專利名稱：一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術領域，涉及谷氨酸的生產(chǎn)，尤其是一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法。
背景技術：
目前，國內(nèi)大多數(shù)的谷氨酸生產(chǎn)企業(yè)采用生物素缺陷型菌株，采用生物素“亞適量”或者“超亞適量”的發(fā)酵工藝。但是，這兩種發(fā)酵工藝都要求控制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的含量，不能超過限量水平，從而導致發(fā)酵中后期發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素嚴重缺乏，菌體活力和產(chǎn)酸速率受限。可見，“亞適量”或者“超亞適量”谷氨酸發(fā)酵工藝存在生物素貧乏的問題，是不利于提高發(fā)酵產(chǎn)酸速率的。國外很多企業(yè)采用高生物素添加青霉素流加糖發(fā)酵工藝，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大量的生物素，但是必須嚴格控制好添加青霉素的時間與濃度，否則會嚴重影響正常產(chǎn)酸。因此，操作要求苛刻，很難把握，國內(nèi)企業(yè)很少采用此方法。谷氨酸發(fā)酵菌株是生物素缺陷型菌株，不能自身合成生物素。生物素作為丙酮酸羧化酶的輔酶，催化丙酮酸羧化生成草酞乙酸，并促使草酰琥珀酸轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸，并進而轉(zhuǎn)化為谷氨酸。當生物素過量時，由于細胞內(nèi)有大量的磷脂質(zhì)，使細胞壁、細胞膜增厚，不利于谷氨酸的分泌，造成產(chǎn)酸率下降，影響發(fā)酵生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。只有在生物素限量的情況下，菌體生長與產(chǎn)酸才趨于平衡。但是，在生物素限量的情況下，發(fā)酵中后期發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素消耗殆盡，菌體缺乏生物素，導致谷氨酸合成中的關鍵反應(即丙酮酸羧化生成草酰乙酸)中的丙酮酸羧化酶活力減弱，進而導致谷氨酸發(fā)酵速率降低。青霉素可以在菌體生長繁殖時阻抑胞壁合成，增加細胞膜通透性，促使細胞內(nèi)的谷氨酸外漏和積累，因此允許培養(yǎng)基中有大量的生物素存在。通過檢索，發(fā)現(xiàn)三篇與本專利申請相關的專利公開文獻:1、一種谷氨酸的生 產(chǎn)方法(CN101440386)，涉及一種谷氨酸的生產(chǎn)方法，包括一級種培養(yǎng)，二級種培養(yǎng)，三級種培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵，其特征是:上述二級種培養(yǎng)、三級種培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵的底料中均添加有生物素，且采用大種量接種和在發(fā)酵過程中流加糖技術。本發(fā)明工藝方法獨特，相較于現(xiàn)有技術而言產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率提高，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，谷氨酸產(chǎn)量高，且節(jié)電節(jié)水，原料用量少。2、基于pH的反饋補料生產(chǎn)谷氨酸的方法(CN1982467)，該方法在好氧發(fā)酵時，按照發(fā)酵液中葡萄糖消耗量和氨消耗量之間的比例關系配制葡萄糖和氨的混合溶液，通過向發(fā)酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液來控制發(fā)酵液的PH在6.5 7.5之間，使之既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成限制，至將預先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗盡時停止。該方法利用PH值反饋控制補料，簡化了生產(chǎn)工藝，在不增加額外設備的情況下提高了谷氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。3、玉米浸泡水用于生物素亞適量發(fā)酵工藝生產(chǎn)谷氨酸的方法(CN102154397A)，公開了一種玉米浸泡水用于生物素亞適量發(fā)酵工藝生產(chǎn)谷氨酸的方法，其創(chuàng)新性在于，用玉米浸泡水代替生物素亞適量發(fā)酵工藝中的玉米漿制備發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。該工藝技術操作方便，節(jié)水節(jié)能，有利于降低谷氨酸的發(fā)酵成本，適于在生產(chǎn)中全面推廣。本發(fā)明不僅可節(jié)省配料用的一次水，也大大節(jié)省玉米浸泡水進一步蒸發(fā)濃縮所消耗的能源，解決了利用玉米浸泡水生產(chǎn)玉米漿(粉)所造成的環(huán)境污染和能源消耗問題，同時其產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率也有所提聞。