專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的dna分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生態(tài)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
外來(lái)生物入侵已成為當(dāng)今環(huán)境保護(hù)中最為迫切的問(wèn)題之一，其對(duì)世界各國(guó)的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、社會(huì)安全以及國(guó)際貿(mào)易都有著十分重要的影響。美國(guó)每年直接或間接用于入侵物種管理的費(fèi)用就高達(dá)1370億美元。中國(guó)同樣也已成為全球遭受外來(lái)物種入侵危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一，已發(fā)現(xiàn)外來(lái)入侵物種488種，其中50余種位列世界自然保護(hù)聯(lián)盟公布的全球100種最具威脅外來(lái)物種，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1200億元，治理投入更是難以估算。近年來(lái)入侵我國(guó)的外來(lái)生物更是呈現(xiàn)出傳入數(shù)量增多、傳入頻率加快、蔓延范圍擴(kuò)大、發(fā)生危害加劇、經(jīng)濟(jì)損失加重等趨勢(shì)。因此，生物入侵問(wèn)題越來(lái)越受到世人的關(guān)注，包括其成因、危害及控制技術(shù)等諸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在競(jìng)爭(zhēng)性排斥、生態(tài)位替代、生物學(xué)特性、化感、捕食、寄生等生態(tài)過(guò)程，缺乏對(duì)其種群動(dòng)態(tài)、快速適應(yīng)與進(jìn)化模式、快速入侵與擴(kuò)張動(dòng)力等入侵機(jī)制方面的理解。DNA分子標(biāo)記(DNA molecular markers)本質(zhì)上是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，也即基因型在DNA水平上的表現(xiàn)形式。這種DNA片段是基因組DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶切割，或分子雜交后在電泳凝膠上檢測(cè)得到的。目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要包括三類(lèi):(I)以分子雜交為基礎(chǔ)的，如RFLP、VNTR等；(2)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的，如RAPD、AFLP, DAF、STS、SSR、SCAR等；(3)利用DNA芯片、直接測(cè)序等方法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。單核苷酸多態(tài)性是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記可幫助區(qū)分個(gè)體間遺傳物質(zhì)的差異。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的成熟及其在分子生態(tài)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，外來(lái)物種入侵機(jī)理日益成為國(guó)際上研究的重點(diǎn)。大量的研究表明外來(lái)入侵種能在如此短的時(shí)間內(nèi)迅速地做出適應(yīng)性的進(jìn)化，可能與其自身的遺傳結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因而，在外來(lái)入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外來(lái)入侵物種遺傳本質(zhì)的方法?；セ撞?Spartina alternif1ra)是一種原產(chǎn)北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護(hù)堤作用顯著而被許多國(guó)家引種。1979年，南京大學(xué)從美國(guó)東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅里達(dá)引種了 3種不同生態(tài)型互花米草至福建羅源灣，隨后擴(kuò)大分布至我國(guó)海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區(qū)域，并取得了一定的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。但作為外來(lái)物種，其強(qiáng)大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對(duì)我國(guó)沿海灘涂地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)、生物多樣性和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響，2003年被環(huán)保總局列入我國(guó)第一批16種外來(lái)入侵物種名單。因此，對(duì)其入侵過(guò)程和擴(kuò)張機(jī)制的研究已刻不容緩。本發(fā)明以列入中國(guó)首批外來(lái)入侵物種的互花米草為對(duì)象，在整個(gè)基因組內(nèi)批量尋找多態(tài)性位點(diǎn)，全面評(píng)估外來(lái)入侵物種的多樣性，并揭示其遺傳本質(zhì)和入侵機(jī)制，為進(jìn)一步研究和控制外來(lái)入侵物種提供有力的技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草的分子標(biāo)記方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)引入的不同種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質(zhì)和入侵機(jī)制，進(jìn)一步研究和控制外來(lái)入侵物種提供有力的技術(shù)支持。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，步驟如下:1)種群調(diào)查及取樣；2) DNA 提??；3)測(cè)序;4)篩選目標(biāo)基因R52;5)根據(jù)目標(biāo)基因R52設(shè)計(jì)引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；6) PCR 擴(kuò)增；7)測(cè)序；8)序列拼接、比對(duì)，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。進(jìn)一步地，所述目標(biāo)基因R52是通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后篩選得到。進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,37 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min.