40, 1951)的維生素，2%(w/v)鹿糖，3mg 蔡乙酸，lmg6-芐氨基嘌呤和使重量克分子滲透壓濃度為540m0sm.kg—1的量的甘露醇。將懸浮液轉(zhuǎn)移至35mm的皮氏培養(yǎng)皿中。加入等體積的Ttl瓊脂糖培養(yǎng)基并輕柔混合。將樣品在25。C黑暗中孵育并按照如下所述進(jìn)一步培養(yǎng)。電穿孔在5° C85xg離心原生質(zhì)體10分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于冰冷的電穿孔緩沖液(由IOmM HEPES, 80mM NaCl, 0.04mM CaCl2, 0.4M甘露醇組成，pH5.7，用甘露醇調(diào)節(jié)至54011108111.1 -1，終濃度為10 !/1)中。在整個(gè)過程中原生質(zhì)體保持在冰上。向0.4cm寬的電穿孔杯中加入4.5nmole的ss致誘變核堿基和700 μ L原生質(zhì)體懸浮液。根據(jù)下列參數(shù)使用裝有PC和CE模塊的Biorad GenePulser XCell電穿孔系統(tǒng)向細(xì)胞懸浮液遞送單指數(shù)式衰竭脈沖:場(chǎng)強(qiáng)500V.cm-1電容950 μ F在這些條件下，樣品的電阻約是30ohm，得到的時(shí)間常數(shù)約是30ms。這些參數(shù)被選作電穿孔后24小時(shí)在煙草原生質(zhì)體中給出最高水平的GFP瞬時(shí)表達(dá)的參數(shù)。脈沖發(fā)生后，使原生質(zhì)體在室溫的杯中恢復(fù)30分鐘。然后使原生質(zhì)體在ImL Ttl培養(yǎng)基中恢復(fù)并轉(zhuǎn)移至IOmL的管中。用另外5mL Ttl培養(yǎng)基洗滌該杯，然后與原生質(zhì)體懸浮液合并。在充分地但輕柔地混合后，加入50 μ g.ml/1頭孢噻廂和50 μ g.ml/1萬古霉素,將1.25mL的原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移至35mm皮氏培養(yǎng)皿上。加入等體積的Ttl瓊脂糖培養(yǎng)基，將混合物輕柔勻質(zhì)化。在25°C黑暗中孵育樣品，按照如下所述進(jìn)一步培養(yǎng)。原生質(zhì)體的培養(yǎng)培養(yǎng)10天后，將瓊脂糖板切成6等份，轉(zhuǎn)移至含有補(bǔ)充了 20nM氯磺隆的22.5mLMAPlAO培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿中。該培養(yǎng)基由下列成分組成(每升，pH5.7):950mg KNO3, 825mgNH4NO3, 220mgCaCl2.2H20, 185mg MgSO4.7H20, 85mg KH2PO4, 27.85mgFeS04.7H20, 37.25mgNa2EDTA.2H20,根據(jù) Murashige 和 Skoog 氏培養(yǎng)基(Murashige, Τ.和 SkoogF., PhysiologiaPlantarum, 15:473-4971962)的十分之一原始濃度的微量營養(yǎng)素，根據(jù)Morel和Wetmore氏培養(yǎng)基(Morel, G.和 R.H.Wetmore, Amer.J.Bot.38:138 - 40, 1951)的維生素，6mg 丙酮酸鹽，蘋果酸、富馬酸和朽1檬酸每種12mg, 3% (w/v)鹿糖，6%(w/v)甘露醇，0.03mg萘乙酸和0.1mg6-芐氨基嘌呤。在25° C低光中孵育樣品6_8周。將生長(zhǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MAPI培養(yǎng)基中并使其生長(zhǎng)另外2-3周。MAPI培養(yǎng)基具有與MAP1AO培養(yǎng)基相同的組成，但是以3% (w/v)的甘露醇代替6%的甘露醇，以及含有46.2mg.Γ1組氨酸(pH5.7)。其用
0.8%(w/v) Difco瓊脂固化。然后使用無菌鑷子將愈傷組織轉(zhuǎn)移至RP培養(yǎng)基中。RP培養(yǎng)基由下列成分組成(每升，pH5.7):273mg KNO3, 416mg Ca(NO3)2.4H20, 392mg Mg(NO3)2.6H20, 57HigMgSO4.7H20, 233mg (NH4) 2S04, 27 Img KH2PO4, 27.85mgFeS04.7H20, 37.25mg Na2EDTA.2H20,根據(jù)Murashige和Skoog氏培養(yǎng)基的五分之一公布濃度的微量營養(yǎng)素，根據(jù)Morel和Wetmore氏培養(yǎng)基(Morel, G.和 R.H.WetmoreAmer.J.Bot.38: 138-40，1951)的維生素 0.05%(w/v)鹿糖，1.8%(w/v)甘露醇，0.25mg玉米素和41nM氯磺隆,用0.8%(w/v) Difco瓊脂固化。2-3周后將成熟的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。Ss致誘奪核堿某所有的ss致誘變核堿基由Eurogentec (Seraing, Belgium)合成，通過反相HPLC純化，重懸于無菌的milliQ水中。使用前，將ss致誘變核堿基加熱至95° C5分鐘。ss致誘變核堿基06Q262設(shè)計(jì)為:在煙草ALS基因(登錄號(hào)X07644)中密碼子位置P194上引入單個(gè)錯(cuò)配(有下劃線的核苷酸)，這將引起CCA至CAA(P194Q)的轉(zhuǎn)換。06Q261ss致誘變核堿基與煙草ALS基因序列完全匹配，作為陰性對(duì)照。06Q263SS致誘變核堿基由40個(gè)核苷酸的隨機(jī)組合組成，作為陰性對(duì)照。06Q2615’TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID I]06Q2625’TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 2]06Q2635’ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG[SEQ ID 3]毎個(gè)處理的原牛質(zhì)體存活率轉(zhuǎn)化后24小時(shí),使用突光活體染料二乙酸突光素(fluorescein diacetate, FDA)通過酯酶活性評(píng)估PEG轉(zhuǎn)化和電穿孔后原生質(zhì)體的存活率。將2 μ L的丙酮中的5mg.ml/1儲(chǔ)存液FDA加入ImL經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中。將整個(gè)群體中發(fā)熒光的原生質(zhì)體的部分用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。用裝有 GFP LP (EX480/40, DM505, BA510)過濾裝置的 Nikon Eclipse E600直立落射突光顯微鏡(epifluorescence microscope)進(jìn)行觀察。由IOOW高壓萊燈提供激發(fā)。使用連接至DS-Ul控制器(連接至運(yùn)行NIS Element圖像獲取/分析軟件的PC)的DS-2MBffc C⑶照相機(jī)獲取圖像。結(jié)果 使用PEG轉(zhuǎn)化和電穿孔的轉(zhuǎn)化結(jié)果的總結(jié)顯示于表I中。使用PEG轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體存活率顯著高于電穿孔。電穿孔本身的性質(zhì)比PEG轉(zhuǎn)化對(duì)于原生質(zhì)體的存活更有害，弓丨起高得多的恢復(fù)/存活比例以及較高的定向誘變效率。在氯磺隆存在的情況下孵育原生質(zhì)體后對(duì)定向誘變效率評(píng)分。
