專利名稱：通過發(fā)酵生產(chǎn)l－谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵來生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一種重要的氨基酸，被應(yīng)用于食品，臨床藥物及其它方面。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，L-谷氨酸主要是通過發(fā)酵，用屬于短桿菌屬、棒狀桿菌屬或微菌屬的所謂的生產(chǎn)L-谷氨酸棒狀細(xì)菌或其突變體進(jìn)行生產(chǎn)的(Amino Acid Fermentotios，Gakkai Shuppan Center，195-215(1986))。已知的使用其它細(xì)菌菌株來生產(chǎn)L-谷氨基的發(fā)酵方法有使用包括桿菌、鏈霉菌以及青霉素的微生物的方法(美國專利第3,220,929號(hào))；以及使用包括假單孢菌屬、節(jié)核細(xì)菌屬、沙雷氏菌屬以及假絲酵母的微生物的方法(美國專利第3,563,857號(hào))。雖然通過使用傳統(tǒng)的方法已經(jīng)可以大大提高L-谷氨酸的生產(chǎn)能力，但是為了滿足日益增加的需求，仍需要發(fā)展一種更有效、更廉價(jià)的生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。
L-谷氨酸是由微生物細(xì)胞內(nèi)檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物α-酮戊二酸通過生物合成而來的。由α-酮戊二酸通過銨離子的同化作用來形成L-谷氨酸的生物合成途徑有兩條。其中一條途徑是在有高濃度的銨離子存在的情況下，通過谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，下文稱“GDH”)的催化來合成L-谷氨酸。另外一條途徑(GS/GOGAT途徑)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶來合成L-谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，下文稱“GS”)催化L-谷氨酸和銨離子轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的反應(yīng)；谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-oxoglutaric acid amino transferase，也稱“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，下文稱“GOGAT”)催化L-谷氨酸合成反應(yīng)，在該反應(yīng)中，由已經(jīng)由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α-酮戊二酸分子合成兩分子的L-谷氨酸。迄今為止，利用細(xì)菌菌株GDH途徑生產(chǎn)L-谷氨酸并通過提高其GDH活性來增強(qiáng)L-谷氨酸生產(chǎn)的方面已有報(bào)道，但是利用細(xì)菌菌株GS/GOGAT途徑生產(chǎn)L-谷氨酸并使其生產(chǎn)得以增強(qiáng)的方法尚不知曉。
本發(fā)明的說明本發(fā)明的一個(gè)目的是培養(yǎng)能高效生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌菌株并提出一種更有效、更廉價(jià)的L-谷氨酸生產(chǎn)方法，以滿足對(duì)L-谷氨酸的日益增長的需求。
本發(fā)明的發(fā)明者們已經(jīng)使用其GOGAT活性得到增強(qiáng)的細(xì)菌菌株對(duì)L-谷氨酸的生產(chǎn)方法進(jìn)行了研究，上述的GOGAT是參與GS/GOGAT途徑的其中一種酶，它催化L-谷氨酸的生成。結(jié)果發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)能夠生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌菌株的GOGAT活性被增強(qiáng)時(shí)，其生產(chǎn)L-谷氨酸的能力即得以提高，這樣即完成了此發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供了一種屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌菌株，這一菌株具有生產(chǎn)L-谷氨酸的能力，其細(xì)胞中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性被增強(qiáng)。這種谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力的增強(qiáng)可以通過增加編碼谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的拷貝數(shù)來完成。另外，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的增強(qiáng)也可以通過改變編碼該酶基因的表達(dá)調(diào)控序列來完成。谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶可以得自屬于埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌屬的微生物。
另外，本發(fā)明還提供了一個(gè)編碼氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因，它包含的核苷酸序列至少對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列的第565-6614位。
而且，本發(fā)明還提供了一種通過發(fā)酵來生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌菌株，該菌株具L-谷氨酸生產(chǎn)能力，其細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活力被增強(qiáng)；在培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積累L-谷氨酸；以及從該培養(yǎng)基中回收L-谷氨酸的步驟。
本發(fā)明將在下面作詳細(xì)說明。(1)屬于棒狀桿菌屬的具有生產(chǎn)L-谷氨酸能力的細(xì)菌此處所指的屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌是一組在Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology第8版第599頁(1974)中所定義的微生物。這些細(xì)菌是好氧、革蘭氏陽性、不具有形成芽孢的能力的不耐酸桿菌，同時(shí)包括一些曾經(jīng)被分類為短桿菌屬而現(xiàn)在被統(tǒng)一到棒狀桿菌屬的細(xì)菌(見Int.J.Syst.Bacteriol.，41，225(1981))，以及與棒狀桿菌屬緊密相關(guān)的短桿菌屬及微菌屬中的一些細(xì)菌。在上述的屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌中，列于下面的已知是L-谷氨酸生產(chǎn)細(xì)菌的，是本發(fā)明中最優(yōu)選的。
嗜乙酰棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)美棒桿菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)Corynebacterium lilium(Corynebacterium glutamicum)Corynebacterium melassecolaBrevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum)Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum)解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)Brevibacterium immariophilium玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum)生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)具體地說，這些細(xì)菌中的下列菌株被作為例子采用嗜乙酰棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806美棒桿菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13060Brevibacterium divaricatumATCC 14020Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869Corynebacterium liliumATCC 15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolvticum)ATCC 14066Brevibacterium immariophilium ATCC 14068玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum) ATCC 13825黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) ATCC 13826生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis) ATCC 19240這些菌株可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。每種細(xì)菌菌株都指定了一個(gè)保藏號(hào)。任何人都可以根據(jù)保藏號(hào)從ATCC中獲得相應(yīng)的細(xì)菌菌株。在ATCC的目錄中描述了保藏于ATCC中的細(xì)菌菌株的保藏號(hào)。
當(dāng)用上述的屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-谷氨酸時(shí)，采用下述的任一方法都是可行的。
1.使培養(yǎng)基中生物素的濃度不達(dá)到最理想值。參閱S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda及A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi，36，197-203(1962)。
2.如果培養(yǎng)基中含足量的生物素，則向其中加入表面活化劑。參閱I.Shiio，H.Otsuka及N.Atsuya，J.Biochem.，53，333-340(1963)；K.Takinami，H.Okada及T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.，27，853-863(1963)。
