專利名稱：：低pH乳酸發(fā)酵的制作方法長(zhǎng)期以來，乳酸及其鹽類在化學(xué)、化妝品、食品和醫(yī)藥工業(yè)中被廣泛地應(yīng)用。最近，基于乳酸或乳酸鹽的新的生物工程材料，例如可生物降解的丙交酯聚合物，已經(jīng)使得對(duì)乳酸或乳酸鹽、尤其是對(duì)L-或D-乳酸或乳酸鹽的游離酸形式的需求增加了。在生產(chǎn)各種工業(yè)聚合物時(shí)使用乳酸已經(jīng)被描述于美國(guó)專利中，例如5,142,023；5,247,058；5,258,488；5,357,035；5,338,822；5,446,123；5,539,081；5,525,706；5,475,080；5,359,026；5,484,881；5,585,191；5,536,807；5,247,059；5,274,073；5,510,526；以及5,594,059。(上述十七個(gè)專利的完整公開內(nèi)容被并入本文作參考，這些專利的擁有者是本申請(qǐng)的受讓人，明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的Cargill股份有限公司。)盡管化學(xué)方法可以用來生產(chǎn)乳酸，但石化原料日益上漲的費(fèi)用以及解析由傳統(tǒng)化學(xué)方法生產(chǎn)的外消旋乳酸或乳酸鹽混合物的需求，使發(fā)酵法成為一種有吸引力的可選方法來生產(chǎn)富含乳酸或乳酸鹽的一種旋光異構(gòu)體的乳酸或乳酸鹽。用于生產(chǎn)可生物降解的丙交酯聚合物的方法通常需要L-或D-乳酸或乳酸鹽的游離酸形式作為起始原料。不幸的是，對(duì)于大多數(shù)有機(jī)酸發(fā)酵來說，由有機(jī)酸(在本例中是乳酸)引起的終產(chǎn)物抑制會(huì)成為有效發(fā)酵的一個(gè)主要障礙。除乳酸或乳酸鹽濃度外，通常用于乳酸或乳酸鹽發(fā)酵的細(xì)菌菌株還會(huì)受到低pH的抑制。為了克服這一問題，工業(yè)乳酸或乳酸鹽發(fā)酵過程通常在較高的pH下操作，例如至少大約5.0，通常等于或高于約6.0。這導(dǎo)致所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)品基本上都以一種鹽的形式存在。通常需要附加的處理步驟以除去陽(yáng)離子性的平衡離子并分離出所需要的游離乳酸。另外，由于高濃度的某些鹽類-例如鈉陽(yáng)離子-會(huì)對(duì)發(fā)酵有抑制作用，所以所存在的鹽的種類和/或數(shù)量也能夠?qū)Πl(fā)酵的效率產(chǎn)生影響。使用食淀粉乳桿菌(lactobacillusamylovorus)，由酶解稀釋的玉米淀粉生產(chǎn)外消旋乳酸或乳酸鹽已經(jīng)被報(bào)道過。盡管在pH低至4.2時(shí)較高的生產(chǎn)水平已經(jīng)被報(bào)道過，但該發(fā)酵沒有提供富含任何一種旋光異構(gòu)體的乳酸或乳酸鹽。用于改進(jìn)乳酸或乳酸鹽發(fā)酵效率的許多方法已經(jīng)被報(bào)道過。這些方法中的數(shù)種都涉及在連續(xù)的基礎(chǔ)上將游離乳酸從發(fā)酵液中除去。例如，電滲析已經(jīng)被用于通過將乳酸或乳酸鹽從發(fā)酵液中除去來減少終產(chǎn)物抑制。高的滲析膜費(fèi)用以及低的乳酸或乳酸鹽梯度從總體上降低了這種方法的吸引力。離子交換以及使用聚乙烯基吡啶(polyvinylpyridine)從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去乳酸或乳酸鹽也曾經(jīng)被報(bào)道過。而最近所描述的另一種方法涉及一個(gè)多級(jí)的萃取過程。該方法涉及用一種叔胺從發(fā)酵液中萃取乳酸或乳酸鹽，目的是防止發(fā)酵液的pH值降低至抑制進(jìn)一步乳酸或乳酸鹽發(fā)酵的程度。但是，所報(bào)道的通過這種方法獲得的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)水平仍然相當(dāng)?shù)汀Ｊ褂眠@種方法還可能需要使萃取后的發(fā)酵液再經(jīng)歷一次二級(jí)萃取，從而在將萃取后的發(fā)酵液循環(huán)回發(fā)酵反應(yīng)中之前，至少減少萃取劑叔胺的殘余濃度。所有這些基于乳桿菌的發(fā)酵來生產(chǎn)游離酸形式的乳酸的方法都有一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)?；谄渌苣退岬奈⑸锇l(fā)酵的可選方法也已被報(bào)道過。與乳桿菌相比，酵母-例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)-能夠在低得多的pH下生長(zhǎng)。已經(jīng)通過將來自細(xì)菌(乳桿菌)或哺乳動(dòng)物(牛)來源的乳酸或乳酸鹽脫氫酶基因?qū)脶劸平湍傅姆椒óa(chǎn)生了重組酵母菌株。據(jù)報(bào)道，重組酵母菌株能夠在等于或低于乳酸的pKa(大約3.8)下生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。然而，乙醇是這些重組酵母菌株生產(chǎn)的主要發(fā)酵產(chǎn)品。這既降低了乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的效率也導(dǎo)致了另外的潛在問題，即分離和純化游離乳酸的問題。