專利名稱：利用誘導型肌醇六磷酸基因控制發(fā)芽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了含有一種誘導型基因(肌醇六磷酸基因)的植物，該基因通過調節(jié)肌醇六磷酸的含量控制種子的萌發(fā)性；本發(fā)明還提供了生產和使用該植物、該植物的種子及其后代的方法。
背景技術：
玉米的低肌醇六磷酸突變體是已知的。近來重組DNA技術的成熟在農藝工業(yè)中轉化為經濟上的成功?？钩輨┖涂估ハx的棉花、大豆和玉米已成功上市了。在農作物的轉化之前一些作物由于突變已具有抗除草劑的特性。例如Garst Seed Company生產的ITTM玉米是抗除草劑(Imazethapyr)的HERBICIDE PURSUIT(American Cyanamid)突變植物。
突變植物還被用于在多種作物中產生有價值的特性。例如在玉米中利用蠟質化、直鏈淀粉伸長以及其它突變得到特定的淀粉特性，并且在甜玉米中利用了甜味突變。
低肌醇六磷酸突變，lpa1-R，已由Raboy(U.S.Patent No.1,689,054(其中描述了lpa1-1))得到。此lpa1突變的商業(yè)應用預期將在1999年出現(xiàn)。許多公司目前正在研究這種新的低肌醇六磷酸突變體。通過玉米育種的突變方法以及突變劑的應用在玉米中得到了多種不同突變以及具有這種低肌醇六磷酸特性的不同品種。
轉座子標記是已知的基因鑒定和測序方法，該方法包括用可轉座元件突變植物。這種方法的一個優(yōu)點是它提供了與突變相關基因的鑒定和測序的一種手段。一旦一個基因已被克隆它就可在不同種之間轉移。利用基因的鑒定測序和轉化的方法將基因從一種植物轉移到另一種植物中的方法在工業(yè)中是廣為人知的。Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molecular Biology 1992，4349-82中Virginia Walbot的題為“Strategies for Muatgenesis and Gene Cloning UsingTransposon Tagging and T-DNA Insertional Mutagenesis”的文章。在Plant Cell，Vol 5，pp.1555-1566(November 1993)中PhilipStinard等人的題為“Genetic Isolation，Cloning and Analysisof a Mutator-induced，Dominant Antimorph of the Maize AmyloseExtenderl Locus.”的文章報道了利用mu1元件轉座子標記在玉米中進行遺傳分離和克隆直鏈淀粉伸長基因的具體例子。文章報道了進行轉座子標記的突變植物和突變基因的鑒定。該基因用本領域中已知的方法測序。測出序列的部分作為探針被用于鑒定突變基因，然后克隆了該基因?；虻目寺∫延袑嵺`并作為一種技術已很好地得以建立。貫穿本發(fā)明的重組DNA技術對于本領域的技術人員是已知的并在Mantiatis等人的MOLECULAR CLONINGa Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold spring Harbor，N.Y.中有所描述。
可開關的或可誘導的轉化構建體是已知的并可通過本領域中已知的手段制備。通常在基因被克隆之后將其置入用于轉化植物的構建體中。該基因、或等位基因、或其截短的、置換的或缺失的變體，可被置入轉化載體的有義或反義位置。普通技術人員可預期通過反義技術下調天然基因并不需要將整個基因插入反義方向，而只需插入能產生下調的序列。這就是說基因片段，如含30-100個核酸堿基，優(yōu)選地45-65個核酸堿基的片段可用于下調基因的表達。
用于植物轉化的轉化載體可購自Clontech或其它供應商。載體的選擇優(yōu)選地應提供適應于植物種屬和所應用的轉化方法的恰當材料。例如如果植物容易進行農桿菌轉化那么所選的載體應在載體中包括T-DNA部分。啟動子、內含子、前導序列和選擇標記的選擇使得該基因編碼的氨基酸序列在所需的植物中以所需的水平表達。進而，通過針對被轉化宿主細胞的特定密碼子使用優(yōu)化可優(yōu)化載體。
最近誘導型啟動子已被用于激活與啟動子可操作連接的基因。對激活因素應答后誘導型啟動子激活或抑制基因。
對于本發(fā)明的目的而言啟動子可以是被打開從而該基因或可操作連接的核酸序列表達(包括僅僅轉錄或轉錄加翻譯)，或者啟動子也可是被關閉從而該基因或可操作連接的核酸序列不表達(包括僅僅轉錄或轉錄加翻譯)。也可使用與激活因素接觸時改變表達水平的啟動子。這樣的啟動子在本領域中是廣為人知的并被命名為“可開關型”或“誘導型”。作為對激活因素如熱、光、潮濕?；瘜W試劑等等的反應，誘導型啟動子激活基因。U.S Patent No.5,608,143描述了對作為激活劑的多種取代苯磺胺具有高應答性的核酸啟動子的應用。誘導型啟動子被應用于重組DNA構建體中使基因的表達可由作為激活劑的外界化學控制劑控制。
U.S Patent No.5,432,068描述了用于控制雄性生育力的可外部誘導啟動子。WO90/08826描述了一種基因啟動子序列(GSTII(谷胱甘肽-S-轉移酶同工型II))，該序列對植物除草劑安全劑(N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺)應答，上述除草劑安全劑被用作基因開關以從外部控制基因的表達。本領域中已知還有其它外部化學誘導型啟動子。
轉化雙子葉和單子葉植物的方法是已知的。適用于待轉化植物種屬的構建體很容易購買到或由本領域的普通技術人員制備得到。然后這些構建體被轉化入植物的細胞或組織或花粉。轉化方法包括，但不限于，微粒轟擊、觸須導入(whiskering)、電穿孔、農桿菌等等。這些技術的效率各不相同，領域的普通技術人員可根據(jù)待轉化的組織類型和植物種屬選擇方法。
所需特性的選擇性育種，如產生可由商業(yè)途徑獲得的高油玉米Top Cross系，是已知的。一旦轉化體得以再生(如果有必要的話)它就可和該種屬的其它植物一起被用于育種方法。普通技術人員應知道育種實踐依賴于所選擇的種屬。例如大豆是品種栽培培育而玉米則是通過品種雜交。由Dupont申請專利的一種玉米育種方法不是用雜交種子而是聯(lián)合應用雄性不育雜交種子和雄性授粉株。農民種植的不是雜交種子而是雄性不育種子和一種帶有高油含量特性的雄性授粉株(玉米的近親交配種子)。雜交canola正在培育中。目前正在嘗試使現(xiàn)在尚未進行雜交育種的谷物從品種栽培轉向雜交種子以得到雜種優(yōu)勢，但更重要的是減小與能從種子復制自身的植物的生產相聯(lián)系的種質風險(Germplasm risk)(雜交種子有性狀分離現(xiàn)象而近親交配種子沒有)。
仍然存在對由于植物中產生的肌醇六磷酸減少而具有附加營養(yǎng)價值的谷物的需求。對使種子致死從而防止自發(fā)的植物發(fā)育的方法的需求也仍然存在。對很多植物的種子仍然存在可誘導的致死特性的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是使種子，尤其是玉米種子，具有很低的肌醇六磷酸含量。
本發(fā)明的另一個目的是使谷粒，優(yōu)選非玉米谷粒，由于植物中產生的肌醇六磷酸減少而具有增加的營養(yǎng)價值。
本發(fā)明的另一目的是提供不能發(fā)芽的種子，這種種子含有至少一種遺傳構建體，它與非天然的誘導型啟動子或其它遺傳元件可操作地連接并受其控制，其中至少一種遺傳構建體受到誘導時產生可發(fā)芽的種子。根據(jù)本發(fā)明的上述種子具有不可發(fā)芽的特性或表型，同時含有一種受誘導型啟動子控制的遺傳構建體，從而當啟動子被誘導時不發(fā)芽特性被校正或克服并且種子將發(fā)芽。