3.如果培養(yǎng)基中含足量的生物素，則向其中加入青霉素。參閱美國專利第3,080,297號(hào)；日本專利公開第37-1695號(hào)(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe及T.Osawa，Amino Acid and Nucleic Acid，17，61-65(1968)。
另外，還可以通過使用以上所述的屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌的突變體的方法來生產(chǎn)L-谷氨酸。值得提及的突變體有Brevibacterium lactofermentum AJ 12745(FERM-BP 2922)；見美國專利第5,272,067號(hào)。
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746(FERM-BP 2923)；見美國專利第5,272,067號(hào)。
黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)AJ 12747(FERM-BP2924)；見美國專利第5,272,067號(hào)。
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)AJ 12478(FERM-BP 2925)；見美國專利第5,272,067號(hào)。
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21492。
在本發(fā)明中上述的產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌是最優(yōu)選使用的。(2)GOGAT活性的增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞中GOGAT活性可以這樣來增強(qiáng)連接編碼GOGAT的基因片段與在棒狀桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體以構(gòu)建重組DNA，把這一重組DNA引入棒狀桿菌屬細(xì)菌的宿主菌株中對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)該細(xì)菌細(xì)胞中GOGAT的活性。GOGAT是由大小亞基組成的異寡聚物，其中大小亞基分別由gltB及gltD基因編碼。在轉(zhuǎn)化菌株細(xì)胞中編碼GOGAT的基因(下文稱“gltBD基因”)拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致了GOGAT活性的增強(qiáng)。
至于gltBD基因，屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌的基因以及來源于包括大腸桿菌的其它生物體的基因都可被使用。得自屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌的gltBD基因的核苷酸序列尚未知道，但大腸桿菌K-12(Gene，60，1-11(1987))以及酵母(Saccharomyces cerevisiae，GenBank訪問號(hào)碼X89221)的gltBD基因的核苷酸序列早已被闡明。因此，可以根據(jù)這些gltBD基因的核苷酸序列合成引物，并通過PCR方法用從例如大腸桿菌K12及Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869中制備的染色體DNA當(dāng)模板獲得這些微生物的gltBD基因。這些引物可以由SEQ IDNos3-6中所示的引物來舉例說明。在隨后所述的實(shí)施例中所分離的Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO7中。Brevibacterium lactofermentum的gltBD基因是一新穎的基因。
至于用于基因克隆的質(zhì)粒，任何可以在如大腸桿菌的微生物細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒都是可用的，而pBR322、pTWV228、pMW119以及pUC19則被具體地舉例說明。
此處所指的在棒狀桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮功能的載體是，例如，一種可以在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。下列的是載體的一些具體的例子。
pAM 330，見日本專利申請公開58-67699號(hào)(1983)pHM 1519，見日本專利申請公開58-77895號(hào)(1983)pAJ 655，見日本專利申請公開58-192900號(hào)(1983)pAJ 611，見日本專利申請公開58-192900號(hào)(1983)pAJ 1844，見日本專利申請公開58-192900號(hào)(1983)pCG 1，見日本專利申請公開57-134500號(hào)(1982)pCG 2，見日本專利申請公開58-35197(1983)pCG 4，見日本專利申請公開57-183799號(hào)(1982)pCG 11，見日本專利申請公開57-183799號(hào)(1983)為了通過連接編碼GOGAT的gltBD基因及在棒狀桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞中發(fā)揮功能的載體來制備重組DNA，用與gltBD基因末端相應(yīng)的限制性酶對(duì)載體進(jìn)行消化。連接通常是用連接酶，如T4 DNA連接酶來進(jìn)行的。
當(dāng)要把如上述所制備的重組DNA導(dǎo)入到棒狀桿菌屬細(xì)菌中時(shí)，可以采用任何已知的轉(zhuǎn)化方法。例如，可用的一種方法是用氯化鈣對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理以增加DNA的通透性，這一方法已被報(bào)導(dǎo)用于大腸桿菌K-12中(見Mandel，M.及Higa，A.，J.Mol.Bid.，53，159(1970))；可用的另一種方法是用處于生長期的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞隨后再把DNA導(dǎo)入其中，這一方法已被報(bào)導(dǎo)用于枯草桿菌中(見Duncan，C.H.，Wilson，GA.及Young，F(xiàn).E.，Gene，1，153(1977))。除此之外，可用的另一種方法是把DNA受體細(xì)胞制成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球形體，它們在重組DNA被導(dǎo)入細(xì)胞之后可以容易地吸收重組DNA，這種方法已知可被用于枯草桿菌、放線菌類及酵母中(見Chang，S.及Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.及Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.及Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。
在本發(fā)明的實(shí)施例中所用的轉(zhuǎn)化的方法是電脈沖法(參閱日本專利申請公開2-207291號(hào))。
GOGAT活性的增強(qiáng)也可以通過把多拷貝的gltBD基因?qū)氲缴鲜鏊拗骶甑娜旧wDNA中。為了把多拷貝的gltBD基因?qū)氲桨魻顥U菌屬細(xì)菌的染色體DNA中，用在染色體DNA中有多拷貝的序列作為目標(biāo)進(jìn)行同源重組?？杀皇褂玫脑谌旧wDNA上存在多拷貝的序列有重復(fù)性DNA、轉(zhuǎn)座元件末端的反向重復(fù)序列。而且，如日本專利申請公開2-109985號(hào)中所揭示的，可以把gltBD基因整合到轉(zhuǎn)座子中并讓轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移以把多拷貝的gltBD基因?qū)氲饺旧w中。通過任何一種方法都可以使經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株細(xì)胞中g(shù)ltBD基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果使GOGAT活性增強(qiáng)。
除了上述的基因擴(kuò)增法之外，GOGAT活性的增強(qiáng)還可以通過把gltBD基因的表達(dá)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子替換成更強(qiáng)的來實(shí)現(xiàn)。例如，已知的強(qiáng)有力的啟動(dòng)子有l(wèi)ac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、以及λ噬菌體的PR及PL啟動(dòng)子。通過把gltBD基因固有的啟動(dòng)子替代成這些啟動(dòng)子即可增強(qiáng)gltBD基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)GOGAT的活性。(3)使用本發(fā)明的細(xì)菌菌株生產(chǎn)L-谷氨酸。
通過使用一種具L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬細(xì)菌菌株(這一菌株細(xì)胞中的GOGAT活性已被增強(qiáng))即可以普通的方法來生產(chǎn)L-谷氨酸，上述方法使用含有碳源、氮源、無機(jī)鹽并根據(jù)需要含有其它次要有機(jī)營養(yǎng)物，如氨基酸及維生素的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基。任何可以被用于待培養(yǎng)的細(xì)菌菌株的碳源及氮源都可被用于培養(yǎng)基中。
一些糖類，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物以及糖蜜被用作碳源。而其它的有機(jī)酸如乙醇及檸檬酸也可被單獨(dú)用作碳源，或與其它的碳源結(jié)合使用。
可用作氮源的是氨、銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨以及乙醇銨或者硝酸鹽。
至于次要有機(jī)營養(yǎng)物，氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物以及大豆蛋白水解物這些含有上述營養(yǎng)成分的物質(zhì)都可被使用。如果使用的是需要氨基酸或其它物質(zhì)用于生長的營養(yǎng)突變型的突變體，則應(yīng)該補(bǔ)充必需的營養(yǎng)物質(zhì)。
可用作無機(jī)鹽的有磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等等。