通過一種小球狀的真菌米根霉(Rhizopusorgyzae)生產(chǎn)乳酸也曾經(jīng)被報(bào)道過。這種真菌發(fā)酵通常還產(chǎn)生甘油和/或乙醇作為主要副產(chǎn)物。在這種情況下，通過使用一個(gè)聚乙烯吡啶(“PVP”)柱將游離乳酸從發(fā)酵液中連續(xù)除去，游離乳酸的產(chǎn)量得到了優(yōu)化。使用根霉/PVP方法，在低的發(fā)酵pH下，還沒有所產(chǎn)生的乳酸或乳酸鹽濃度高于大約25g/L的報(bào)道。本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。它特別涉及使用耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物-例如耐酸的細(xì)菌-來生產(chǎn)具有高濃度游離乳酸的發(fā)酵液。高濃度游離乳酸的存在能夠簡(jiǎn)化下游加工過程，需要該過程將乳酸或乳酸鹽以游離酸的形式從發(fā)酵液中分離出來。通常已經(jīng)確定，使用使發(fā)酵液(或其它乳酸/乳酸鹽混合物)處于大約4.8或更低(優(yōu)選4.5或更低，最優(yōu)選4.3或更低，通常3.5至4.2)pH的方法，就能開發(fā)一個(gè)總體上有效的方法，其中所產(chǎn)生的乳酸可用于聚合物生產(chǎn)，而且如果需要的話，回收的乳酸鹽可以被循環(huán)回發(fā)酵系統(tǒng)作為一種緩沖劑，或被有差別地處理以控制pH。本文所提供的用于生產(chǎn)乳酸的方法包括，在使大部分的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)品處于游離酸形態(tài)的pH下、在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物，例如耐酸的純?nèi)樗崛闂U菌(homolacticlactobacillus)。在這里，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“耐酸的”被用于與細(xì)菌相聯(lián)系時(shí)，其目的是指該細(xì)菌能夠在足以使大部分乳酸或乳酸鹽產(chǎn)品處于游離酸形態(tài)的pH下生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。耐酸的細(xì)菌通常能夠生產(chǎn)至少大約25g/L的游離乳酸。在不高于大約4.2的“平均培養(yǎng)pH”下，這種細(xì)菌一般還可以在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)至少大約50g/L的乳酸或乳酸鹽(即50g/L的總?cè)樗?。如果發(fā)酵沒有進(jìn)行到限制性乳酸或乳酸鹽濃度被達(dá)到的程度，“平均培養(yǎng)pH”的確定是基于在發(fā)酵過程中的十個(gè)(10)或更多個(gè)相等時(shí)間間隔處所測(cè)定的pH值的平均值。本發(fā)酵方法可以以一種連續(xù)的方式操作。在這種情況下，當(dāng)一個(gè)初始的啟動(dòng)階段結(jié)束后，通常能夠達(dá)到穩(wěn)態(tài)條件(在pH、乳酸或乳酸鹽濃度和營(yíng)養(yǎng)物濃度方面)并保持下去。當(dāng)發(fā)酵以這種方式進(jìn)行時(shí)，平均培養(yǎng)pH就是初始啟動(dòng)階段完成后發(fā)酵液的平均pH，也就是說，在確定平均培養(yǎng)pH時(shí)忽略啟動(dòng)階段的pH。如果發(fā)酵進(jìn)行到pH和/或乳酸濃度抑制進(jìn)一步乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的程度，“平均培養(yǎng)pH”的確定是基于在產(chǎn)生90％的限制性乳酸或乳酸鹽濃度所必需的時(shí)間段內(nèi)的十個(gè)(10)或更多個(gè)相等時(shí)間間隔處所測(cè)定的pH值的平均值。此處所使用的“限制性乳酸或乳酸鹽濃度”是在一套給定的培養(yǎng)條件(營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、溫度、通氣程度)下的乳酸或乳酸鹽濃度，在該條件下，發(fā)酵所產(chǎn)生的pH和/或乳酸濃度抑制進(jìn)一步的乳酸或乳酸鹽發(fā)酵。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“限制性培養(yǎng)pH”是指在一套給定的培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液的pH，在該條件下，pH和/或乳酸濃度抑制進(jìn)一步的乳酸或乳酸鹽發(fā)酵。在相同的條件下，當(dāng)進(jìn)一步培養(yǎng)的時(shí)間達(dá)到大約十二(12)小時(shí)后所產(chǎn)生的乳酸或乳酸鹽量的增加不高于大約3％時(shí)，就認(rèn)為乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)已經(jīng)被抑制。該定義假設(shè)在發(fā)酵液中仍有足夠的用于乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物。