本發(fā)明的另一目的是提供能發(fā)芽的種子，這種種子含有至少一種遺傳構建體，它與非天然的誘導型啟動子或其它遺傳元件可操作地連接并受其控制，其中至少一種遺傳構建體受到誘導時產生不能發(fā)芽的種子。根據(jù)本發(fā)明的上述種子具有可發(fā)芽的特性或表型，同時含有一種受誘導型啟動子控制的遺傳構建體，從而當啟動子被誘導時可發(fā)芽特性被破壞或克服并且種子將不發(fā)芽。
本發(fā)明的目的進而為提供編碼參與肌醇六磷酸合成的蛋白的核酸分子(序列)和所編碼的肌醇六磷酸及其抗體。
本發(fā)明的一個目的為提供載體(表達與克隆)，以及載體的使用方法，制備本發(fā)明的優(yōu)選含有肌醇六磷酸編碼核酸序列或其等位基因，或截短、替換、插入突變體，或其片段的種子。
本發(fā)明的目的進而為提供產生誘導型不發(fā)芽種子和誘導型發(fā)芽種子的方法。
本發(fā)明的目的進而為提供一種防止從落地的種子自生自長成植物的方法，該方法包括種植和生長本發(fā)明的成熟可發(fā)芽種子并對從它得到的植物使用激活劑以產生不能發(fā)芽的子代種子或胚。
根據(jù)本說明書和附圖，還有其它的目的和優(yōu)勢將是顯而見的。
附圖簡述

圖1為根據(jù)本發(fā)明的構建體的二元(binary)示意圖，該構建體是設計用于雙子葉植物和能為農桿菌所轉化的單子葉植物。該構建體含有右側T-DNA邊界、NOS啟動子、NPTII標記基因和NOS終止子、誘導型啟動子，此例中為GSTII啟動子序列，和有義取向的肌醇六磷酸基因、NOS終止子和左側T-DNA邊界。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的構建體的二元示意圖，該構建體是設計用于雙子葉植物和能為農桿菌所轉化的單子葉植物。該構建體含有右側T-DNA邊界、NOS啟動子、NPTII標記基因和NOS終止子、誘導型啟動子，此例中為來自編碼U.S.Patent No.5,608,143中所描述的cDNA克隆5-2的基團和圖5中所示序列(該克隆5-2保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，Manassas VA，保藏號.67804)(該專利以參考文獻的形式引用)的啟動子區(qū)域，和反義取向的肌醇六磷酸基因、NOS終止子和左側T-DNA邊界。
圖3示明帶啟動子的構建體，在此例中啟動子區(qū)域源自編碼U.S.Patent No.5,608,143中所描述的cDNA克隆5-2的基因和圖5中所示序列(其中該克隆保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，Manassas VA，保藏號.67804)，本發(fā)明中的肌醇六磷酸基因和NOS終止子。肌醇六磷酸基因處于有義取向。
圖4示明帶GSTII啟動子序列的構建體，根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸基因和NOS終止子。肌醇六磷酸基因處于反義取向。
圖5示明現(xiàn)有技術中源自U.S.Patent No.5,608,143中命名為52.411的基因的5-2基因啟動子的核苷酸序列。
圖6示明從3個近親交配系的肌醇六磷酸測試得到的數(shù)據(jù)的一個例子，以頻率分布曲線的形式作圖。
圖7示明從低肌醇六磷酸突變體分離低肌醇六磷酸(高磷酸)含量得到的數(shù)據(jù)。
圖8示明肌醇-1-磷酸合成酶，的核酸序列和氨基酸序列，登記號AF056326。
圖9示明發(fā)表的Zea肌醇-1-磷酸合成酶的從堿基86到堿基1620的序列的線型圖譜。
發(fā)明詳述在玉米中EMS(乙基甲烷磺酸鹽，Ethyl Methane Sulfonate)已被用于誘導突變的肌醇六磷酸基因以得到低肌醇六磷酸種子。例如低肌醇六磷酸玉米突變體，lpa1已由Raboy得到(U.S Patent No.5,608,143)。在一些情況下種子的肌醇六磷酸含量可能足夠低從而阻止種子發(fā)芽。在另外的情況下發(fā)現(xiàn)低肌醇六磷酸種子正常發(fā)芽。
根據(jù)本發(fā)明的基因被從這些突變植物中重復分離和克隆?？寺〉幕蚓幋a一種影響種子中肌醇六磷酸產生的酶。根據(jù)本發(fā)明的基因包括被克隆基因的等位基因、截短、缺失或替換突變體以及有用的片段，如那些可以以反義的方式下調該基因的片段。本發(fā)明提供了轉化載體，含有與一誘導型啟動子可操作連接的新基因從而使該基因的致死效應能被操作、應用或控制。
該載體對于不能雜交的作物如大豆、小麥、大麥、玉米，canola和向日葵是有用的，因為該載體可以用于制備種子，該種子的肌醇六磷酸含量很低并且種子只能在誘導后嚴格控制的條件下發(fā)芽。本發(fā)明的載體在植物中具有以下優(yōu)點(i)它對農民是有用的因為它通過使種子不能發(fā)芽從而在下一個季節(jié)中消除了自發(fā)生長的植物。(ii)它對種子公司是有用的，因為它通過使種子不能再生用于育種而保證了種質安全性。(iii)進而它通過使種子在以后的年份不能再生而防止農民儲存種子(iv)它對于飼料或谷類加工業(yè)是有用的因為它通過較低的肌醇六磷酸含量使飼料或谷類加工產品具有較高的營養(yǎng)價值。該發(fā)明對面粉谷粒和飼料谷粒特別有用。這些包括，但不限于，玉米、小麥、大豆、向日葵、燕麥、黑麥等等。
因此，本發(fā)明提供了種子安全的方法，包括提供低肌醇六磷酸，木發(fā)芽的子代種子或胚，該種子或胚被改變成包含與誘導型啟動子有效連接并在其控制下的編碼功能性肌醇6磷酸的基因?；虻亩ㄎ缓头蛛x本發(fā)明的基因可通過與具有能降低種子中肌醇六磷酸含量的遺傳突變的玉米植物雜交而分離。可從此基因中鑒定野生型或天然基因與突變基因。天然肌醇六磷酸基因與突變肌醇六磷酸基因都能應用于本發(fā)明中。
在一個實施例中本發(fā)明提供了制備和應用種子的方法以及由該方法產生的種子和植物，其中通過插入在有義方向編碼參與肌醇六磷酸合成的蛋白基因或其片段的反義構建體，使種子的肌醇六磷酸含量被完全消除或大大降低，上述基因縱然與弱啟動子可操作連接也能預期其將至少大大降低種子的肌醇六磷酸水平。
在另一實施例中本發(fā)明提供了制備和應用種子以及源自上述種子的植物的方法，其中通過插入天然基因或其片段的有義構建體，使含有低肌醇六磷酸突變體的種子的肌醇六磷酸含量得以恢復，即被突變以產生低肌醇六磷酸表型的天然基因，縱然與與弱啟動子可操作連接也能預期其將，或已知其將，提高種子的肌醇六磷酸水平。
分離本發(fā)明的肌醇六磷酸編碼核酸序列的一種方法是通過應用根據(jù)本領域中已知的方法能克隆該基因的轉座子標記突變體?？赊D座元件對該基因進行標記，換句話說，轉座子插入位點側序列是本發(fā)明感興趣的基因的一部分。根據(jù)本發(fā)明，這里以玉米為例子進行說明，低肌醇六磷酸突變近親交配系與含有mu1突變基因的品系雜交并且通過mu1元件插入本發(fā)明感興趣的基因鑒定了低肌醇六磷酸突變基因。在本發(fā)明的舉例說明的實施例中所用的mu1是都具有～20bp末端顛倒重復序列的mu1-9家族的一部分。在突變品系中含有轉座子的多重拷貝，它們在玉米中是具有侵略性的突變原。大部分mu插入事件產生無效表型，因為可轉座元件的插入并不導致改變的必須蛋白。在定位轉座子標記中插入事件是針對已知的突變，如低肌醇六磷酸基因。插入事件發(fā)生的范圍為每條測試染色體的每個位點～10-4到10-6次插入。當肌醇六磷酸基因具有DNA轉位子插入時為了鑒定要求有從插入事件鑒定突變體表型的方法以及在配偶子中從切除事件恢復部分或全部功能。然后標記的突變體可與帶有隱性低肌醇六磷酸基因的低肌醇六磷酸突變植物雜交。如果可轉座元件著陸或插入到感興趣的基因那么從雜交得到的谷粒就可被鑒定為低肌醇六磷酸谷?；虻图〈剂姿猁}谷粒。該基因是隱性的，其性狀只有在兩個親本都帶有低肌醇六磷酸基因時才表現(xiàn)。等位性的測試是用類似的已知低肌醇六磷酸突變體以類似的雜交育種方式進行。