至于培養(yǎng)方法，培養(yǎng)是在有氧條件下進(jìn)行的，發(fā)酵溫度被控制在20至45℃之間，而pH值剛被控制于5至9之間。如果pH值在培養(yǎng)的過程中降低了，則加入碳酸鈣或用堿性物質(zhì)如氨氣對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行中和。如此培養(yǎng)10小時(shí)至4天之后，在培養(yǎng)基中即可積累大量的L-谷氨酸。
至于在培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中回收L-谷氨酸的方法，任何已知的回收方法都可被使用。例如，可以在把細(xì)胞從培養(yǎng)基中除去之后用濃縮結(jié)晶法來收集產(chǎn)物?；蛘咭部梢杂秒x子交換層析或其它方法。
附圖的簡要說明
圖1中所示的是質(zhì)粒pBD35-43的構(gòu)建過程。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述以下參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的解釋。實(shí)施例1(1)大腸桿菌K-12gltBD基因的克隆大腸桿菌K-12的gltBD基因的核苷酸序列是已知的(Gene，60，1-11(1987))。以上述報(bào)導(dǎo)的核苷酸序列為基礎(chǔ)，合成了如序列表中SEQID NOs1及2中所示的引物并根據(jù)PCR方法用源于大腸桿菌K-12的JM 109菌株的染色體DNA(由Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn))為模板對(duì)gltBD基因進(jìn)行擴(kuò)增。
在所合成的引物中，SEQ ID NO1對(duì)應(yīng)于在Gene，60，6(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列圖中的第57至96位核苷酸，但是在引物中，第77及第78位核苷酸被從A替換為G，而且已在其中插入了限制性酶GamHI的識(shí)別位點(diǎn)。SEQ ID NO2對(duì)應(yīng)于在Gene，60，7(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列圖中的第6261至第6290位核苷酸，但是在引物中，第6380位核苷酸被從T替換為G，第6282位核苷酸被從A替換成T，第6284位核苷酸被從A替換成C，這樣就插入了限制性酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。而且SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列是在Gene，60，7(1987)中所描述的核苷酸序列圖中第6261至6290位核苷酸的互補(bǔ)鏈，是從5′端開始的。
大腸桿菌K-12染色體DNA的制備是根據(jù)通常的方法進(jìn)行的(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu Kougaku-kai編輯，97-98，Baifu-kan，(1992))。而且，PCR反應(yīng)也是用PCRTechnology(Henry Enrich編輯，Stockton Press，1989，第8頁)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行的。
把獲得的PCR產(chǎn)物用通常的方法進(jìn)行純化，然后用限制性酶BamHI對(duì)其進(jìn)行處理，接著用連接試劑盒把其與已經(jīng)BamHI消化的pMW219(由Nippon Gene Co.，Ltd.生產(chǎn))相連接，然后用大腸桿菌JM 109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后把細(xì)胞涂布在含有10μg/ml IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/mlX-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨，5g/l細(xì)菌用酵母提取物、15g/l NaCl，15g/l瓊脂，pH7.2)上并培養(yǎng)過夜，然后挑出所形成的白色菌落并把其分離為單一菌落以獲得轉(zhuǎn)化菌株。
用堿法從轉(zhuǎn)化菌株制備質(zhì)粒(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，NihonSeibutsu Kogaku-kai編輯，105，Baifu-kan，(1992))，然后給已被插入到載體中的DNA片段制作一張限制性位點(diǎn)圖譜，然后根據(jù)它與已報(bào)導(dǎo)的gltBD基因限制性位點(diǎn)圖譜的比較，把在其中已經(jīng)插入了一個(gè)其限制性位點(diǎn)圖譜與已報(bào)導(dǎo)的圖譜一致的DNA片段的質(zhì)粒命名為pMWGOGAT35。
另外，為了證實(shí)gltBD基因已被表達(dá)，用電穿孔法把pMWGOGAT35導(dǎo)入到缺乏gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大腸桿菌PA340菌株中。結(jié)果，導(dǎo)入了pMWGOGAT35的轉(zhuǎn)化菌株的L-谷氨酸需要消失了，這樣，gltBD基因的表達(dá)即得確證實(shí)。(2)構(gòu)建一個(gè)含有大腸桿菌K-12 gltBD基因及一棒狀桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒。
圖1中示出了構(gòu)建一個(gè)含有大腸桿菌K-12 gltBD基因以及棒狀桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒的過程。具體地說，用限制性酶BamHI及KpnI對(duì)質(zhì)粒pHK4(日本專利申請公開5-7491號(hào))進(jìn)行消化(這一質(zhì)粒帶有來源于可以在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒pHM 1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的復(fù)制起始位點(diǎn)(日本專利申請公開Hei 5-7491號(hào)))以獲得包括復(fù)制起始位點(diǎn)的基因片段，然后用DNA切齊試劑盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.，Blunting Kit)把所得片段的末端切齊，然后把這一片段導(dǎo)入到質(zhì)粒pMWGOGAT 35的XbaI位點(diǎn)上，此前在質(zhì)粒pMWGOGAT中已經(jīng)用XbaI連接序列(由TakaraCo.，Ltd.生產(chǎn))插入了被克隆的大腸桿菌K-12菌株的gltBD基因。把這一質(zhì)粒命名為pBD 35-43。(3)把pBD 35-43導(dǎo)入棒狀桿菌屬AJ 12036及AJ 13029的野生型細(xì)菌株菌中并通過培養(yǎng)來估計(jì)所獲得的轉(zhuǎn)化子用電脈沖法(參照日本專利公開公告2-207791號(hào))用質(zhì)粒pBD35-43對(duì)棒狀桿菌屬AJ 12036(Agric.Giod.Chem.，51，93-100(1987))及AJ 13029的野生型細(xì)菌株菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化菌株。培養(yǎng)通過在野生型菌株AJ 12036中導(dǎo)入質(zhì)粒pBD 35-43而獲得的轉(zhuǎn)化菌株AJ 12036/pBD 35-43以便在下述的生物素限制條件下生產(chǎn)L-谷氨酸。把培養(yǎng)在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培養(yǎng)基平板上的AJ12036/pBD35-43菌株的細(xì)胞接種在培養(yǎng)基(80g葡萄糖、1g KH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O、30g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.01gMnSO4·7H2O、15ml大豆水解物、200μg鹽酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素、50g CaCO3加入1升純水中，用KOH調(diào)到pH8.0)中，細(xì)胞在31.5℃下振蕩培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。把所獲得的培養(yǎng)物接種在不加生物素和卡拉霉素的上述培養(yǎng)基(下文稱“生物素限制培養(yǎng)基”)中，培養(yǎng)數(shù)量為5％，31.5℃振蕩培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用如上所述的同樣的方法培養(yǎng)AJ 12036菌株。培養(yǎng)完成之后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的Biotech Analyzer AS-210測量培養(yǎng)基中所積累的L-谷氨酸的數(shù)量。所得結(jié)果示于表1中。
表1
另外，通過把質(zhì)粒pBD 35-43導(dǎo)入AJ 13029菌株獲得轉(zhuǎn)化菌株AJ13029/pBD 35-43并如下進(jìn)行培養(yǎng)以生產(chǎn)L-谷氨酸。把培養(yǎng)在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培養(yǎng)基平板上的AJ 13029/pBD35-43菌株的細(xì)胞接種到培養(yǎng)基(30g葡萄糖、1g KH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O、30g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·7H2O、15ml大豆水解物、200μg鹽酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素以及50g CaCO3加入到1升純水中，用KOH調(diào)到pH8.0)，在31.5℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。以5％的量將獲得的培養(yǎng)物接種進(jìn)相同組成的培養(yǎng)基中，然后在37.0℃振動(dòng)培養(yǎng)直至培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。作為對(duì)照，用如上所述的同樣方法培養(yǎng)AJ 12029菌株。培養(yǎng)完成后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn)的Biotech AnalyzerAS-210測量培養(yǎng)基中所積累的L-谷氨酸的數(shù)量。所得結(jié)果示于表2中。AJ 12029菌株是在WO 96/06180中所描述的一種菌株，它對(duì)生物素活性抑制物質(zhì)具溫度敏感性。這一菌株被根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于National Institute of Bioscience and Human Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry(郵編305-8566，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)中。這一菌株的保藏號(hào)為FERM BP-5189。