通過對比，本發(fā)明專利申請與上述專利公開文獻存在本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提出一種操作簡單、控制方便，能有效解決發(fā)酵中后期生物素匱乏，有效提高產(chǎn)酸速率，降低生產(chǎn)成本的谷氨酸生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟包括:以生物素缺陷型菌株為生產(chǎn)菌株，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中初始生物素的含量，在發(fā)酵過程中補加青霉素和生物素。而且，所述的發(fā)酵方法，其特征在于:步驟如下:(I)將OD值為0.9 1.2的生物素缺陷型菌株的種子培養(yǎng)液按種子培養(yǎng)液:發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為0.05、.2:1的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始生物素含量為5 μ g/L 65 μ g/L ;發(fā)酵溫度控制在32 40。。;補充氮源至pH為6.5 7.5，控制通氣量為
0.1^0.5vvm ；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)至6 24h的期間先補加青霉素，然后補加生物素；發(fā)酵培養(yǎng)至8 14h后，補加葡萄糖至發(fā)酵液中 終質(zhì)量濃度為l(Tl40g/L ；(3)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至26 32h后發(fā)酵結(jié)束，即得谷氨酸。而且，所述種子培養(yǎng)液的活化方法如下:(I)從斜面上接生物素缺陷型菌株于種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，OD值為0.6 1.0，得菌株活化液；(2)將菌株活化液按體積比為0.05、.2:1的比例接入種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，得種子培養(yǎng)液；其中，所述種子培養(yǎng)基為:葡萄糖20 35g/L，玉米漿l(T20g/L，糖蜜5 15 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 0.9g/L，KCl 1.(Tl.5g/L,MnSO4 0.00025 0.0015g/L,VB1 0.ΟΟΟΓΟ.0005g/L，Na2HPO4 1.5 2.5g/L，純生物素 0 30 μ g/L。而且，所述步驟⑵中補加青霉素為在發(fā)酵培養(yǎng)至6 24h的期間一次添加青霉素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中青霉素含量為Γ25個單位/毫升。而且，所述步驟⑵中補加青霉素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間2 4次添加青霉素，每次使發(fā)酵培養(yǎng)基中青霉素含量為Γ25個單位/毫升。而且，所述步驟⑵中補加生物素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間一次補加生物素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量達到5(Γ500 μ g/L。而且，所述步驟⑵中補加生物素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間連續(xù)補加生物素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為:Γ30 μ g/L。而且，所述步驟⑴中氮源為氨水或液氨；所述碳源為葡萄糖。而且，所述生物素來源于玉米漿、菌體蛋白、糖蜜、質(zhì)量含量大于95%的純生物素中的一種或兩種以上的混合物。
而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖12(Tl50g/L，玉米漿1.(Γ2.5g/L，糖蜜0.5 1.5 g/L, MgSO4.7H20 0.5 0.9g/L, KCl 1.5 2.5g/L, MnSO40.003 0.006g/L, Vbi
0.0005 0.0008g/L，Na2HPO4 1.5 3.5g/L，純生物素 0 20 μ g/L,消泡劑 0.2 0.4g/L ；其中，玉米漿中玉米漿固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為30-50%，生物素質(zhì)量含量為60(Γ800μ g/L ;糖蜜中糖蜜固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為30-60%，生物素質(zhì)量含量為2000^3000 μ g/Lo本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果是:1、本發(fā)明發(fā)酵方法在發(fā)酵過程的中后期添加青霉素和生物素，可以克服“亞適量”工藝發(fā)酵后期生物素貧乏的問題，保證了培養(yǎng)基中含有充足的生物素以提供菌體的生長和代謝，大大提高了菌體的谷氨酸的合成速度，相較于現(xiàn)有的谷氨酸亞適量發(fā)酵工藝，單位菌體的產(chǎn)酸速率提高了 10%以上，大大縮短了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明發(fā)酵方法利用了生物素“亞適量”的工藝特點，在發(fā)酵初始培養(yǎng)基中控制生物素的添加量，保證了菌體具有良好的細胞通透性，有利于谷氨酸分泌，方法操作簡單、控制方便。