如果使用活性較低的元件的話為了發(fā)現(xiàn)可轉座事件需要幾十萬的后裔。Mu1的應用大大減少了篩選該谷粒特性所需的后代的數(shù)量。與具有目的突變基因的近親交配系回交也許是有用的，這依賴于所使用的可轉座元件。因為使用mu1系，在此描述的本發(fā)明的例子進行了回交。通過監(jiān)測在種子中產生紫色的花青素通路報告基因可鑒定在回交過程中失去增變基因活性的mu1系。因為拷貝數(shù)的大大減少，和標準玉米近親交配系的回交大大簡化了性狀分離分析。等位性用類似的已知突變體測試。利用轉座子元件作為探針克隆突變等位基因或替代地探測天然野生型基因，從而克隆了mu1元件。這種方法在種子中鑒定了低肌醇六磷酸的天然和突變基因，這些基因可以為本工藝中已知的方法所分離純化和測序。
作為克隆功能性基因的一種有效方法，發(fā)現(xiàn)可突變等位基因的方法需要用插入元件標記的突變基因、該元件的克隆、確認該克隆復原的分析手段以及簡單的遺傳學測試。報告基因活性的丟失被用于顯示增變基因活性的丟失。通常該過程包括一個名為共分離的過程。這需要選擇和收獲用于分子克隆的組織；從不同系的雜交后代制備DNA；從每種植物系的幾種m/m(隱性突變基因純合體)個體和幾種M/M個體(野生型基因純合體)制備樣品。下一步，在用5-甲基胞嘧啶不敏感、不能消化標記突變體的mu1元件的酶消化后對從mu標記的材料得到的DNA進行Southern印跡雜交。定位和鑒定所有在m/m個體中出現(xiàn)而在M/M個體中不出現(xiàn)的條帶。制備m/m個體的DNA庫并制備三種不同系的樣品。搜索和選擇最深并且三系都共有的唯一雙倍體片段。這個共分離過程將鑒定標記突變體基因的mu-元件。結果通過與分離實驗的匹配進行確認。通過無共遷移跡象分離條帶最少的植物系的定位從Southern印跡雜交中鑒定片段。通過該系大量m/m和M/M后代的樣品的分析以評估條帶和表型之間的統(tǒng)計學顯著性。多種酶被用于此確認過程。用幾種酶對此種群測試中的顯著樣品進行消化以篩選不消化該條帶的酶。這是通過初始的限制性酶和對該條帶消化很弱的酶的雙酶解以及高分辨瓊脂糖凝膠完成的。然后擴增未被消化DNA的m/m消化庫，并且根據(jù)大小選擇和克隆。
基因克隆由上述方法克隆的基因是編碼改變植物中肌醇六磷酸水平的蛋白氨基酸序列的基因。這些基因被命名為肌醇六磷酸(鹽)基因(肌醇六磷酸基因)。
誘導型啟動子許多混合物在植物中具有控制基因表達的功能?；虮磉_的誘導劑必須安全并且對植物的農業(yè)特性無有害效應。
已知天然產物，如激素，以及其它化學物質影響植物基因表達。植物生長調節(jié)因子，包括AAA、乙烯、脫落酸、生長素、水楊酸和其它植物激素都影響基因表達。這些天然化學物質表現(xiàn)為誘導基因表達。影響基因表達的激素，不論是合成的或天然的，都可以用于本發(fā)明中。但是應注意避免由于植物內在系統(tǒng)的共激活而導致激活不希望發(fā)生的植物生長或避免植物中致死基因的激活。作為誘導劑的激素應是不會激活對終產物有害的代謝途徑的激素。
調節(jié)外來基因的環(huán)境誘導劑包括光、熱、低溫和空氣中不同的氣體水平。根據(jù)本發(fā)明這些調節(jié)因素可以單獨或聯(lián)合使用。這些調節(jié)因素的實踐性略差，因為目前還沒有已知的方法可以控制這些眾多的環(huán)境誘導劑。生長季節(jié)較為寒冷或較為多云從而使這些誘導劑不被強烈誘導或不在適當?shù)臅r候被誘導，這并不是不可能的。所以雖然這些類型的誘導劑可能在本發(fā)明中發(fā)揮作用，但選擇時應小心謹慎。
其它植物基因已為受傷或病原感染時出現(xiàn)的寡糖所誘導，例如，大豆中葡聚糖對丙氨酸氨基裂解酶和查耳酮的誘導，或者馬鈴薯中受傷類誘導型抑制基因(wound-like inducible inhibition gene)的誘導。這種誘導需要更多工作，因為需要在植物上制造傷口以誘導外源基因。
在大多數(shù)情況下，安全并對其所使用的植物沒有影響或影響很小的誘導因素是最有用的。誘導劑的優(yōu)選的外部調控是能在植物生長周期的任何時間、在任何組織中誘導所需基因表達的介質。這需要在使用激活物質如化學物質時被激活或去激活的啟動子。在許多種屬的植物中通過控制這種應答完成上述調節(jié)而只對植物生長產生很小的影響。理想的激活劑是可以用普通的田間設備與其它一些通常在田間施用的物質如除草劑聯(lián)合使用的化學物質從而避免反復經過田間。替代地，該物質可通過作物撒粉型設備在空中施用。
本發(fā)明的至少一個實施例使用了一種已知在被激活劑激活時能容許(導致)保護植物的酶產生的啟動子。其中上述的激活劑通常被稱為化學安全劑，經常與除草劑一起使用。已經知道用安全劑較低毒性時植物能被更好地保護，使之不受除草劑的傷害。安全劑的一個例子是一種通過使除草劑與谷胱甘肽結合而發(fā)揮作用的物質。這是由于受安全劑保護的植物中GST的mRNA水平上升從而使谷胱甘肽-S-轉移酶活性(GST)升高的結果。這樣安全劑處理增加了基因產物而不對植物產生消極影響。
已知使用磺?；蛩貫槌輨r玉米能為多種試劑所安全化，包括，但不限于，萘甲酸酐、N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺或cyometrinil。在使用安全劑的數(shù)小時內chlosulforon和metsulfuron methyl的代謝速率增高。在本發(fā)明中與本發(fā)明的肌醇六磷酸基因連接的是用作可開關啟動子的GST酶啟動子。
在本發(fā)明中有用的基因誘導劑可以為任何多種的誘導或激活介質。顯然US Patent No.5,608,143(以參考的形式結合)和/或WO90/08826(在此參考結合)中名為“基因開關(Gene Switch)”中的誘導劑是有用的。使用一種誘導劑開關基因的方法在本領域中是已知的并可以根據(jù)本發(fā)明的指導執(zhí)行。這些方法在WO93/09237中也有所描述。
本發(fā)明優(yōu)選的啟動子是這些對除草劑配方中所使用安全劑應答的啟動子。在自然界中這些啟動子和它們所相關的基因為除草劑中的安全劑所誘導從而保護植物，使之免除沒有安全劑時可能產生的傷害。在本發(fā)明中這些啟動子和異源基因優(yōu)選地為安全劑所激活和打開或關閉。安全劑優(yōu)選地加入到除草劑中并且如果植物不具有除草劑抗性的話標記基因可使該植物抗除草劑。作為替代途徑化學物質，如除草劑，可以對植物單獨施用。當除草劑的主要施用時間明顯早于種子發(fā)育時這是有用的。
因此本發(fā)明提供了制備和應用種子以及源自上述種子的植物和種子的方法，其中通過插入在有義方向編碼參與肌醇六磷酸合成的蛋白基因或其片段的反義構建體，種子的肌醇六磷酸含量被完全消除或大大降低。上述基因縱然與弱啟動子可操作連接也能預期其將至少大大降低種子的肌醇六磷酸水平。其中構建體與由化學物質或環(huán)境因素所誘導，優(yōu)選地由安全劑誘導的啟動子或其它遺傳元件可操作地連接，從而當對源自該種子的植物施用化學物質或環(huán)境因素后得到的種子與原始種子相比肌醇六磷酸的含量大大減小。
與產生接受誘導的植物的種子相比，優(yōu)選地，從接受誘導的植物得到的種子肌醇六磷酸含量按重量計算小于對照的5％，優(yōu)選地按重量計算肌醇六磷酸含量小于對照的2％，，優(yōu)選地按重量計算肌醇六磷酸含量小于對照的1％。
本領域的普通技術人員會理解測量肌醇六磷酸含量的通常方法需要破壞種子從而使這些對比值經常為本文所述產生的種子樣品的平均值。和相對于親本種子肌醇六磷酸含量的下降無關，本發(fā)明的一個方面是提供在對親本植物誘導后不能發(fā)育的種子。
在另一實施例中本發(fā)明提供了制備和應用種子以及源自上述種子的植物和種子的方法，其中通過插入天然基因或其片段的有義構建體，使含有低肌醇六磷酸突變體的種子的肌醇六磷酸含量得以恢復，即被突變以產生低肌醇六磷酸表型的天然基因，縱然與弱啟動子可操作連接也能預期其將，或已知其將，提高種子的肌醇六磷酸水平。其中構建體與由化學物質或環(huán)境因素所誘導，優(yōu)選地由安全劑誘導的啟動子或其它遺傳元件可操作地連接，從而當對源自該種子的植物施用化學物質或環(huán)境因素后得到的種子與原始種子相比肌醇六磷酸的含量增加。與產生接受誘導的植物的種子相比，優(yōu)選地，從接受誘導的植物得到的種子肌醇六磷酸含量的增加按重量計算大于對照的5％，優(yōu)選地按重量計算肌醇六磷酸含量增加大于對照的8％，，優(yōu)選地按重量計算肌醇六磷酸含量的增加大于對照的10％。