表
><p>SEQ ID NOs3及4中所示的寡核苷酸是根據(jù)由在大腸桿菌和酵母中高度同源的gltB基因產(chǎn)物的選定區(qū)域的氨基酸序列推斷而得的核苷酸序列合成的。用Bacterial Genomic DNA純化試劑盒(由Advancedgenetic Technologies Corp.生產(chǎn))制備Brevibacterium lactofermentumATCC 13869的染色體DNA。以上述的寡核苷酸為引物、以染色體DNA為模板，用“PCR Technology”(Henry Enrich編輯，Stockton Press，1989，第8頁)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出了一個(gè)長度大概為1.4Kbp的DNA片段。用SEQ ID NOs3及4中的寡核苷酸對(duì)所得DNA的兩端進(jìn)行測序。測序是用DNA測序試劑盒(由Applied Biosystems Co.，Ltd.生產(chǎn))根據(jù)Sanger的方法(J.Mol.Boil.，143，161(1980))進(jìn)行的。把所確定的核苷酸序列翻譯為氨基酸并把這一氨基酸序列與由大腸桿菌及酵母的gltB基因推斷的氨基酸序列進(jìn)行比較。結(jié)果，因?yàn)榇嬖诟叨鹊耐葱裕钥梢韵陆Y(jié)論由PCR擴(kuò)增的DNA片段是Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869的gltB基因的一部分。然后，用通常的方法用ECoRI、BamHI、HindIII、PstI以及SalI(由Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn))對(duì)通過上述方法所制備的Brevibacterium lactofermentumATCC 13869染色體DNA進(jìn)行消化并用經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段作為探針以及DIG DNA標(biāo)記及檢測試劑盒(由Boeringer Mannhein生產(chǎn))進(jìn)行Southern雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有由HindIII酶切而得的大約14kb的片段與DNA探針發(fā)生雜交。這樣，用瓊脂糖凝膠對(duì)用通常方法制備的Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色體DNA的HindIII片段進(jìn)行電泳，并用玻璃粉回收了大約10kb大小或更大的DNA片段。用連接試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))把經(jīng)回收的DNA片段連接到已經(jīng)限制性酶HindIII(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))酶切的載體pMW219(由Nippon Gene Corporation生產(chǎn))上。用連接混合物對(duì)大腸桿菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。把轉(zhuǎn)化菌株涂布在含有10μg/ml IPIG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培養(yǎng)基(10g/l細(xì)菌用胰蛋白胨，5g/l細(xì)菌用酵母提取物，15g/l NaCl，15g/L瓊脂糖，pH7.2)，培養(yǎng)過夜。把由此獲得的白色菌落挑起來并把其分離為單菌落，獲得大約1000個(gè)轉(zhuǎn)化菌株。使用所獲得的轉(zhuǎn)化菌株，用堿性法(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu-kogaku Gakkai，105，Baifu-kan，(1997))制備質(zhì)粒。用如上所述的條件，用含有如SEQ ID NOs5及6中所示的核苷酸序列且是根據(jù)DNA序列中被用作探針的被測序的那一部分進(jìn)行合成的合成寡核苷酸當(dāng)引物，并且用上述的質(zhì)粒當(dāng)模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后挑選出那些能夠擴(kuò)增出長度大概為1.3kbp的片段的轉(zhuǎn)化菌株，這一擴(kuò)增片段與用上述引物并用Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的染色體當(dāng)模板進(jìn)行PCR反應(yīng)所擴(kuò)增出來的DNA片段大小是相同的。(2)Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因核苷酸序列的測定從在(1)中通過堿法獲得的轉(zhuǎn)化菌株制備的質(zhì)粒DNA含有來源于Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色體的大約為14kbp的DNA片段。用與如上所述同樣的方法測定了來源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色體的長度大約為14kbp的DNA片段中所含的gltBD基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO7中所示的如上所測定的這些核苷酸序列中含有g(shù)ltBD基因的AatII片段。從核苷酸序列分析可以假定存在有兩個(gè)開放閱讀框。SEQ ID NO7中還示出了從核苷酸序列推定的翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列。也就是說，編碼兩個(gè)含有SEQ ID NO7中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因是Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因。在這一序列中，第565至5094號(hào)核苷酸對(duì)應(yīng)于gltBD基因，第5097至6614則對(duì)應(yīng)于gltD基因。SEQ ID NOs8及9分別示出了由gltB基因及gltD基因所編碼的氨基酸序列。順便提一下，由于位于蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基是源于起始密碼ATG的，所以這一殘基通常與蛋白質(zhì)自身的功能并不存在聯(lián)系，而且公知的是它在翻譯后將由肽酶除去。相應(yīng)地，在上述蛋白質(zhì)的情形中，甲硫氨酸殘基也可能被除去了。
把核苷酸序列及氨基酸序列與已知的序列進(jìn)行同源性比較。所用的數(shù)據(jù)庫是EMBL及SWISS-PROT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO7中所示的DNA是棒狀桿菌屬細(xì)菌中一個(gè)新的基因，它與已被報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌、酵母等等的gltBD基因具同源性。(3)制備含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因以及棒狀桿菌屬細(xì)菌的復(fù)制啟始位點(diǎn)的質(zhì)粒為了研究Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的擴(kuò)增效力，構(gòu)建了一個(gè)含有Brevibacterium lactofermentum ATCC13869的gltBD基因以及棒狀桿菌屬細(xì)菌的復(fù)制啟始位點(diǎn)的質(zhì)粒。具體地說，用限制性酶AatII剪切質(zhì)粒DNA，這一DNA含有源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色體的大約為14kbp的DNA片段，這一片段是從在(1)中獲得的轉(zhuǎn)化菌株用堿法制備的。剪切后獲得含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的DNA片段，把所得的這一片段的末端用DNA切平試劑盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn)，Blunting Kit)切平，然后把其插入到質(zhì)粒pVC 7中限制性酶SmaI的位點(diǎn)中，其中質(zhì)粒pVC 7含有源于質(zhì)粒pAM 330的復(fù)制起始位點(diǎn)，而質(zhì)粒pAM 330可以在棒狀桿菌屬細(xì)菌中自主復(fù)制(日本專利申請公開Sho 58-67699號(hào))。這一質(zhì)粒被命名為pVCGOGAT。把pHSG 399(一種大腸桿菌載體，Cmr；Takeshita，S.等人，Gene，61，63-74(1987)與pAM 330(一種Brevibacterium lactofermentum的隱藏質(zhì)粒)連接在一起以構(gòu)建質(zhì)粒pVC 7。pAM 330是用Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869菌株制備的。用僅產(chǎn)生一個(gè)剪切位點(diǎn)的限制性酶AvaII(Takara Shuzo生產(chǎn))對(duì)pHSG 399進(jìn)行酶解，然后用T4DNA聚合酶把末端切平，再把其與已經(jīng)過HindIII(Takara Shuzo生產(chǎn))酶解并用T4 DNA聚合酶切平末端的pAM 330相連接。PVC 7在大腸桿菌及Brevibacterium lactofermentum中都可以自主復(fù)制并含有源于pHSG 339及l(fā)acZ′的多克隆位點(diǎn)。