3、本發(fā)明發(fā)酵方法由于青霉素和生物素是在菌體具備良好的通透性后才添加的，而且生物素是在青霉素補加后才添加的，因此添加時間和添加量容易控制，操作簡單，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)應用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護 范圍。下述實施實例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法以生物素缺陷型菌株為生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵初期控制培養(yǎng)基初始生物素含量，進行“亞適量”培養(yǎng)，待菌體從生長型轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)酸型后，補加青霉素和生物素，提高了菌體的產(chǎn)酸能力。本發(fā)明中所使用的微生物菌株為生物素缺陷型的谷氨酸棒狀桿菌S9114 (Corynebacterium glutamicum S9114)。本發(fā)明中所使用的生物素來源于玉米漿、菌體蛋白、糖蜜、純生物素(質(zhì)量含量大于95%)中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明中所使用的玉米漿中玉米漿固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為3(Γ50%，生物素質(zhì)量含量為60(Γ800 μ g/L ;糖蜜中糖蜜固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為3(Γ60%，生物素質(zhì)量含量為2000^3000 μ g/Lo實施例1:本實施例中所使用的培養(yǎng)基有三種:⑴種子培養(yǎng)基:葡萄糖26g/L,玉米衆(zhòng) 10g/L,糖蜜 5g/L, MgSO4.7Η20 0.9g/L,KCl
1.2g/L，MnSO4 0.00025g/L，Vbi 0.0002g/L，Na2HPO4 1.5g/L，純生物素 0 μ g/L, pH 為 7.0，120°C滅菌20分鐘；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 130g/L，玉米漿 2.5g/L，糖蜜 1.5 g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO4 0.006g/L, Vbi 0.0005g/L, Na2HPO4 3.5g/L，純生物素 14 μ g/L,泡敵
0.3g/L, pH 為 7.0，115°C滅菌 20 分鐘；⑶補加糖液:補加糖液為葡萄糖的質(zhì)量濃度為600 g/L的葡萄糖液，115°C滅菌20分鐘。一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟如下:(I)將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的生物素缺陷型谷氨酸棒狀桿菌S9114接入己滅菌的裝有250ml種子培養(yǎng)基的IL的三角瓶內(nèi)，32°C振蕩培養(yǎng)8h，得菌株活化液(0D值為0.6 1.0),置于4°C冰箱內(nèi)冷藏備用；將活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液:種子培養(yǎng)基的體積比為0.05、.2:1的比例接入種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，得種子培養(yǎng)液(0D值為0.9 1.2)；(2)將500ml種子培養(yǎng)液接入5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為20.4 μ g/L，發(fā)酵溫度控制在32 40°C ;采用連續(xù)流加質(zhì)量分數(shù)為28%的氨水的方式補充氮源至發(fā)酵液的PH為6.5^7.5 ;根據(jù)發(fā)酵過程中菌體需氧量，控制通氣量為0.Γ0.5vvm ；控制發(fā)酵轉(zhuǎn)速為30(T600rpm，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)至9.5小時后，加入120000單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml);在加入青霉素半小時后，加入IL補加糖液和2mg生物素(生物素濃度為0.1 g/L)；(4)發(fā)酵培養(yǎng)至28小時后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到谷氨酸。經(jīng)檢測，發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸水平為107.8g/L，谷氨酸最大比生成速率為0.054^1.