本領域的普通技術人員會知道本發(fā)明的肌醇六磷酸含量低或減少的植物和種子可通過單獨轉化編碼肌醇六磷酸酶的核酸分子，優(yōu)選地與本發(fā)明的啟動子可操作地連接，而實現(xiàn)，或與此處描述的肌醇六磷酸基因及其變體共同轉化而實現(xiàn)。谷粒發(fā)育過程中這些肌醇六磷酸酶(降解肌醇六磷酸的酶)的表達可用于降解發(fā)育中的種子合成的肌醇六磷酸。肌醇六磷酸酶編碼序列是已知的，如NCBI中或其它地方已發(fā)表的，登記號為P34752gi|464382|sp|P34752|PHYA_ASPNG [464382]；P34753，gi|464381|sp|P34753|PHYA_ASPAW[464381]；2599490(AF029053)phyb13precursor[Bacillus subtilis]gi|2599490[2599490]；1IHPgi|2981783|pdb|1IHP|[2981783]；3150040(U85968)gi|3150040[3150040]；2943981(U92439)phytase[Enterobacter cloacae]gi|2943981[2943981]；P34754 gi|464385|sp|P34754|PHYB_ASPNG[464385]；P34755gi|464384|sp|P34755|PHYB_ASPAW[464384]；P07102gi|130735|sp|P07102|PPA_ECOLI[130735]；2108356(U59802)phytase[Talaromyces thermophilus]gi|2108356[2108356]；2108354(U59804)phytase[Aspergillus fumigatus]gi|2108354[2108354]；2108352(U59803)phytase[Emericella nidulans]gi|2108352[2108352]；2300890(A46793)gi|2300890|gnl|PID|e306401[2300890]；2300889(A46793)gi|2300889|gnl|PID|e306184[2300889]；2300887(A46791)gi|2300887|gnl|PID|e306400[2300887]；2300885(A46789)gi|2300885|gnl|PID|e306183[2300885]；2300883(A46787)gi|2300883|gnl|PID|e306182[2300883]；2300881(A46785)gi|2300881|gnl|PID|e306399[2300881]；2300879(A46783)gi|2300879|gnl|PID|e306181[2300879]；2148991(U60412)phytase[Aspergillus terreus]gi|2148991[2148991]；JN0715 3-phytase(EC 3.1.3.8)Bprecursor-Aspergillus ficuum gi|542378|pir||JN0715[542378]；JN0890 acidphosphatase(EC 3.1.3.2)precursor-Aspergillus awamorigi|542377|pir||JN0890[542377]；JN0889 3-phytase(EC 3.1.3.8)A precursor-Aspergillus awamori gi|542376|pir||JN0889[542376]；JN0656 3-phytase(EC 3.1.3.8)A precursor-Aspergillus niger gi|484414|pir||JN0656[484414]；JN0482 3-phytase(EC 3.1.3.8)A-Aspergillus ficuumgi|419906|pir||JN0482[419906]；PQ0641 3-phytase(EC 3.1.3.8)-Aspergillus ficuum(fragments)gi|542374|pir||PQ0641[542374]；S33278phytase P2-Escherichia coli(fragment)gi|421153|pir||S33278[421153]；B36733 acid phosphatase(EC 3.1.3.2)precursor-Escherichia coligi|96267|pir||B36733[96267]；S18408 alkaline phosphatase(EC 3.1.3.1)-ratgi|111353|pir||S18408 111353]；1943870(U59806)phytase[Thielaviaheterothallica]gi|1943870[1943870]；1943868(U59805)phytase[Aspergillus terreus]gi|1943868[1943868]；1938256(U75531)phytase[Zeamays]gi|1938256[1938256]；all sequences and text of US patent5593963，including，gi|1831488|pat|US|5593963|20 1831488]；408990phytase{EC 3.1.3.26}[Aspergillus ficuum，Peptide，441 aa][Aspergillusficuum]gi|408990|bbs|130910[408990]；235916 gi|235916|bbs|58159[235916]；235915 gi|235915|bbs|58160[235915]；2393 gi|2393；allsequences and text of US-5436156，including gi|912286|pat|US|5436156|32[912286]；583196(A19452)gi|583196 [583196]；583194(A19451)gi|583194[583194]；166521(M94550)gi|166521[166521]；166519(L02421)phytase[Aspergillus niger]gi|166519[166519]；166482(L02420)acid phosphatase[Aspergillus niger]gi|166482[166482]；304097(L20567)phyB Aspergillusniger]gi|304097[304097].對本發(fā)明有用的方法和構建體也可在U.S.Patent No.s 5,770,413到5,593,963中找到。
如本領域中已知的那樣，在進一步的實施例中構建體和啟動子或其它遺傳元件與標記基因可操作地連接。
在本發(fā)明的一個實施例中本發(fā)明的實施例中所描述的植物和種子為玉米、大豆、大米、燕麥、向日葵、小麥、大麥、飼料草、等等，中的一種。
構建體本發(fā)明包括具有與肌醇六磷酸基因連接的啟動子的構建體，該啟動子受外來控制從而在被激活時使得種子中肌醇六磷酸的含量如此之低以至于種子不能發(fā)芽(即不能形成可成熟的植物)。該構建體可被轉化入任何多種可轉化的植物中。基因在構建體中的取向決定該基因是將被上調，有義取向，或被下調，反義取向。