進(jìn)而，為了證實(shí)gltBD基因已被表達(dá)，用電穿孔法把pVCGOGAT導(dǎo)入到缺少gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大腸桿菌PA 340菌株(E.Coli Genetic Stock Center(Yale University，U.S.A.))中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有pVCGOGAT的轉(zhuǎn)化菌株不再對(duì)L-谷氨酸有需求，從而由此證實(shí)gltBD基因已被表達(dá)。(4)把pVCGOGAT導(dǎo)入到棒狀桿菌屬AJ 12036細(xì)菌野生型菌株中并對(duì)其估計(jì)其培養(yǎng)的情況通過電脈沖法(日本專利出版公開Hei 2-207791號(hào))用質(zhì)粒pVCGOGAT對(duì)棒狀桿菌屬AJ 12036細(xì)菌(Agric.Biol.Chem.，51，93-100(1987))的野生型菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化以獲得轉(zhuǎn)化菌株。把通過把質(zhì)粒pVCGOGAT導(dǎo)入到AJ 12036野生型菌株而獲得的轉(zhuǎn)化菌株AJ12036/pVCGOGAT在如下的生物素限制條件中進(jìn)行培養(yǎng)以生產(chǎn)L-谷氨酸。把通過培養(yǎng)于含有5mg/ml氯霉素的CM2B培養(yǎng)基平板而獲得的AJ12036/pVCGOGAT菌株的細(xì)胞接種在培養(yǎng)基(80g葡萄糖、1gKH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·7H2O、15ml大豆水解液、200μg鹽酸硫胺素、60μg生物素、10mg氯霉素、50g CaCO3，加入到1升的純水中，用KOH調(diào)到pH 8.0)中并在31.5℃振蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。
把所得的培養(yǎng)物以5％的數(shù)量接種到不含有生物素及氯霉素的上述培養(yǎng)基(下文稱“生物素限制培養(yǎng)基”)中并在31.5℃振蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基中的糖耗盡為止。作為對(duì)照，用如上所述的同樣方法培養(yǎng)通過把pVC7用如上所述方法導(dǎo)入到AJ 12036菌株中而制備的細(xì)菌菌株。培養(yǎng)之后，用Biotech Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生產(chǎn))測量培養(yǎng)基中所積累的L-谷氨酸的數(shù)量。結(jié)果示于表3中。
表3
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的方法，屬于棒狀桿菌屬的能夠生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌菌株，當(dāng)其GOGAT活性被增強(qiáng)時(shí)，其L-谷氨酸的生產(chǎn)能力即可被提高，從而使L-谷氨酸的生產(chǎn)變得更加廉價(jià)和有效。而且，獲得源于棒狀桿菌屬細(xì)菌的gltBD基因并把其有效地用于棒狀桿菌屬細(xì)菌的谷氨酸生產(chǎn)。
序列表<110>AJINOMOTO CO.，INC.<120>通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法<130>OP 778<140>PCT/JP98/03535<141>1998-08-07<150>JP 9-216906<151>1997-08-12<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增大腸桿菌gltBD基因的引物<400>1agccttaaag ataggatcca ttttaatttc<210>2<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增大腸桿菌gltBD基因的引物<400>2attcatggat ccctcgctta aacttccagc<210>3<211>17<212>DNA<213>人造序列<220><221>未確定<222>(3，9，12)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>3ggngarggng gngarga<210>4<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><221>未確定<222>(1，4，7)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>4nccnccngtc atrtaytc<210>5<211>32<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>5aatccacgtg aagctagtgg cagaacaagg cg<210>6<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于擴(kuò)增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>6acgaatgaac aattcaccac tggttgcgcc<210>7<211>8734<212>DNA<213>Brevibacterium lactofermentum<220><221>CDS<222>(565)..(5094)<220><221>CDS<222>(5097)..(6614)<400>7gacgtcgcgg aggaatgctg ccacgccttc gatttttccg gaatcgtctt tcaggatcgt 60gatggagaat tccagggaca ttttagatcc gtctgcacgc actcccggaa cattgagggg 120ctcggagccg tagcgggttt caccggattc catgacgtga tcccatccgt cccagtgtgc 180cttgcggtgt ttttcgggga tgatgatgtc gagggatttt ccgagtgctt cgccggccgt 240gtatccaaag agtttctcgg agccgccgtt ccagagtctg attattccat cgcgggtggc 300gtagatgatt gcttcttctg tttcggtgac aagtcgggct gcgatggtgt caaaatcgac 360catttttatc ttctttcacg gggtggatag gcgaacatct tctaccatat cctgtgatgt 420gtaacacagg agcgtaatct gacctcccgt tttcctatag attgatcgaa agtaaccctt 480ttgttacttg cgttgcaggt agtgcgcctg attttcttat tatcgaacga ttgatagaaa 540caggattaaa gtgaggtatc ccgc atg aaa cca caa gga ctc tac aac cct591Met Lys Pro Gln Gly Leu Tyr Asn Pro1 5gcg cat gaa cat gac gcc tgc ggt gtg gcg ttt att gcg gat atc cac 639Ala His Glu His Asp Ala Cys Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His10 15 20 25ggt cga ccc agc cgc agc att gtt gat cgt gca ctt gag gcg ctt cgc 687Gly Arg Pro Ser Arg Ser Ile Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg30 35 40aac att gac cac cgt ggc gca gcc ggt gca gag aag aac act ggc gat 735Asn Ile Asp His Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp
45 50 55ggt gcg ggc atc ctc atg cag att ccg gac ggc ttt tat cgt gaa gta 783Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val60 65 70tct ggc att gag ctt cct gag gca ggg gag tat gcc act ggt att gcg 831Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala75 80 85ttc ttg cct cgc ggt cgc atg gcg atg atg gat gct cag aag gaa att 879Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile90 95 100 105gag cgc atc gca aag caa gaa ggt gcc gat gtg ctt ggt tgg cgc atg 927Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met110 115 120gtt cct ttt gat tcc cgt gag ctg ggt tcc atg gct gag gag gcg atg 975Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met125 130 135cct agt ttc gcg cag att ttc ctt act gtg cct gga aaa tct ggt gaa 1023Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu140 145 150gat ctt gac cgt gtg atg ttc ttt atc cgt aag cgt tgt gag cgt gag 1071Asp Leu Asp Arg Val Met Phe Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu155 160 165ctg ggc acc acc aat ggt cgc gat acg gtg tat ttc ccg tcg cta tct 1119Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser170 175 180 185tca cgc acc atc att tac aaa ggc atg ttg acc act ctg cag ctt gag 1167Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu190 195 200ggc ttc ttt gag gat ctg ggt gat gct cgc ctg gag tcg gcc att gct 1215Gly Phe Phe Glu Asp Leu Gly Asp Ala Arg Leu Glu Ser Ala Ile Ala205 210 215att gtg cac tcg cgt ttc tcc acg aac act ttc cca agc tgg ccg ctg 1263Ile Val His Ser Arg Phe Ser Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu220 225 230gcg cac ccg tac cgt ttc gtt gcc cac aac ggt gag atc aac act gtg 1311Ala His Pro Tyr Arg Phe Val Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val235 240 245cgt ggc aat gaa aac tgg atg cgc gcc cgc gag gcg ctt atc aaa aac 1359Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn250 255 260 265gac aag ctg ggc aat ttg agc agc gtg ctg cct atc tgc acc ccg gag 1407Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu270 275 280ggc tcg gat acc gcg cgt ttc gac gag gct ttg gag ctt ttg cac ctg 1455Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu
285 290 295ggc gga tac tca ctt ccg cat gct gtt gcg atg atg atc cct cag gcg 1503Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala300 305 310tgg gaa cac aac aag acg ctg agc cct gag ctg cgt gat ttc tac gaa 1551Trp Glu His Asn Lys Thr Leu Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu315 320 325tac cac tct tgt ctg atg gag cca tgg gat ggt cct gca gcg ctg gca 1599Tyr His Ser Cys Leu Met Glu Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala330 335 340 345ttt act gac ggt cgt ttt gtg ggt gcc gtg ctg gac cgt aat ggc ctg 1647Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu350 355 360cga cct ggg cga atc acc att act gat tcg ggt ttg gtt gtg atg gct 1695Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala365 370 375tct gaa tcg gga gtg ttg gac ttg agg gag gag agc gtc gta aag cgt 1743Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg380 385 390act cgc gta cag cct gga cgc atg ttc ctt gtt gac acg gcc gag ggt 1791Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly395 400 405cgc atc gtt gaa gac gag gaa atc aag cag aaa tta agc gaa gcg cag 1839Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln410 415 420 425cca tat ggt gag tgg att cgc gat aat ttt gtg cat ctg gat cgt ctg 1887Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu430 435 440cct cag aca cgc tac aac tac atg gcg cac tct cgt gct gtg ttg cgt 1935Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg445 450 455cag cgt gtt ttc gga atc act gaa gaa gat gtg gat ttg ttg ctg ctg 1983Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu460 465 470ccg atg gcc cgc cag ggt gct gag gcg att ggt tcc atg ggt tcg gat 2031Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp475 480 485acg cca att gcg gcg cta tcc cag cga cca cgc atg ctt tat gat ttc 2079Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe490 495 500 505ttc gcg cag cgc ttt gct cag gtg aca aac cca ccg ttg gac tct atc 2127Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile510 515 520cgc gaa aag cct gtg acc agc atg ttc act ttg ttg ggt gcg cag tct 2175Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser
525 530 535gac gtg ctc aat ccg ggt cct gat gcg gcg cga cgt atc cgt ttg gaa2223Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu540 545 550tcg ccg atc att gat aac cat gag ctg gcc acc ttg atc aat gcc aac2271Ser Pro Ile Ile Asp Asn His Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn555 560 565gcg cat ggt gag tgg gat tcc ttt ggt gct gct gta att tct ggt ttg2319Ala His Gly Glu Trp Asp Ser Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu570 575 580 585tac cca gtg gct cac cat ggt gcc ggc atg aag gct gcg att gct cgt2367Tyr Pro Val Ala His His Gly Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg590 595 600gtg cgc cgc gag gtt tct gaa gca atc cgc aat ggc aag acg ttg atc2415Val Arg Arg Glu Val Ser Glu Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile605 610 615gtg ctg tcg gat cgt gaa tct gat gag cgc atg gca cct atc cct gcg2463Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala620 625 630ctg ctg ctg act tcc gct gtg cat cag tac ttg gtg cag caa cgt acc2511Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr635 640 645cgt acc cag tgc tcc ctg gtg gtg gaa tcc ggc gat gcc cgc gag gtt2559Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val650 655 660 665cat cac ctg gcg atg ctc att ggt ttt ggt gcc gat gcg atc aac ccg2607His His Leu Ala Met Leu Ile Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro670 675 680tac atg gca ttt gaa acc arc gat gag ctg cgc atg aag ggt cag ttg2655Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu685 690 695ggt gat ctt tct ttg gat gag gca tcc cga aac tac atc aag gca gcc2703Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu Ala Ser Arg Asn Tyr Ile Lys Ala Ala700 705 710acc act ggt gtg ctg aag gtg atg tcc aag atg ggc att gca acg gtg2751Thr Thr Gly Val Leu Lys Val Met Ser Lys Met Gly Ile Ala Thr Val715 720 725tct tcg tac cgt ggc gcg cag ctt gct gat gtc acc ggt ctg cat cag2799Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Gln Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln730 735 740 745gat ctc ctg gac aac tac ttc ggt ggc att gct tca cca att tct ggt2847Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly750 755 760atc ggt ctg gat gag gtt gca gct gat gtg gaa gct cgt cac cgc agc2895Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser
765 770 775gca ttt ttg cca cgc cca gaa gag cac gct cac cgc gaa ttg gat ttg 2943Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu780 785 790ggt ggt gaa tac aag tgg cgc cgc gaa ggt gaa tat cac ctg ttc aac 2991Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn795 800 805cca gaa acc atc ttc aag ctg cag cat gca act cgt tct ggc agc tac 3039Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr810 815 820 825gag att ttc aag gat tac acc cgc aag gtt gat gat caa tcc act cgc 3087Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg830 835 840ttg ggt act att cgt gga ctg ttt gag ttc agc acg gat cgc aag cca 3135Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro845 850 855att tcg gtg tct gag gtg gag ccg gtc agt gag atc gtg aag cgt ttc 3183Ile Ser Val Ser Glu Val Glu Pro Val Ser Glu Ile Val Lys Arg Phe860 865 870tcc act ggt gcg atg tct tat ggc tcg att tct gct gaa gcc cat gag 3231Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu875 880 885gtc ttg gcc atc gcc atg aac cga ctg ggc ggt atg tcc aac tcc ggc 3279Val Leu Ala Ile Ala Met Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly890 895 900 905gaa ggt ggc gag gac gcc cgc cga ttc gat gtg gaa ccc aac ggt gac 3327Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg Arg Phe Asp Val Glu Pro Asn Gly Asp910 915 920tgg aag cgc tct gcc att aag cag gtg gcc tcg gga cgt ttc ggc gtg 3375Trp Lys Arg Ser Ala Ile Lys Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val925 930 935acc agc cac tac ttg aac aac tgc acc gat att cag atc aag atg gca 3423Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala940 945 950cag ggc gca aag ccc ggt gaa ggt ggc cag ctg cca cca aac aag gtg 3471Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val955 960 965tac cca tgg gtt gca gaa gtc cgc arc acc acc cca ggc gtt ggt ctg 3519Tyr Pro Trp Val Ala Glu Val Arg Ile Thr Thr Pro Gly Val Gly Leu970 975 980 985att tcc cct cca cca cac cac gat att tac tcc att gag gat ctg gct 3567Ile Ser Pro Pro Pro His His Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala990 995 1000cag ctg atc cac gac ctg aag aac gct aac cca cgc gca cga atc cac 3615Gln Leu Ile His Asp Leu Lys Asn Ala Asn Pro Arg Ala Arg Ile His
100510101015gtg aag cta gtg gca gaa caa ggc gtg ggc acc gtt gcc gca ggt gtg 3663Val Lys Leu Val Ala Glu Gln Gly Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Val102010251030tcc aaa gca cac gct gat gtg gtg ctt att tcc ggc cac gac ggc gga 3711Ser Lys Ala His Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly103510401045act ggc gca tct cct ttg acc tcc ctg aag cat gcc ggt ggt cca tgg 3759Thr Gly Ala Ser Pro Leu Thr Ser Leu Lys His Ala Gly Gly Pro Trp1050105510601065gag ttg ggc ttg gct gaa acc cag caa acg ttg ctg ctc aac ggc ctg 3807Glu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Gln Gln Thr Leu Leu Leu Asn Gly Leu107010751080cgt gat cgt att cgc gtg cag tgc gat ggt cag ctg aaa act ggc cga 3855Arg Asp Arg Ile Arg Val Gln Cys Asp Gly Gln Leu Lys Thr Gly Arg108510901095gac gta gtt atc gca gct ctg ctc ggt gcc gaa gaa ttc ggt ttc gcc 3903Asp Val Val Ile Ala Ala Leu Leu Gly Ala Glu Glu Phe Gly Phe Ala110011051110acc gca ccg ctg gtg gtt gaa ggc tgc atc atg atg cgc gtc tgc cac 3951Thr Ala Pro Leu Val Val Glu Gly Cys Ile Met Met Arg Val Cys His111511201125ctg gac acc tgc ccg gtg ggt atc gct acc cag aac ccg gat ttg cgt 3999Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly Ile Ala Thr Gln Asn Pro Asp Leu Arg1130113511401145tcc aag ttc acc ggc aag gct gaa cac gtg gtc aac ttc ttc acc ttc 4047Ser Lys Phe Thr Gly Lys Ala Glu His Val Val Asn Phe Phe Thr Phe115011551160atc gcc cag gaa gtc cgt gag tac ttg gca cag ctt ggt ttc cgc tct 4095Ile Ala Gln Glu Val Arg Glu Tyr Leu Ala Gln Leu Gly Phe Arg Ser116511701175att gat gaa gcc gta gga caa gcc cag gtg ctg cgt aag cgt tcc gga 4143Ile Asp Glu Ala Val Gly Gln Ala Gln Val Leu Arg Lys Arg Ser Gly118011851190atc cca gct gat tcc cgc gca gca cac ctg gat ttg agc cca att ttc 4191Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe119512001205cat cgc cca gaa act cca cac ttc cca act cag gat gtg cgt tgc acc 4239His Arg Pro Glu Thr Pro His Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr1210121512201225aag acc cag gaa cac agc cta gaa aaa gcc ctg gac aac gca ttt att 4287Lys Thr Gln Glu His Ser Leu Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile123012351240gat aag gct tcg gac aca atc acc cgt gcc gca gcg ggt gtg gaa acc 4335Asp Lys Ala Ser Asp Thr Ile Thr Arg Ala Ala Ala Gly Val Glu Thr
124512501255agc att gtt att gat agc tcc atc agc aac gtc aac cgt tca gtt ggc 4383Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly126012651270acg atg ctg ggt tct gca gtc agc cgc gtg gct ggt gcc caa ggt ttg 4431Thr Met Leu Gly Ser Ala Val Ser Arg Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu127512801285cca gac ggc acc atc acc ttg aat ctt caa ggc tgc gcc ggt aac tcc 4479Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser1290129513001305ttt ggc gcg ttc atc cca cga ggc atc acc atc aac ctc acc ggc gat 4527Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg Gly Ile Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp131013151320gcc aat gac ttt gtg ggc aag gga tta tct ggc gga aag att gtg atc 4575Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile132513301335aag cct tcc gct cag gct ccg aag cag ctg aag aac aat cca aat atc 4623Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile134013451350att gcc gga aac gtg ctt gga tac ggc gca acc agt ggt gaa ttg ttc 4671Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe135513601365att cgt ggc cag gtc ggc gaa cgt ttc tgc gtc cgt aac tct