進(jìn)一步地，所述目標(biāo)基因R52在互花米草種群中有8個(gè)SNP位點(diǎn)，目標(biāo)基因R52基因片段序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個(gè)SNP位點(diǎn)分別位于118、212、251、305、578、869、934、962。進(jìn)一步地,高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA,構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù),插入片段長(zhǎng)度約為500bp,在illuminaHiSeq2000測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，使用Trinity軟件對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，從而得到基因序列。本發(fā)明的有益效果:包括互花米草在內(nèi)的許多外來(lái)入侵物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數(shù)據(jù)，在進(jìn)行傳統(tǒng)的各種傳統(tǒng)分子標(biāo)記分析時(shí)，如RAPD、SSR、AFLP，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較差，假陽(yáng)性率偏高。而且，傳統(tǒng)分子標(biāo)記一次實(shí)驗(yàn)只能找到少量多態(tài)性位點(diǎn)信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明在一次實(shí)驗(yàn)中，即可得到8個(gè)單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)，提供豐富的多態(tài)性信息。同時(shí)，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，成功率高，可重復(fù)性好。在實(shí)施過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)成功率在98%以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性更達(dá)到100%。本發(fā)明采用的8個(gè)SNP位點(diǎn)，單倍體基因型理論上可以達(dá)到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態(tài)性信息，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。SNP標(biāo)記遺傳穩(wěn)定，可用于不同來(lái)源的樣本，適宜高通量自動(dòng)化分析。
具體實(shí)施方式
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下面結(jié)合具體樣本對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1.種群調(diào)查及取樣最早引入外來(lái)入侵物種的地區(qū)，福建羅源灣的互花米草是我國(guó)的最原始種群，將其作為采樣點(diǎn)。上海崇明島距離分析點(diǎn)較近，采集后樣品保存度高，將其作為采樣點(diǎn)。選取生長(zhǎng)良好、無(wú)蟲(chóng)害的葉片，采下后立刻放入事先準(zhǔn)備好的裝有約半袋硅膠的自封袋里，混勻使葉片與硅膠充分混合，以便快速脫水。帶回實(shí)驗(yàn)室后根據(jù)實(shí)際情況更換已經(jīng)變色的硅膠，干燥之后待提取DNA用。每一采樣點(diǎn)隨機(jī)取樣30株左右，個(gè)體間的間距不小于50米，以盡可能避免重復(fù)采集同一克隆，記錄每一樣本的編號(hào)、生境、地理參數(shù)(經(jīng)緯度)、樣品高度，樣品直徑等詳細(xì)信息。2.DNA 提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，具體步驟稍作調(diào)整:(I)稱(chēng)取0.07-0.1g干葉，用剪刀剪碎；用液氮冷凍研缽、研棒，將材料倒入盛有液氮的研缽中，用力磨成粉末，在研磨過(guò)程中注意不要讓材料反復(fù)凍融。(2)將研磨好的粉末用勺小心地轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入450uL LP Buffer的2.0ml離心管中，混合均勻。(3)65°C金屬浴中溫浴30-60分鐘(溫浴過(guò)程中間隔振蕩2_3次)，然后移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5分鐘。(5)于13，OO Orpm離心10分鐘，再將上清液轉(zhuǎn)移至Shredder spin column中,13, OOOrpm離心I分鐘。(6)將濾液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中。(7)加入濾液體積1.5倍的P Binding Buffer,輕柔的混合均勻，管中出現(xiàn)絮狀沉淀，13, OOOrpm離心10分鐘。(8)將上清液轉(zhuǎn)移至Spin column。于7，500rpm離心一分鐘,并棄去接液管中液體。(9)向 Spin column 中加入 500uL 的 G Binding Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，
并棄去接液管中液體。(10)向 Spin column 中加入 600uL 的 Wash Buffer。12, OOOrpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。(11)重復(fù)步驟10，一次。(12)再次將 Spin column 于 12，OOOrpm 離心 I 分鐘，并將 Spin column 轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5ml離心管。(13)向Spin column中加入IOOuL至200uL65°C溫浴的去離子水，并于室溫溫浴2-3分鐘。(14)于12, OOOrpm離心I分鐘，并棄去Spin column。DNA存在于1.5ml離心管液體中，-20°C保存?zhèn)溆谩?.高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序包括互花米草在內(nèi)的許多外來(lái)入侵物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數(shù)據(jù)，在進(jìn)行AFLP分子標(biāo)記與錨定PCR實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較差，假陽(yáng)性率偏高。