圖1為根據(jù)本發(fā)明的構建體的二元示意圖。此構建體主要是為用于農桿菌轉化而開發(fā)的。因此它主要是為在雙子葉植物和能為農桿菌轉化的單子葉植物中的應用而開發(fā)的。該構建體含有右側T-DNA邊界、NOS啟動子、NPTII標記基因和NOS終止子、誘導型啟動子，此例中為GSTII啟動子序列，和有義取向的肌醇六磷酸鹽基因、NOS終止子和左側T-DNA邊界。該構建體對于大豆和類似植物的育種是理想的。標記基因可選擇除草劑抗性基因如增甘磷(glyphosate)抗性基因。
圖2為根據(jù)本發(fā)明的為在雙子葉植物和能為農桿菌轉化的單子葉植物中的應用而開發(fā)的構建體的二元示意圖。該構建體含有右側T-DNA邊界、NOS啟動子、NPTII標記基因和NOS終止子、誘導型啟動子，此例中為編碼U.S.Patent No.5,608,143中所描述的編碼cDNA克隆5-2的基因和圖5中所示序列(儲存于American TypeCulture Collection，ATCC，Manassas VA，索取號.67804)(該專利以參考的形式結合與此)的誘導型啟動子區(qū)域，和反義取向的肌醇六磷酸基因、NOS終止子和左側T-DNA邊界。通過含安全劑的除草劑的施用或安全劑的單獨施用激活該啟動子從而表達上述基因所表達的蛋白。
圖3示明帶啟動子的構建體，在此例中啟動子區(qū)域源自編碼U.S.Patent No.5,608,143中所描述的編碼cDNA克隆5-2的基因和圖5中所示序列(儲存于American Type Culture Collection，ATCC，Manassas VA，索取號.67804)，本發(fā)明中的肌醇六磷酸基因和NOS終止子。肌醇六磷酸基因處于有義取向。施用激活劑時啟動子被打開，基因表達其所編碼的氨基酸序列。
圖4示明帶GSTII啟動子的構建體，根據(jù)本發(fā)明的肌醇六磷酸基因和NOS終止子。肌醇六磷酸基因處于反義取向。
這些構建體的不同形式可被轉化入玉米、大豆、水稻、燕麥、向日葵、小麥、大麥、飼料草、等等。本發(fā)明包括針對這些植物中的每一種進行優(yōu)化的構建體，例如，密碼子和啟動子等等的優(yōu)化，以及其它任何增強表達的過程和為產生活性酶或理想的反義或共抑制效應而優(yōu)化的構建體。例如這些構建體可被用于制造已經存在的通過外部施用激活劑進行調節(jié)的低肌醇六磷酸突變體。構建體中的啟動子可啟動以誘導基因表達，或者激活劑可通過誘導啟動子關閉而停止基因的表達。類似地，基因在構建體中的取向可以是有義取向或反義取向，有義取向上調基因表達而反義取向下調基因表達。這樣可以通過啟動子的誘導打開或誘導關閉或該變基因的取向達到同一效果。
轉化附圖的前四幅示明了根據(jù)本發(fā)明的載體的示意圖。前兩幅圖是適用于農桿菌轉化的構建體。后二幅是用于其它轉化技術，如微粒轟擊(micro particle bombardment)，的質粒。這些轉化技術在本領域中是廣為人知的。另外，這些質粒可很好地應用于以參考形式結合于此的U.S.Patent No.5,302,523和U.S.Patent No.5,464,765中所描述的觸須轉化系統(tǒng)(whiskers transformation system)。例1有四種方法制造本發(fā)明的低肌醇六磷酸種子材料。優(yōu)選的方法給農民提供的種子產品是低肌醇六磷酸并且同時不能發(fā)芽的從而使種子不能產生成熟的植物。本發(fā)明的優(yōu)選的種子在載培的品種不是雜種時防止農民保留種子。盡管開發(fā)小麥和canola雜種可能性的研究正在進行，目前大多數(shù)canola、小麥和大豆都不是以雜種出售的。如果植物不是以雜交種子商品化，而是象小麥和大豆一樣形成種子，那么可以很容易生產根據(jù)本發(fā)明的材料。
近親交配材料的轉化體育種如果啟動子的誘導使基因打開，并且基因處于反義取向，那么激活劑的施用將產生肌醇六磷酸水平很低的種子。這種種子將不會發(fā)芽。優(yōu)選地激活劑在谷粒灌漿時或稍稍在灌漿之前施用。如果啟動子是GSTII或其它安全劑誘導的啟動子的話激活劑優(yōu)選地為可加入到除草劑的安全劑。這樣在擴增種子時不對種子噴激活劑，這使產生的種子具有正常水平的肌醇六磷酸。然而當種子被出售給農民以生產低肌醇六磷酸含量的谷粒時應對植物施用激活劑以生產低或無肌醇六磷酸的種子。由于種子的肌醇六磷酸含量低激活劑還將使種子不能發(fā)芽。這樣大豆或其它植物種屬的種子在隨后的季節(jié)里不會成長為自發(fā)植物種子也不能被保留到以后的年份里用于種植。
在本實施例中本發(fā)明提供了一種含有肌醇六磷酸含量足夠發(fā)芽的成熟種子；該種子含有基因構建體，該構建體含有與在有義方向編碼肌醇六磷酸的核酸分子或其片段或其等位變體可操作地連接的啟動子，上述核酸分子在構建體中相對于啟動子被置于反義方向，從而當從成熟種子長成的植物中的啟動子被激活劑激活時得到的種子將不會發(fā)芽。本發(fā)明提供了從成熟的種子得到的植物以及減少自發(fā)植物的生長和減少保留的種子中可發(fā)芽種子數(shù)量的方法，該方法包括對種子施用激活劑。
如果啟動子的誘導使基因關閉，并且基因處于有義方向，那么該植物在沒有含啟動子和基因的構建體時必須含有在種子中產生的肌醇六磷酸水平很低的該基因的突變體，從而種子在沒有含啟動子和基因的構建體時不能發(fā)芽。對從含有本實施例的構建體的成熟種子產生的植物施用激活劑將產生肌醇六磷酸含量很低的不能發(fā)芽的種子或胚。如果啟動子是或含有圖5種所示的啟動子片段的話那么激活劑優(yōu)選地為加入到除草劑的安全劑。該激活劑優(yōu)選地為取代苯磺胺。這樣在擴增種子時，即種植本實施例的成熟種子的后代以增加本實施例的成熟種子的數(shù)量時，不對從本實施例的成熟種子得到的植物噴灑激活劑。但是當種植本實施例的中種子是為了給農民或最終用戶提供種子或谷粒時應對從本發(fā)明本實施例的成熟種子得到的植物施用激活劑以產生低肌醇六磷酸、不能發(fā)芽的發(fā)育中的種子(胚或未成熟種子)。這將導致產生肌醇六磷酸含量很低并且不能發(fā)芽的種子。這樣大豆或其它植物種屬的種子在隨后的季節(jié)理不會成長為自發(fā)植物種子也不能被保留到以后的年份里用于種植。
在本實施例中本發(fā)明提供了一種含有肌醇六磷酸含量足夠發(fā)芽的成熟種子，其中充足含量的肌醇六磷酸中至少一部分是由含有與編碼肌醇六磷酸的核酸分子可操作連接的啟動子的遺傳構建體提供，這樣當對從成熟種子發(fā)育成的植物中的啟動子被激活劑激活時將由植物產生不能發(fā)芽的不成熟種子或胚。本實施例的種子在沒有構建體時不能產生充足的肌醇六磷酸以發(fā)芽。本發(fā)明提供了從成熟的種子得到的植物以及減少自發(fā)植物的生長和減少保留的種子中可發(fā)芽種子數(shù)量的方法，該方法包括對種子施用激活劑。
如果啟動子的誘導使基因打開，并且基因處于有義方向，那么植物應含有在種子中產生的肌醇六磷酸水平極低的突變基因。這樣的種子將不能發(fā)芽。在本實施例中激活劑的施用由于提高了產生的肌醇六磷酸水平而恢復種子的發(fā)芽性。如果啟動子是或含有圖5種所示的啟動子片段的話那么激活劑優(yōu)選地為加入到除草劑的安全劑。該激活劑優(yōu)選地為取代苯磺胺。這樣在擴增種子時，即種植本實施例的成熟種子的后代以增加本實施例的成熟種子的數(shù)量時，對從本實施例的成熟種子得到的植物噴灑激活劑。但是當種植本實施例中的種子是為了給農民或其它用戶提供低肌醇六磷酸含量的種子或谷粒時應施用激活劑。這將導致產生肌醇六磷酸含量很低并且不能發(fā)芽的種子。這樣大豆或其它植物種屬的種子在隨后的季節(jié)里不會成長為自發(fā)植物種子也不能被保留到以后的年份里用于種植。
在本實施例中本發(fā)明提供了一種含有肌醇六磷酸含量足夠發(fā)芽的成熟種子，其中充足含量的肌醇六磷酸中至少一部分是由含有與編碼肌醇六磷酸的核酸分子可操作連接的啟動子的遺傳構建體提供，這樣當對從成熟種子發(fā)育成的植物中的啟動子被激活劑激活時將由植物產生能發(fā)芽的種子或胚。本實施例的成熟種子在沒有構建體時不能產生充足的肌醇六磷酸以發(fā)芽。本發(fā)明提供了從成熟的種子得到的植物以及減少自發(fā)植物的生長和減少保留的種子中可發(fā)芽種子數(shù)量的方法，該方法包括對植物施用激活劑。