實施例2:本實施例中所使 用的培養(yǎng)基有三種:(I)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 35g/L,玉米衆(zhòng) llg/L,糖蜜 5g/L, MgSO4.7H20 0.6g/L,KCl 1.0g/L, MnSO4 0.00025g/L,VB1 0.0001 g/L，Na2HPO4 2.5g/L，純生物素 0 μ g/L，pH 為 7.0，120°C滅菌20分鐘。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 130g/L，玉米漿 2.5g/L，糖蜜 1.5 g/L,MgSO4.7Η20 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO40.003g/L, Vbi 0.0005g/L, Na2HPO4 3.5g/L，純生物素 24 μ g/L,泡敵
0.3g/L, pH 為 7.0，115°C滅菌 20 分鐘。(3)補加糖:補加糖液為葡萄糖的質(zhì)量濃度為600 g/L的葡萄糖液，115°C滅菌20分鐘。一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟如下:(I)將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的生物素缺陷型谷氨酸棒狀桿菌S9114接入己滅菌的裝有250ml種子培養(yǎng)基的IL的三角瓶內(nèi)，32°C振8h，得菌株活化液(0D值為0.6 1.0)，置于4°C冰箱冷藏備用；將活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液:種子培養(yǎng)基的體積比為0.05、.2:1的比例接入種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，得種子培養(yǎng)液菌株活化液(0D值為0.9^1.2)；(2)將500ml種子培養(yǎng)液接入5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為30.4 μ g/L，發(fā)酵溫度控制在32 40°C ;采用連續(xù)流加質(zhì)量分數(shù)為28%的氨水的方式補充氮源至發(fā)酵液的PH為6.5^7.5 ;根據(jù)發(fā)酵過程中菌體需氧量，控制通氣量為0.Γ0.5vvm ；控制發(fā)酵轉(zhuǎn)速為30(T600rpm，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)12小時后，加入60000單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml);在加入青霉素后，以100ml/h流速補加含有2mg生物素的IL補加糖液，發(fā)酵培養(yǎng)至24小時；其中，在發(fā)酵培養(yǎng)至18小時和24小時時，再分別補加26000單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml)；(4)發(fā)酵培養(yǎng)至28小時后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到谷氨酸。經(jīng)檢測，發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸水平為11.lg/L，谷氨酸最大比生成速率為0.0571!'實施例3:
本實施例中所使用的培養(yǎng)基有三種:(I)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 20g/L,玉米衆(zhòng) 13g/L,糖蜜 5g/L, MgSO4.7H20 0.7g/L,KCl 1.0g/L, MnSO4 0.00025g/L,VB1 0.0001 g/L，Na2HPO4 1.5g/L，純生物素 0 μ g/L，pH 為 7.0，120°C滅菌20分鐘。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 130g/L，玉米漿 2.5g/L，糖蜜 1.5 g/L,MgSO4.7Η20 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO40.003g/L, Vbi 0.0005g/L, Na2HPO4 3.5g/L，純生物素 24 μ g/L,泡敵
0.3g/L, pH 為 7.0，115°C滅菌 20 分鐘。(3)補加糖:補加糖液為葡萄糖的質(zhì)量濃度為600 g/L的葡萄糖液，115°C滅菌20分鐘。一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟如下:(1)將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的生物素缺陷型谷氨酸棒狀桿菌S9114接入己滅菌的裝有250ml種子培養(yǎng)基的IL三角瓶內(nèi)，32°C振蕩培養(yǎng)8h，得菌株活化液(0D值為0.6^1.0)；將活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液:種子培養(yǎng)基的體積比為
0.05、.2:1的比例接入種子培養(yǎng)基中，3(Γ35 V振蕩培養(yǎng)6 IOh，得種子培養(yǎng)液(OD值為
0.9 1.2)；(2)將500ml種子培養(yǎng)液接入5L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵初始發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為30.4 μ g/L，發(fā)酵溫度控制在32 40°C ;采用連續(xù)流加質(zhì)量分數(shù)為28%的氨水的方式補充氮源至發(fā)酵液的6.5^7.5 ;根據(jù)發(fā)酵過程中菌體需氧量，控制通氣量為0.Γ0.5vvm ;控制發(fā)酵轉(zhuǎn)速為30(T600rpm，進行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)至12小時時，加入80000單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml);在加入青霉素后，以100ml/h流速補加含有0.6mg生物素的IL補加糖液至發(fā)酵培養(yǎng)至24小時；(4)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至28小時后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到谷氨酸。經(jīng)檢測，發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸水平為10.5g/L，谷氨酸最大比生成速率為0.057^1.