因此，我們選擇使用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不需要了解物種基因信息，能夠?qū)θ我馕锓N進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并能測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的片段序列，精確到單核苷酸的分辨率；能夠同時(shí)鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本，以及檢測(cè)基因家族中相似基因和可變剪接造成的不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。高通量測(cè)序的步驟是:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA，合成雙鏈cDNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，插入片段長(zhǎng)度約為500bp，在illuminaHiSeq2000測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，使用Trinity軟件對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，從而得到基因序列。4.篩選目標(biāo)基因?qū)Φ玫降霓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行行篩選，去除多拷貝及重復(fù)基因，找到易于擴(kuò)增的片段R52。R52基因片段序列如SEQ ID NO:3所示。5.根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)引物，引物的序列為:正向引物如SEQ ID NO:1 所不:cccaagaagt actgcataga gc反向引物如SEQ ID NO:2 所示:gagtgtggac cattacagga ac6.PCR 擴(kuò)增設(shè)計(jì)50ul PCR 擴(kuò)增體系，具體的組成為:34u I dH20, 5u 110 X Buffer (Mg2+), 4u IdNTP Mixture (2.5mM)、0.5ul Trans T-Taq(5U/μ I)2.5ul Template DNA (20_40ng/μ L)2ul正向引物(10yM)、2ul反向引物(10 μ Μ)。PCR 反應(yīng)條 件為:94°C 3min 預(yù)變性，94°C 30s、54°C 30s,72°C 1.5min37 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 lOmin。7.測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，確定為目的條帶且無(wú)雜帶干擾。使用上海捷倍思基因技術(shù)有限公司的PCR clea-up Kit直接清潔PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物濃度達(dá)到測(cè)序要求后，進(jìn)行直接雙向測(cè)序。8.序列拼接、比對(duì)和分析所得的序列用Sequencher軟件進(jìn)行拼接并根據(jù)峰圖進(jìn)行手工校正，然后利用Mega軟件進(jìn)行比對(duì)排列，經(jīng)比對(duì)，兩端切齊后長(zhǎng)度1005bp，GC含量為57.6%。R52片段測(cè)序質(zhì)量很高，峰型清晰，無(wú)雜峰?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)序峰形清晰鑒定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。9.對(duì)福建羅源灣和上海崇明島的互花米草種群進(jìn)行鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。表I福建羅源灣和上海崇明島的互花米草種群?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性位點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于， 步驟如下: 1)種群調(diào)查及取樣； 2)DNA提??； 3)測(cè)序； 4)篩選種群的目標(biāo)基因R52; 5)根據(jù)目標(biāo)基因R52設(shè)計(jì)引物，正向引物如序列表中SEQID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示； 6)PCR擴(kuò)增； 7)測(cè)序； 8)序列拼接、比對(duì)，鑒定記錄單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因R52是通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后篩選得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:941:預(yù)變性31^11，941: 30s、54°C 30s,72°C 1.5min，37個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于，所 述目標(biāo)基因R52在互花米草種群中有8個(gè)SNP位點(diǎn)，目標(biāo)基因R52基因片段如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個(gè)SNP位點(diǎn)分別位于118、212、251、305、578、869、934、962。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，其特征在于，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，插入片段長(zhǎng)度約為500bp，在illumina HiSeq2000測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，使用Trinity軟件對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，從而得到基因序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定外來(lái)入侵物種互花米草種群的DNA分子標(biāo)記方法，本方法根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選得到目標(biāo)基因，通過(guò)PCR反應(yīng)、PCR產(chǎn)物測(cè)序得到多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。再由所有有效的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)組成單倍體型用于分子標(biāo)記以達(dá)到遺傳分型。本發(fā)明在一次實(shí)驗(yàn)中，即可得到豐富的多態(tài)性信息。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記遺傳穩(wěn)定，可用于不同來(lái)源的樣本，適宜高通量自動(dòng)化分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146816SQ20131004689
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者陳建群, 許穎, 王強(qiáng), 丁靜, 吳娟子 申請(qǐng)人:南京大學(xué)