如果啟動子的誘導使基因關閉，并且基因處于反義取向，那么植物在啟動子和可操作連接的基因之外應含有能在種子中產生正常水平肌醇六磷酸的正?；蛱烊换颉＿@樣的種子在帶有啟動子和可操作連接的基因時將不能發(fā)芽。激活劑的施用將恢復肌醇六磷酸的產生，從而帶有本實施例中的啟動子和可操作連接的基因的種子將正常發(fā)芽。如果啟動子是或含有圖5種所示的啟動子片段的話那么激活劑優(yōu)選地為加入到除草劑的安全劑。該激活劑優(yōu)選地為取代苯磺胺。這樣在擴增種子時，如上文所描述，對從本實施例的成熟種子得到的植物噴灑激活劑。但是種子是作為低肌醇六磷酸含量的種子提供給農民或其它最終用戶時應施用激活劑。這將導致產生肌醇六磷酸含量很低的種子，低肌醇六磷酸和缺少激活劑將使種子不能發(fā)芽。這樣大豆或其它植物種屬的種子在隨后的季節(jié)里不會成長為自發(fā)植物種子也不能被保留到以后的年份里用于種植。
在本實施例中本發(fā)明提供了一種含有肌醇六磷酸含量足夠發(fā)芽的成熟種子；該種子含有基因構建體，該構建體含有與在有義方向編碼肌醇六磷酸的核酸分子或其片段或其等位變體可操作地連接的啟動子，上述核酸分子在構建體中相對于啟動子被置于反義方向，從而當從成熟種子長成的植物中的啟動子被激活劑激活時得到的種子或胚將會發(fā)育。本實施例的種子在沒有構建體時能制造至少足夠發(fā)芽的肌醇六磷酸。構建體中核酸分子的反義設置使肌醇六磷酸的含量降低得除非施用激活劑否則從成熟種子長成的植物得到的種子或胚不能發(fā)芽。本發(fā)明提供了從成熟的種子得到的植物以及減少自發(fā)植物的生長和減少保留的種子中可發(fā)芽種子數(shù)量的方法，該方法包括對種子施用激活劑。
其它基因取向和啟動子誘導性的聯(lián)用以及其它激活劑是已知的。作為安全劑或殺蟲劑的激活劑是優(yōu)選的，因為它減少了覆蓋田野一次以上所需的時間和費用。換句話說它提供了作為安全劑或殺蟲劑和基因誘導劑的雙重用途。
雜交材料的轉化體育種當植物是雜交植物時，在本發(fā)明中有用的基因取向、突變體和野生型組合的數(shù)量增加。雜交轉化體育種的方法利用了兩種近親交配低肌醇六磷酸突變體形成的雜種，如上文所描述，至少一種突變體帶有遺傳構建體，該遺傳構建體含轉化基因或其能編碼對產生肌醇六磷酸必須的氨基酸序列的等位基因、取代、缺失或截短變體，優(yōu)選地該構建體含有在有義方向編碼野生型肌醇六磷酸的基因。在種子生產過程中對帶有轉化的野生型基因的致死突變體進行誘導噴灑。這誘導了啟動子，基因打開，產生對維持種子發(fā)芽性必須的肌醇六磷酸。這是作為種系的保護者和維持者起作用的。優(yōu)選地，與最終用戶或農民相對，種子的生產者施用激活劑。最終用戶或農民只需種植成熟種子。當誘導型啟動子是由安全劑激活時，如在優(yōu)選的實施例中那樣，技術人員應了解許多植物殺蟲劑可能帶有將誘導基因的激活劑，并且應注意在最終用戶或農民生產雜交種子時限制或阻礙含安全劑殺蟲劑的使用。替代地，可以配制不含本發(fā)明的激活劑的殺蟲劑以在激活劑/安全劑之外獨立使用。在這種情況下單獨施用激活劑/安全劑是優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一實施例利用轉化了野生型基因的野生型植物，上述野生型基因在處于有義方向時產生正常水平的肌醇六磷酸。但是，如這里所描述，在本發(fā)明的本實施例中野生型基因處于反義方向并且與誘導型啟動子可操作地連接。該基因是處于反義方向的，以在植物受到激活劑化學物質作用時敲除植物中野生型基因的表達。這種反義基因是在田野中通過在谷粒生產之前或者在發(fā)育中的種子或胚的發(fā)育過程中施用誘導性化學物質而誘導的。
替代地，可使用具有致死肌醇六磷酸水平的天然突變體植物，并改造該植物使之含有在有義方向與誘導型載體可操作連接，如此處所描述，的野生型基因；上述野生型基因的插入使得當啟動子在植物中被誘導時該植物過量表達此基因從而能產生將來可發(fā)芽的子代種子或胚。誘導型啟動子為化學物質所關閉。最終用戶或農民在植物開始衰老之前對植物施用，如噴灑，化學激活劑。通過這種方法成熟種子含有產生發(fā)芽過程中所需的肌醇六磷酸水平的基因，但該基因被關閉了，并且不施用化學物質，并且野生型基因不表達。
因此本發(fā)明提供了一種與編碼產生肌醇六磷酸必須的氨基酸序列的核酸分子可操作連接的基因開關。根據(jù)待轉化組織的遺傳上和表型上的背景以及將生產的所需產品(子代種子或胚)，普通技術人員可以根據(jù)本發(fā)明選擇構建體中基因的取向以及具體的啟動子開關。實施例2產生可用于轉座子標記的低肌醇六磷酸突變體的方法是一種名為誘變的已知方法。該方法的概要見Neuffer的論文Maize GeneticNewsletter45146。突變通過用溶于石蠟油中的乙基甲烷磺酸酯根據(jù)Neuffer(1974)描述的程序處理近親交配系植物的花粉而進行。曾經對源自不同基因型的多種谷類植物的近親交配系進行了這種處理。本例子將集中于通過此過程開發(fā)玉米的低肌醇六磷酸突變體。
本發(fā)明的過程的總體步驟包括用乙基甲烷磺酸酯，此后用“EMS”表示，處理近親交配系的花粉(在此例中為玉米的花粉)。近親交配系花粉被置于溶于油的EMS中45分鐘。用畫筆將上述花粉刷到受精玉米花穗的穗絲上。這形成突變體-1(M1)種子。這樣的種子將生長并自花授粉形成突變體-2(M2)玉米粒。測試M2玉米粒的低肌醇六磷酸表型。
于1998年7月7日按布達佩斯條約保藏于ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)，保藏號為203034的玉米(Zea Mays)近親交配系EX1965PY是可用作轉位子標記和肌醇六磷酸基因分離的本發(fā)明的一個優(yōu)選玉米突變體。替代地也可使用U.S.Patent No.5,689,054中所描述的玉米(Zea maize)lpa1(lpa1-1)和lpa2(lpa2-1)突變體純合體的種子，它們按布達佩斯條約的要求保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)中，保藏號分別為97678和97679。本發(fā)明的優(yōu)選肌醇六磷酸基因可從上述保藏材料中得到，優(yōu)選地通過本領域中已知的轉座子標記方法得到。本發(fā)明進一步優(yōu)選的核酸序列包括SEQ ID NO1，一個編碼在SEQ ID NO2和圖8圖9中顯示的蛋白的序列，和NCBI(National Center for BiologicalInformation)中所發(fā)表的登記號為g3108052和g3108052的序列。編碼SEQ ID NO2和圖8圖9氨基酸序列的核酸序列能編碼產生肌醇六磷酸所必須的氨基酸序列的等位基因、替代、缺失或截短變體也包括在內。實施例3HVPE方法是低肌醇六磷酸突變體的常規(guī)測試(Raboy，Maydica35383)。該方法依賴于磷化合物的差異遷移。在對化合物的電泳分離后一種色譜能相對與其它化合物對肌醇六磷酸半定量。一種替代方法包括在谷粒中篩選更高的無機磷含量。例如，谷粒樣品可被碾磨(通過Whiley磨粉機的2mm篩子)然后在15ml 0.4M HCl，0.7 Na2SO4中加入50mg谷粒胚芽或1克胚乳。肌醇六磷酸以鐵鹽的形式沉淀。在肌醇六磷酸鐵中的磷被沉淀并測定磷的含量。肌醇六磷酸磷(mg)乘一個轉換系數(shù)3.5即得到肌醇六磷酸含量。
肌醇六磷酸測量的原理是已知的。在本發(fā)明所使用的方法中5-磺基水楊酸和FeCl3(Wade試劑)形成粉紅色的色素。肌醇六磷酸結合此溶液中的鐵從而減少粉紅的程度。對此顏色的減弱可用于表示肌醇六磷酸的水平。由于空白不含有肌醇六磷酸，所有含肌醇六磷酸樣品的讀數(shù)都為負值。但是，當肌醇六磷酸含量太高時鐵-肌醇六磷酸復合物形成白色乳狀物質沉淀。在這種情形下粉紅色不存在但是白色乳狀物質會吸收光從而導致高讀數(shù)的假象。因此一些肉眼觀察是必須的。如果玉米品種具有很高的肌醇六磷酸含量那么有必要使用更少的樣品(小于25微升)。