權(quán)利要求
1.一種在植物細(xì)胞原生質(zhì)體中定向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括將雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列與供體致誘變核堿基結(jié)合，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補(bǔ)的第二 DNA序列并且其中供體致誘變核堿基相對(duì)于要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列，優(yōu)選相對(duì)于第一 DNA序列包含至少一個(gè)錯(cuò)配，其中該方法進(jìn)一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將致誘變核堿基引入細(xì)胞原生質(zhì)體中的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基的長(zhǎng)度介于10-60個(gè)核苷酸之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3所述的方法，其中致誘變核堿基含有與錯(cuò)配距離至少一個(gè)核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核堿基的5’和3’末端距離至少3、4或5個(gè)核苷酸的鎖定的核酸(LNA)置換。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯(cuò)配的任一側(cè)距離至少一個(gè)核苷酸的兩個(gè)LNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基與核定位信號(hào)結(jié)合。
8.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的方法，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動(dòng)物人工染色體、細(xì)菌人 工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA或游離型DNA。
9.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的方法，其用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)至野生型改正突變、誘導(dǎo)突變、通過打亂編碼區(qū)而使酶失活、通過改變編碼區(qū)而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區(qū)而修飾蛋白。
10.PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用于增加植物原生質(zhì)體中使用致誘變核堿基的定向誘變的效率相對(duì)于基于電穿孔的轉(zhuǎn)化的效率至少10倍的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基，優(yōu)選地，其中單鏈致誘變核堿基的長(zhǎng)度介于10-60個(gè)核苷酸之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求10-11所述的用途，其中致誘變核堿基含有與定向錯(cuò)配距離至少一個(gè)核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核苷酸的5’和3’末端距離至少3、4或5個(gè)核苷酸的LNA置換。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯(cuò)配的任一側(cè)距離至少一個(gè)核苷酸的兩個(gè)LNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12所述的用途，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。
15.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的用途，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動(dòng)物人工染色體、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA或游離型DNA。
16.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的用途，用于改變細(xì)胞、通過恢復(fù)至野生型改正突變、誘導(dǎo)突變、通過打亂編碼區(qū)而使酶失活、通過改變編碼區(qū)而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區(qū)而修飾蛋白。
17.利用根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法或利用根據(jù)權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)所述的用途獲得的植物、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞原生質(zhì)體、植物愈傷組織或芽。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過聚乙二醇的介導(dǎo)將致誘變核堿基引入植物原生質(zhì)體的改進(jìn)的誘變方法。具體而言，本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞原生質(zhì)體中定向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括將雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列與供體致誘變核堿基結(jié)合，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，其中供體致誘變核堿基相對(duì)于要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列，優(yōu)選相對(duì)于第一DNA序列包含至少一個(gè)錯(cuò)配，其中該方法進(jìn)一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將供體致誘變核堿基引入細(xì)胞原生質(zhì)體中的步驟以及使用PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以增加定向誘變率。
文檔編號(hào)C12N15/87GK103146757SQ20131004701
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者P·邦道克, M·T·J·德博特, F·呂西耶 申請(qǐng)人:凱津公司