實施例4:二級種子罐:3m3通用式發(fā)酵罐。發(fā)酵罐:20m3通用式發(fā)酵罐。一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟如下:(I) 一級種子的培養(yǎng):配種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，玉米漿13g/L，糖蜜5g/L，MgSO4.7H20 0.7g/L, KCl 1.0g/L, MnSO4 0.00025g/L, Vbi 0.0OOlg/L, Na2HPO4 1.5g/L，純生物素0 μ g/L), pH為7.0，120°C滅菌20分鐘；待冷卻至35°C后，將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的生物素缺陷型谷氨酸棒狀桿菌S9114接入己滅菌的裝有250ml種子培養(yǎng)基的IL的三角瓶內(nèi)，32°C振蕩培養(yǎng)8h，得一級種子(OD值為0.6 1.0)；(2) 二級種子培養(yǎng):配種子培養(yǎng)基(葡萄糖35g/L，玉米漿20g/L，糖蜜5 g/L,MgSO4.7H20 0.9g/L, KCl 1.5g/L, MnSO4 0.00025g/L, Vbi 0.0OOlg/L, Na2HPO4 1.5g/L，純生物素0μ g/L，)1.8m3，pH為7.0，120°C滅菌8分鐘，待冷卻至35°C后，按照8%-12%的接種量接入一級種子進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33-35°C，培養(yǎng)時間7-9小時，通風比0.25、.35vvm, OD值達到0.9 1.2后接入發(fā)酵iip中；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖130g/L，玉米漿1.2g/L，糖蜜1.5 g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L, KCl 1.5g/L, MnSO4 0.004g/L, Vbi 0.0005g/L, Na2HPO4 3.0g/L,純生物素13118/1，泡敵0.38/17 m3，120°C滅菌8分鐘，發(fā)酵初始發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為19.8 μ g/L,待冷卻至35°C后，按照20%-25%的接種量接入二級種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在32 40°C;采用連續(xù)流加液氨的方式補充氮源至發(fā)酵液的pH為6.5^7.5 ;根據(jù)發(fā)酵過程中菌體需氧量，控制通氣量為0.Γ0.5vvm ;控制發(fā)酵轉(zhuǎn)速為lOOlOOrpm ；(4)發(fā)酵培養(yǎng)至12小時時，加入1.12億單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml);加入青霉素后，繼續(xù)流加1.8 m3含有0.84g生物素的500 g/L濃縮糖液至發(fā)酵培養(yǎng)24小時；(5)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至30小時后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到谷氨酸。經(jīng)檢測，發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸水平為12.0g/L，谷氨酸最大比生成速率為0.063^1.
實施例5:二級種子罐:3m3通用式發(fā)酵罐。發(fā)酵罐:20m3通用式發(fā)酵罐。一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟如下:(I) 一級種子的培養(yǎng):配種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，玉米漿13g/L，糖蜜5g/L，MgSO4.7Η20 0.7g/L, KCl 1.0g/L, MnSO4 0.00025g/L,VB1 0.0OOlg/L, Na2HPO4 1.5g/L，純生物素0 μ g/L)，pH為7.0，120°C滅菌20分鐘，待冷卻至35°C后，將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的生物素缺陷型谷氨酸棒狀桿菌S9114接入己滅菌的裝有250ml種子培養(yǎng)基的IL的三角瓶內(nèi)，32°C震蕩培養(yǎng)8h，得一級種子(0D值為0.6^1.0)；(2) 二級種子培養(yǎng):配種子培養(yǎng)基(葡萄糖35g/L，玉米漿20g/L，糖蜜5 g/L,MgSO4.7H20 0.9g/L, KCl 1.5g/L, MnSO4 0.00025g/L, Vbi 0.0OOlg/L, Na2HPO4 1.5g/L，純生物素0μ g/L，)1.8m3，pH為7.0，120°C滅菌8分鐘，待冷卻至35°C后，按照8%-12%的接種量接入一級種子進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度33-35°C，培養(yǎng)時間7-9小時，通風比0.25、.35 vvm, OD值達到0.9 1.2后接入發(fā)酵iil中；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖130g/L，玉米漿1.2g/L，糖蜜1.5 g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L, KCl 1.5g/L, MnSO4 0.004g/L, Vbi 0.0005g/L, Na2HPO4 3.0g/L，純生物素23 μ g/L,泡敵0.3g/L) 7 m3，120°C滅菌8分鐘，發(fā)酵初始發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為29.8 μ g/L,待冷卻至35°C后，按照20%-25%的接種量接入二級種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在32 40°C;采用連續(xù)流加液氨的方式補充氮源至發(fā)酵液的pH為6.5^7.5 ;根據(jù)發(fā)酵過程中菌體需氧量， 控制通氣量為0.Γ0.5vvm ;控制發(fā)酵轉(zhuǎn)速為lOOlOOrpm ；(4)發(fā)酵培養(yǎng)至12小時時，加入0.84億單位青霉素(青霉素濃度為160萬單位/ml);加入青霉素后，繼續(xù)流加2.25 m3含有2.3g生物素的400 g/L濃縮糖液至發(fā)酵培養(yǎng)24小時；其中，在發(fā)酵培養(yǎng)至18小時和24小時時，再分別補加0.36億單位青霉素；(5)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至32小時后發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵得到谷氨酸。經(jīng)檢測，發(fā)酵產(chǎn)谷 氨水平為11.2g/L，谷氨酸最大比生成速率為0.0eir10