如下所描述的一種快速篩選方法可用于檢測可能的低肌醇六磷酸種子。在此方法中用單面刀片恰好在黑色層后切去玉米粒頂端的罩。該切割應橫切在或胚根頂端的角質鱗片。通常從每穗玉米上選取8個代表玉米粒。切除表面后玉米粒被置于表面用玻璃紙膠帶(膠面向上)覆蓋的小板上。在至少100組切割后完成染色步驟。
用重復吸液器將10微升的Wade試劑(如上文描述)滴到每個玉米粒的切割表面上。幾分鐘后由于角質鱗片中的肌醇六磷酸結合Wade試劑中的鐵，顏色消失。觀察相對其它組粉紅色消失較慢的組(約總數(shù)的5％)。這些較慢的組用此處描述的定量方法重新分析。
肌醇六磷酸如下進行定量。單個玉米粒(每組7-10個)用Carverhand-pump press的鋼板擠碎(鋼板的孔與甘氨酸紙對齊并以1000lbs.的壓力擠壓時效果最好)并置于1.5ml小微量離心管中。加入1ml鹽酸并過夜。第二天顛倒混勻混合物并靜置5分鐘。在微量離心管中加入15微升上清和100微升緩沖液A(如這里所描述)并混合。低肌醇六磷酸突變體由于種子中很高的磷含量變得很藍。通常隨后重新測試突變體。通過在3784ml水中加入216ml 12.1 N HCl制備0.65N HCl抽提溶液。試劑A當天新鮮配制并包含2份(體積)去離子水、1份(體積)維生素C溶液、1份(體積)鉬酸銨溶液和1份H2SO4(體積)。鉬酸銨溶液通過將25克(NH4)MO7O24×4H2O溶于1升水而配制。H2SO4溶液通過將167ml 36 N硫酸加入833ml水配制。維生素C溶液通過加入100克L-維生素C用水定容至1L配制。維生素C溶液冰凍保存在7星期內穩(wěn)定，但未冰凍時只在約兩小時內穩(wěn)定。
肌醇六磷酸標準用本領域中已知的方法制備。
玉米粒(M2)自由磷酸根的肉眼篩選如下。篩選玉米粒，記錄表型并置于多孔碾碎板中。用水壓將多孔碾碎板中的玉米粒碾碎。碾碎的玉米被轉移到1.5ml的微量離心管中。加入0.5ml試劑A。反應2小時后加入0.5ml試劑B。蓋上管子并顛倒混合。1小時后根據(jù)目測的藍色程度評測反應，如果有必要可使用光盒(light box)，選出藍色最深的樣品作為磷酸根含量最高的樣品。經常選出每組(穗)最藍的樣品并比較以進行最終的選擇。此實驗的試劑A是由50ml DMSO和50ml試劑B配制成的。試劑B當天新鮮配制，由60ml蒸餾水30ml10％維生素C溶液(10克維生素C加水至總體積100ml；維生素C溶液凍存并穩(wěn)定1星期)30ml 3.5％鉬酸銨溶液(2.5克(NH4)6MO7×4H2O加水至總體積100ml)30ml 6N硫酸溶液(170ml水加25ml濃硫酸，用水定容至200ml)配制而成。
肌醇六磷酸(紅色實驗)如下進行定量測試。在Carver hand-pump press的碾碎鋼板中將12個成熟的種子碾碎。當鋼板的孔與稱量紙對齊時效果最好。用5000至10000lbs.的壓力將玉米粒碾碎并轉移到Eppendorf管中。往同一管中加入1ml 0.65N HCl，靜置過夜并在第二天顛倒混合。測試時在微量滴定板的每個孔中加入200微升的Wade-A試劑(下文描述)和10微升上一步得到的玉米/HCl汁液抽提物。記錄任何顏色變化并且保持紅色的樣品被記錄為低肌醇六磷酸，因為肌醇六磷酸結合鐵并使溶液變成無色。可通過分光光度計在490nm測量進行定量。此處的Wade-A試劑是通過將25.4克5-磺基水楊酸和350毫克FeCl3·6H2O加入1.5升蒸餾水而制備的。NaOH調pH值至3.05并定容至2L。此溶液在凍存時約穩(wěn)定1個月。0.65NHCl是通過將216ml HCl(12.1N)加入到3784ml d.H2O中制備的。此實驗能選擇含所需等位基因的所需玉米植物。根據(jù)本發(fā)明的實施例和步驟的進一步細節(jié)見1998年7月7日申請的共同未決PCT申請?zhí)?未指定)，題為“Animal Feed with Low Phytic Acid，Oil Burdenedand Protein Laden Grain”。上述專利是基于1997年7月7日申請的美國臨時申請?zhí)?0/051,854和60/051,855。這些專利申請的全部內容以參考的形式在本文中引用。檢測磷的其它方法是已知的且可用于選擇植物。
擴增含所需肌醇六磷酸水平的種子。本發(fā)明中進行了此過程并選出了一系列帶有低肌醇六磷酸突變的近親交配系。這包括幾種具有良好綜合特性的低肌醇六磷酸近親交配系，它們雜交形成產生根據(jù)本發(fā)明的谷粒的雜交品種。因此根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的近親交配系是從硬桿、Lancaster和其它通用雜交樣式得到的，以使通過適當?shù)碾s交樣式雜交得到的近親交配系形成優(yōu)良的雜交材料。本發(fā)明開發(fā)的許多突變體盡管肌醇六磷酸含量低，但是與U.S Patent No.5,689,054中分別描述為lpa1-1和lpa2-1的lpa1-R和lpa2-R突變體不是相同的突變體。另外通過常規(guī)種子發(fā)育實驗篩選了這些種子的發(fā)芽性。發(fā)現(xiàn)一些低肌醇六磷酸突變體不能發(fā)芽而另一些正常發(fā)芽。只保留了具有良好的發(fā)芽特性的種子。
圖6示明了從3系用于篩選肌醇六磷酸含量的近親交配系得到的數(shù)據(jù)。通過頻率分布曲線作圖清楚地表明一些樣品的肌醇六磷酸含量很低(低于0.5單位(重量百分比))但是大多數(shù)樣品肌醇六磷酸含量較高。名為UO95的品系由于其較高的平均蛋白和油水平而被選作起始材料。這種種系產生的種子富含蛋白和油并正常發(fā)芽。UO95py保留了這些特性并且具有如上文所描述的低肌醇六磷酸水平。當與某些其它近親交配系雜交時得到的雜交品種產生富含蛋白和油并且肌醇六磷酸水平低的玉米粒。
下表表示根據(jù)本發(fā)明的突變體玉米與野生型種子肌醇六磷酸含量(mg/g種子)的比較。
下邊示明根據(jù)本發(fā)明的近親交配系的一個例子。
蛋白和油含量的測量是通過用Dickey-John Reflectance Near InfraRed Spectrometer進行NIR分析。
如人們通常所做的那樣，通過在配料和烘烤或加工中替代使用本發(fā)明的谷粒，本發(fā)明的谷粒也可用作制造玉米粉圓餅、玉米粉、和脆玉米片的面粉或玉米粒的替代來源。
通過代替使用根據(jù)本發(fā)明的谷粒，本發(fā)明的谷粒也可在玉米濕磨工業(yè)(corn wet milling industry)中用作替代原料以提高碾磨效率和可回收的淀粉含量。作為碾磨過程的副產品的動物飼料的肌醇六磷酸含量也顯著降低。例4選擇低肌醇六磷酸的方法在上文已經有所描述。圖7示明從分離出低肌醇六磷酸含量(高無機磷)性狀的低肌醇六磷酸突變體得到的數(shù)據(jù)。孟德爾性狀分離的證據(jù)是很明顯的。例5通過低肌醇六磷酸突變體與含突變因素(轉座子標記)的種群雜交可能鑒定出稀有的突變因子標記基因。首先純合的低肌醇六磷酸植物與轉座子標記種群雜交。然后利用生化分析篩選產生的低肌醇六磷酸含量種子(此例中篩選的是磷酸根含量)。用這種方法可能鑒定轉座子標記的肌醇六磷酸基因，確定產生低肌醇六磷酸突變的基因。生化篩選的結果在圖7中列出。這里列出的是用于無機磷含量分析的轉座子標記材料種子的頻率分布數(shù)據(jù)。
發(fā)芽實驗顯示一些低肌醇六磷酸突變體具有可接受的發(fā)芽而另一些不發(fā)芽。普通技術人員使用此處描述的方法可得到類似的結果。
從這些優(yōu)選的低肌醇六磷酸鹽、不發(fā)芽材料可用已知的方法克隆測序和操作在本發(fā)明中有用的肌醇六磷酸突變體。
此處提及的參考文獻的全文引入本申請以作參考。
序列表<110>KEELING，PETER L.