ggc gcc 4719Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala1370137513801385acc gca gtg gtt gaa ggt atc gga aac cac ggt tgt gag tac atg act 4767Thr Ala Val Val Glu Gly Ile Gly Asn His Gly Cys Glu Tyr Met Thr139013951400ggc ggc cga gtc ctg gtt ttg ggc ccg gtt ggt gag aac ttt ggt gcc 4815Gly Gly Arg Val Leu Val Leu Gly Pro Val Gly Glu Asn Phe Gly Ala140514101415ggc atg tct ggt ggc att gca tac ctg gct aat tcc ccg gac cta aac 4863Gly Met Ser Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ser Pro Asp Leu Asn142014251430cag aag atc aat ggc gaa ttg gtg gat gtt gtt cca ctg agc gct gac 4911Gln Lys Ile Asn Gly Glu Leu Val Asp Val Val Pro Leu Ser Ala Asp143514401445gat ctg acg tgg gct gat gag ctc att gct cgc cac cgc gaa ctc acc 4959Asp Leu Thr Trp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Arg His Arg Glu Leu Thr1450145514601465gga tcc gag acc aag ctg cgt gca caa gat ttg gtg aaa atc atg ccg 5007Gly Ser Glu Thr Lys Leu Arg Ala Gln Asp Leu Val Lys Ile Met Pro147014751480cgc gat ttc caa aaa gta ctc aac atc atc gaa acg gcc cac gct gag 5055Arg Asp Phe Gln Lys Val Leu Asn Ile Ile Glu Thr Ala His Ala Glu
148514901495ggc caa gac cca gca atc aag atc atg gag gca gtg agc ta atg gcc5102Gly Gln Asp Pro Ala Ile Lys Ile Met Glu Ala Val SerMet Ala150015051510 1gac cca caa gga ttc atc aaa tac tcc cga cgc gag cct gca cac cgc 5150Asp Pro Gln Gly Phe Ile Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Pro Ala His Arg5 10 15ccg gtc ccg ctg cgc ctc atg gac tac tcc gag gtc tac gaa aag gca 5198Pro Val Pro Leu Arg Leu Met Asp Tyr Ser Glu Val Tyr Glu Lys Ala20 25 30ccg gca ggt cag atc gag gaa cag gct gcc cgc tgc atg gat tgc ggt 5246Pro Ala Gly Gln Ile Glu Glu Gln Ala Ala Arg Cys Met Asp Cys Gly35 40 45 50gtc ccg ttc tgc cac gaa ggc tgc cca ctg ggc aac atc atc cct gag 5294Val Pro Phe Cys His Glu Gly Cys Pro Leu Gly Asn Ile Ile Pro Glu55 60 65tgg aat gat ctg gta cgc caa ggt cgg tgg aag gaa gcc tac gat cgc 5342Trp Asn Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Trp Lys Glu Ala Tyr Asp Arg70 75 80ctg cac gcg acc aac aat ttc ccc gag ttc acc ggc cgt ttg tgc ccc 5390Leu His Ala Thr Asn Asn Phe Pro Glu Phe Thr Gly Arg Leu Cys Pro85 90 95gca ccc tgc gaa ggc gcc tgc gtg ctc ggc atc aac gat gat tct gtc 5438Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys Val Leu Gly Ile Asn Asp Asp Ser Val100 105 110acc atc aaa aac gtt gag ctg gaa atc gtc gaa aaa gca ttc cgc gaa 5486Thr Ile Lys Asn Val Glu Leu Glu Ile Val Glu Lys Ala Phe Arg Glu115 120 125 130ggc tgg gtt cag cct gtc gtc gca tcc atg tcc acc ggc ctg tcc gta 5534Gly Trp Val Gln Pro Val Val Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu Ser Val135 140 145gcc gtc gtc ggc tcc ggt ccc gct ggc ctt gcc gcc gcg cag cag ctc 5582Ala Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln Leu150 155 160acc cgc gca ggt cac agc gtg acc gtc ttc gaa cgc gac gac cgc ctc 5630Thr Arg Ala Gly His Ser Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp Arg Leu165 170 175ggc ggc ctc atg cgc tac ggc gtg cca gaa tac aaa atg gaa aac cgc 5678Gly Gly Leu Met Arg Tyr Gly Val Pro Glu Tyr Lys Met Glu Asn Arg180 185 190tgg atc gac cgc cgc atc gag caa atg gaa gca gag ggc aca act ttc 5726Trp Ile Asp Arg Arg Ile Glu Gln Met Glu Ala Glu Gly Thr Thr Phe195 200 205 210cag gta ggc acc tcg cca cgc gcc gct gaa cta gcg ctt ttc gac gcg 5774Gln Val Gly Thr Ser Pro Arg Ala Ala Glu Leu Ala Leu Phe Asp Ala
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權(quán)利要求
1.一種具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬細(xì)菌菌株，其中在所述的細(xì)菌菌株的細(xì)胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性被增強(qiáng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的增強(qiáng)是通過擴(kuò)增編碼谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因的拷貝數(shù)來實(shí)現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的增強(qiáng)是通過改變編碼谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因的表達(dá)調(diào)控序列來實(shí)現(xiàn)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其中所述的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶來源于埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌屬細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3的菌株，其中所述編碼谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因包含有至少對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。
6.一種編碼谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因，包含有至少對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。
7.一種通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括如下步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬細(xì)菌菌株，其中，在所述細(xì)菌菌株的細(xì)胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性被增強(qiáng)，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積累L-谷氨酸，以及從培養(yǎng)基中回收L-谷氨酸。
全文摘要
通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有L－谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌屬細(xì)菌菌株,其中在這一細(xì)菌菌株的細(xì)胞中,谷氨酰胺—酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性被增強(qiáng);在該培養(yǎng)基中生產(chǎn)并積累L－谷氨酸;并從該培養(yǎng)基中回收L－谷氨酸這些步驟來生產(chǎn)L－谷氨酸。
文檔編號(hào)C12N9/06GK1275165SQ98810083
公開日2000年11月29日 申請日期1998年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月12日
發(fā)明者菅野壯平, 木村英一郎, 松井和彥, 中松亙, 大住剛 申請人:味之素株式會(huì)社