此處的術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基”和“發(fā)酵液”可以互換使用。這些術(shù)語(yǔ)既可以指(i)初始提供給耐酸的細(xì)菌作為營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基，也可以指(ii)初始提供的營(yíng)養(yǎng)物被部分或全部消耗并且細(xì)菌已經(jīng)將包括乳酸或乳酸鹽的發(fā)酵產(chǎn)物分泌到了這種培養(yǎng)基中后所產(chǎn)生的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的方法中，在培養(yǎng)耐酸細(xì)菌以生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽后，發(fā)酵液的pH通常不高于大約4.2(“最終培養(yǎng)pH”)。此處的“最終培養(yǎng)pH”是指耐酸細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)停止時(shí)發(fā)酵液的pH。生長(zhǎng)和/或乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)停止的原因，可以是反應(yīng)溫度的改變、發(fā)酵液中一種或多種必需營(yíng)養(yǎng)物的耗盡、人為改變pH、或使發(fā)酵液與細(xì)菌細(xì)胞分離。在通過向發(fā)酵液中添加足夠的酸或堿來終止發(fā)酵以停止乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的情況下，最終培養(yǎng)pH被定義為就在添加之前的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的pH。另外，生長(zhǎng)和/或乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)停止的原因可以是一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物的積累和/或由于發(fā)酵產(chǎn)物的積累而導(dǎo)致的培養(yǎng)液pH的改變，也就是說，在給定的一套培養(yǎng)條件下發(fā)酵反應(yīng)達(dá)到了一種自我限制的程度。如上所述，生產(chǎn)有機(jī)酸-例如乳酸-的細(xì)菌發(fā)酵受到終產(chǎn)物抑制是相當(dāng)普遍的。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“乳酸或乳酸鹽”是指2-羥基丙酸的游離酸或鹽形態(tài)(即“總?cè)樗帷?。術(shù)語(yǔ)“乳酸”和“游離乳酸”可互換使用，在此處它們是指酸的形式，即2-羥基丙酸。乳酸的鹽形態(tài)在此處特指一種乳酸鹽，例如乳酸的鈉鹽或乳酸鈉。本發(fā)明還提供耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌(homolacticbacteria)。在至少大約40℃的培養(yǎng)溫度下，耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌通常能夠生產(chǎn)至少大約25g/L的游離乳酸。在高于大約40℃的溫度和不高于大約4.2的平均培養(yǎng)pH下，本耐酸細(xì)菌的另外一個(gè)實(shí)例能夠生產(chǎn)至少大約50g/L的乳酸或乳酸鹽。通常，耐酸細(xì)菌對(duì)上述兩種乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)力的量度標(biāo)準(zhǔn)都能滿足。圖1是一個(gè)發(fā)酵流程的示意圖，其中包括耦合的游離乳酸除去過程。圖2是一個(gè)曲線圖，它顯示從玉米浸漬液中分離出的一些乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)細(xì)菌菌株的核糖型模式。圖3是一個(gè)曲線圖，它顯示在含有10vol.％玉米漿、100g/L葡萄糖和33.4g/L碳酸鈣的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌株#41時(shí)的葡萄糖、果糖和乳酸或乳酸鹽的發(fā)酵側(cè)形。圖4是一個(gè)曲線圖，它顯示在含有90g/L葡萄糖、33.4g/L碳酸鈣以及12vol.％玉米漿或36vol.％稀浸漬液(lightsteepwater)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌株#41時(shí)的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量。圖5是一個(gè)曲線圖，它顯示在含有90g/L葡萄糖、36.6g/L碳酸鈣以及不同量的玉米浸漬液的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)純?nèi)樗峄蛉樗猁}菌株#41時(shí)的葡萄糖、果糖和乳酸或乳酸鹽的發(fā)酵側(cè)形。圖6是一個(gè)曲線圖，它顯示與pH相對(duì)應(yīng)的未離解的乳酸(“游離乳酸”)的百分比。