Guan，HanpingChang，Ming-TangWilhelm，Edward P.<120>用誘導型肌醇六磷酸基因控制發(fā)芽<130>2461-16<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1665<212>DNA<213>合成序列<400>1agcctccttc ctcctctcac tctcgctcgc gctgcctcgc tacctcgctt cgcattccat 60tcgaaaagag gggaggaaag gcaagatgtt catcgagagc ttccgcgtcg agagccccca 120cgtgcggtac ggcccgatgg agatcgagtc ggagtaccgg tacgacacga cggagctggt 180acacgagggc aaggacggcg cctcacgctg ggtcgtccgc cccaagtccg tcaagtacaa 240cttccggacc agaaccgccg tccccaagct cggggtgatg cttgtggggt ggggaggcaa 300caacgggtcc acgctgacgg ctggggtcat tgccaacagg gaggggatct catgggcgac 360caaggacaag gtgcagcaag ccaactacta cggctccctc acccaggcct ccaccatcag 420agtcggcagc tacaacgggg aggagatcta tgcgccgttc aagagcctcc ttcccatggt 480gaacccagac gacattgtgt tcggaggctg ggacattagc aacatgaacc tggccgactc 540catgaccagg gccaaggtgc tggatattga cctgcagaag cagctcaggc cctacatgga 600gtccatggtg ccacttcccg gtatctatga tccggacttc atcgcggcta accagggctc 660tcgcgccaac agtgtcatca agggcaccaa gaaagaacag gtggagcaga tcatcaagga 720tatcagggag tttaaggaga agaacaaagt ggacaagata gttgtgttgt ggactgcaaa 780cactgaaagg tatagcaatg tgtgcgctgg tctcaacgac acgatggaga atctactggc 840atctgtggac aagaacgagg cggaggtatc accatcaaca ctatatgcca ttgcctgtgt 900catggagggg gtgccgttca tcaatgggag cccccagaac acctttgtgc ctgggctgat 960tgatcttgct ataaaaaaca actgcttgat tggtggtgac gacttcaaga gtggacagac 1020caagatgaaa tctgtcttgg tcgatttcct tgttggtgct ggaataaagc ccacctcaat 1080cgtgagctac aaccacttgg gaaacaacga tggcatgaac ctgtctgccc ctcaagcatt 1140caggtccaag gagatctcca agagcaacgt ggtggatgac atggtctcga gcaatgccat 1200cctctatgag cccggcgagc atcccgatca tgtcgttgtc atcaagtatg tgccgtacgt 1260gggagacagc aagagggcta tggacgagta cacctcagag atcttcatgg gcggcaagaa 1320caccatcgtg ctgcacaaca cctgtgagga ctcgctcctc gccgcaccta tcatccttga 1380tctggtgctc ttggctgagc tcagcaccag gatccagctg aaagctgagg gagaggacaa 1440attccactcc ttccacccgg tggccaccat cctgagctac ctcaccaagg cacccctggt 1500tccccctggc acaccggtgg tgaacgctct ggccaagcag agggcgatgc tggagaacat 1560catgagggcc tgcgttgggc tggccccaga gaacaacatg atcctggagt acaagtgagc 1620caagtggcgt gccctgcagc gcgaggttag ctgctggaag ggaac 1665<210>2<211>510<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的描述CCDNA<400>2Met Phe Ile Glu Ser Phe Arg Val Glu Ser Pro His Val Arg Tyr Gly1 5 10 15Pro Met Glu Ile Glu Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Val20 25 30His Glu Gly Lys Asp Gly Ala Ser Arg Trp Val Val Arg Pro Lys Ser35 40 45Val Lys Tyr Asn Phe Arg Thr Arg Thr Ala Val Pro Lys Leu Gly Val50 55 60Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Ala Gly65 70 75 80Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Val85 90 95Gln Gln Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Thr Ile Arg100 105 110Val Gly Ser Tyr Asn Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu115 120 125Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile130 135 140Ser Asn Met Asn Leu Ala Asp Ser Met Thr Arg Ala Lys Val Leu Asp145 150 155 160Ile Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Val Pro165 170 175Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Gly Ser180 185 190Arg Ala Asn Ser Val Ile Lys Gly Thr Lys Lys Glu Gln Val Glu Gln195 200 205Ile Ile Lys Asp Ile Arg Glu Phe Lys Glu Lys Asn Lys Val Asp Lys210 215 220Ile Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Val Cys225 230 235 240Ala Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ser Val Asp Lys245 250 255Asn Glu Ala Glu Val Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Ile Ala Cys Val260 265 270Met Glu Gly Val Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val275 280 285Pro Gly Leu Ile Asp Leu Ala Ile Lys Asn Asn Cys Leu Ile Gly Gly290 295 300Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp305 310 315 320Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn325 330 335His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Ala Phe340 345 350Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Ser355 360 365Ser Asn Ala Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val370 375 380Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp385 390 395 400Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Asn Thr Ile Val Leu405 410 415His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp420 425 430Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Gln Leu Lys Ala Glu435 440 445Gly Glu Asp Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser450 455 460Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn465 470 475 480Ala Leu Ala Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Met Arg Ala Cys485 490 495Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys500 505 510
權利要求
1.一種轉基因植物，其含有包含編碼調節(jié)所述植物產生肌醇六磷酸的所選擇基因產物的異源核酸序列的遺傳構建體。
2.根據(jù)權利要求1的轉基因植物，其中所述的核酸序列與由激活劑誘導的啟動子可操作地連接。
3.根據(jù)權利要求1的轉基因植物，其中所述的植物還含有導致該植物形成低肌醇六磷酸水平的突變等位基因。
4.根據(jù)權利要求1的轉基因植物，其中所述的植物還含有野生型肌醇六磷酸鹽基因，它導致該植物形成充分的肌醇六磷酸水平使該植物在沒有上述構建體時產生可發(fā)芽的子代種子。
5.根據(jù)權利要求3的轉基因植物，其中所述的啟動子是活躍的，直至激活劑施用到上述植物，并且所述的核酸序列以有義取向連接。
6.根據(jù)權利要求3的轉基因植物，其中所述的啟動子是不活躍的，直至激活劑施用到上述植物，并且所述的核酸序列以有義取向連接。
7.根據(jù)權利要求4的轉基因植物，其中所述的啟動子是不活躍的，直至激活劑施用到上述植物，并且所述的核酸序列以反義取向連接。
8.根據(jù)權利要求4的轉基因植物，其中所述的啟動子是活躍的，直至激活劑施用到上述植物，并且所述的核酸序列以反義取向連接。
9.根據(jù)權利要求3的轉基因植物，其中的核酸序列編碼肌醇六磷酸突變基因的產品，可從選自下列一組的玉米突變植物得到，該組植物包括UO95py、lpa1-1(ATCC保藏號97678)、lpa2-1(ATCC保藏號97679)，以及它們的等位、截短、替代和缺失變體。
10.根據(jù)權利要求9的轉基因植物，其中所述的基因產物可由mu轉座子標記的方法得到。
11.根據(jù)權利要求4的轉基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因可由mu轉座子標記含肌醇六磷酸植物的方法得到。
12.根據(jù)權利要求4的轉基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因為編碼SEQ ID NO2的核酸序列。
13.根據(jù)權利要求4的轉基因植物，其中所述的野生型肌醇六磷酸基因是SEQ ID NO1。
14.根據(jù)權利要求1的轉基因植物，其中所述的植物選自由玉米、大豆、水稻、燕麥、向日葵、小麥、大麥、黑麥和飼料草組成的一組植物。
15.根據(jù)權利要求2的轉基因植物，其中所述的激活劑是選自下列一組化合物，該組化合物包括2-氯-N-(甲基氨基羰基)苯磺酰胺、1-(正-丁基)-3-甲基磺酰脲、甲基2-〔(氨基羰基)氨基磺酰基〕苯甲酸酯、N-異丙基氨基甲酰苯磺酰胺、N-(氨基羰基)-2-氯苯磺酰胺和N’-〔2-(正-丁基氨基羰基)〕-6-氯-N，N-二甲基-1，2-苯二磺酰胺。
16.能轉化植物的重組遺傳構建體，包括一編碼調節(jié)肌醇六磷酸產生的基因產物并且3’與核酸啟動子序列可操作連接的核酸序列。
17.根據(jù)權利要求16的重組遺傳構建體，其中所述的核酸啟動子序列在圖5中示明。
18.根據(jù)權利要求16的重組遺傳構建體，其中所述的核酸啟動子序列可通過施用N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺誘導。
19.根據(jù)權利要求16的重組遺傳構建體，其中所述的核酸啟動子序列可由選自下列一組的化合物誘導，該組化合物包括N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺、苯基-2-氯-4-(三氟甲基)-5-噻唑-羧基酯、萘-1，8二羧基酐、2-二氯甲基-2-甲基-1，3-二氧戊環(huán)。
20.產生種子的一種方法包括以下步驟種植含可由激活劑活化、可外部誘導的重組DNA載體的成熟種子，所述重組DNA載體含至少一段編碼所選基因產物的核酸序列，上述所選基因產物導致致死的低量肌醇六磷酸；對從上述成熟種子產生的植物施用激活劑從而該核酸序列被誘導產生上述所選的基因產物。在施用激活劑后收獲從上述植物產生的子代種子。
21.產生種子的一種方法，包括以下步驟種植含可由激活劑去活化、可外部誘導的重組DNA載體的成熟種子，上述重組DNA載體含至少一段編碼所選基因產物的核酸序列，上述所選基因產物導致致死的低量肌醇六磷酸；對從上述成熟種子產生的植物施用激活劑從而該核酸序列被誘導停止編碼上述所選的基因產物。在施用激活劑后收獲從上述植物產生的子代種子。
22.從根據(jù)權利要求5的轉基因植物得到的子代種子。
23.從根據(jù)權利要求6的轉基因植物得到的子代種子。
24.從根據(jù)權利要求7的轉基因植物得到的子代種子。
25.從根據(jù)權利要求8的轉基因植物得到的子代種子。
26.根據(jù)權利要求1的植物，它是雙子葉植物。
27.根據(jù)權利要求1的植物，它是單子葉植物。
28.根據(jù)權利要求1的植物，它是禾本科(Gramineae)植物。
29.至少一個親本為根據(jù)權利要求1的植物的雜交植物。
30.由根據(jù)權利要求1的植物產生的子代種子。
31.從根據(jù)權利要求1的植物產生的不發(fā)芽谷粒。
32.分離純化的編碼肌醇六磷酸的核酸序列，它由以下方法產生，包括將低肌醇六磷酸純合突變體植物與含增變基因的植物種群雜交；鑒定低肌醇六磷酸含量的增變基因標記的子代種子；從上述子代種子克隆和分離所述的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有肌醇六磷酸基因的植物,該基因只有需要時才在上述植物的種子中表達。本發(fā)明具有兩個能被誘導或開關的特性。這兩個特性是:(i)不能發(fā)芽的種子,(ii)低肌醇六磷酸或不產生肌醇六磷酸。
文檔編號A23B4/12GK1275049SQ9881008
公開日2000年11月29日 申請日期1998年8月11日 優(yōu)先權日1997年8月11日
發(fā)明者P·L·克林, M·-T·常, H·關, E·P·威廉 申請人:埃克斯希德遺傳有限公司