權(quán)利要求
1.一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:步驟包括:以生物素缺陷型菌株為生產(chǎn)菌株，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中初始生物素的含量，在發(fā)酵過程中補加青霉素和生物素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其特征在于:步驟如下: (1)將OD值為0.9^1.2的生物素缺陷型菌株的種子培養(yǎng)液按種子培養(yǎng)液:發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為0.05、.2:1的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中初始生物素含量為5 μ g/L 65 μ g/L ;發(fā)酵溫度控制在32 40。。;補充氮源至pH為6.5 7.5，控制通氣量為0.1 0.5vvm ； (2)在發(fā)酵培養(yǎng)至6 24h的期間先補加青霉素，然后補加生物素；發(fā)酵培養(yǎng)至8 14h后，補加葡萄糖至發(fā)酵液中終質(zhì)量濃度為l(Tl40g/L ； (3)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至26 32h后發(fā)酵結(jié)束，即得谷氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)液的活化方法如下: (1)從斜面上接生物素缺陷型菌株于種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，OD值為0.6 1.0，得菌株活化 液； (2)將菌株活化液按體積比為0.05、.2:1的比例接入種子培養(yǎng)基中，3(T35°C振蕩培養(yǎng)6 10h，得種子培養(yǎng)液； 其中，所述種子培養(yǎng)基 為:葡萄糖2(T35g/L，玉米漿l(T20g/L，糖蜜5 15 g/L,MgSO4.7Η20 0.5 0.9g/L，KCl 1.(Tl.5g/L,MnSO4 0.00025 0.0015g/L,VB1 0.ΟΟΟΓΟ.0005g/L，Na2HPO4 1.5 2.5g/L，純生物素 0 30 μ g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟⑵中補加青霉素為在發(fā)酵培養(yǎng)至6 24h的期間一次添加青霉素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中青霉素含量為Γ25個單位/毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟⑵中補加青霉素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間2 4次添加青霉素，每次使發(fā)酵培養(yǎng)基中青霉素含量為Γ25個單位/毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟⑵中補加生物素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間一次補加生物素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量達到5(Γ500 μ g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟⑵中補加生物素為在發(fā)酵培養(yǎng)6 24h的期間連續(xù)補加生物素，使發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量為3 30 μ g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述步驟⑴中氮源為氨水或液氨；所述碳源為葡萄糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述生物素來源于玉米漿、菌體蛋白、糖蜜、質(zhì)量含量大于95%的純生物素中的一種或兩種以上的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至8任一項所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖 120 150g/L，玉米漿 1.0 2.5g/L，糖蜜 0.5 1.5 g/L, MgSO4.7H20 0.5 0.9g/L, KCl1.5 2.5g/L, MnSO40.003 0.006g/L, Vbi 0.0005 0.0008g/L, Na2HPO4 1.5 3.5g/L，純生物素0 20 μ g/L,消泡劑 0.2 0.4g/L ； 其中，玉米漿中玉米漿固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為30-50%，生物素質(zhì)量含量為600^800 μ g/L;糖蜜中糖蜜固形物含量的質(zhì)量分數(shù)為30_60%，生物素質(zhì)量含量為2000^3000 μ g/Lo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種補加生物素的生產(chǎn)谷氨酸的發(fā)酵方法，步驟包括以生物素缺陷型菌株為生產(chǎn)菌株，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中初始生物素的含量，在發(fā)酵過程中補加青霉素和生物素。本發(fā)明發(fā)酵方法在發(fā)酵過程的中后期添加青霉素和生物素，可以克服“亞適量”工藝發(fā)酵后期生物素貧乏的問題，保證了培養(yǎng)基中含有充足的生物素提供菌體的生長和代謝，大大提高了菌體的谷氨酸的合成速度，相較于現(xiàn)有的谷氨酸亞適量發(fā)酵工藝，單位菌體的產(chǎn)酸速率提高了10%以上，大大縮短了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P13/18GK103088081SQ20131004684
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者俞建良, 耿興山, 王曉健, 賀玉明, 王曉麗, 白長勝 申請人:中糧生化能源(龍江)有限公司