通過細(xì)菌學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生具有大約5.0或更低、優(yōu)選4.8或更低以及一般3.5至4.5的pH的乳酸溶液，會(huì)導(dǎo)致在乳酸或乳酸鹽物質(zhì)的生產(chǎn)中乳酸形態(tài)有更高的百分比。通過發(fā)酵過程產(chǎn)生具有乳酸形態(tài)-而不是乳酸鹽-的相對(duì)大量的產(chǎn)品是有利的，因?yàn)樗軌驕p少-或在一定程度上減少-對(duì)后續(xù)的酸化和/或“鹽分裂”步驟的需求。也就是說，如果大量的物質(zhì)以游離乳酸的形態(tài)產(chǎn)生，那么由乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)乳酸的處理步驟、費(fèi)用以及與其相關(guān)的后續(xù)步驟都可以被減少或避免。即使進(jìn)行一定程度的酸化，與高pH系統(tǒng)相比，此時(shí)酸的添加量將相當(dāng)少。通常已經(jīng)確定，使用使發(fā)酵液處于大約4.8或更低(優(yōu)選4.5或更低，最優(yōu)選4.3或更低，通常3.5至4.2)pH的方法，就能開發(fā)一種總體上有效的方法，在該方法中所產(chǎn)生的乳酸可用于聚合物生產(chǎn)，而且回收的乳酸鹽可以被循環(huán)回發(fā)酵系統(tǒng)作為一種緩沖劑，或被有差別地處理以用于控制pH。通過在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，本方法能夠有效地生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽，尤其是有效地生產(chǎn)高濃度的游離乳酸。耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌可以從來自商用玉米研磨設(shè)備的玉米浸漬液中分離。盡管這種類型的不同細(xì)菌可以生產(chǎn)外消旋乳酸或乳酸鹽，或者主要是D-或L-異構(gòu)體形式的乳酸或乳酸鹽，本方法優(yōu)選使用主要生產(chǎn)L-或D-乳酸或乳酸鹽的純?nèi)樗峒?xì)菌，最優(yōu)選使用生產(chǎn)光學(xué)純形式的L-乳酸或乳酸鹽的純?nèi)樗峒?xì)菌。本方法能夠有效地生產(chǎn)高濃度的游離酸形態(tài)的乳酸的一種旋光異構(gòu)體。該有效性可以以各種方式表達(dá)。發(fā)酵液中的游離乳酸濃度可作為本方法的總體生產(chǎn)能力的一個(gè)量度。本方法通常產(chǎn)生一種溶液，其中含有至少大約25g/L、優(yōu)選至少大約30g/L、更優(yōu)選至少大約40g/L的游離乳酸。最優(yōu)選地，本方法生產(chǎn)具有上述濃度的游離L-乳酸或游離D-乳酸。所生產(chǎn)的乳酸鹽(以及游離乳酸)的光學(xué)純度優(yōu)選為至少大約50％，更優(yōu)選為至少大約80％，最優(yōu)選所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽的旋光異構(gòu)體基本上處于純態(tài)。如上所述，通過本方法所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽通常主要處于L-乳酸或乳酸鹽的形態(tài)。例如，本方法的一個(gè)實(shí)施方案包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌以生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽，該乳酸或乳酸鹽中含有至少大約75wt.％的L-乳酸或乳酸鹽(即具有至少大約50％光學(xué)純度的L-乳酸或乳酸鹽)。優(yōu)選地，本方法所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽的光學(xué)純度至少為大約80％，更優(yōu)選為至少大約90％(例如，含有至少大約95wt.％的L-乳酸或乳酸鹽)。最優(yōu)選地，本方法生產(chǎn)基本上處于光學(xué)純態(tài)(即所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽含有99wt.％或更高的單一旋光異構(gòu)體)的L-或D-乳酸或乳酸鹽。如果發(fā)酵液的pH值在3.0和4.5之間，將有相當(dāng)大量的乳酸以未解離的狀態(tài)存在(參見圖6)。實(shí)際上，在pH3.0下，游離乳酸(未解離的)與乳酸根離子的摩爾比在25℃下是大約7.0；而且，在pH大約為4.5時(shí)，該比值在25℃下是大約0.23。存在于溶液中的游離乳酸的總量是溶液pH和混合物中乳酸或乳酸鹽總體濃度二者的函數(shù)。因此，詳細(xì)說明某一給定溶液-例如發(fā)酵液-的這兩個(gè)參數(shù)將有效地確定游離乳酸的濃度。本方法能夠在較低的pH下生產(chǎn)一種溶液，其中含有至少大約50g/L、優(yōu)選至少大約80g/L、更優(yōu)選至少大約100g/L的乳酸或乳酸鹽。溶液的pH越低，以游離酸形態(tài)存在的乳酸或乳酸鹽的百分比就越高。例如，在培養(yǎng)基的pH等于乳酸的pKa(大約3.8)時(shí)，50％的乳酸或乳酸鹽以游離酸的形態(tài)存在。在pH4.2下，大約31％的乳酸或乳酸鹽是游離酸，而在pH4.0和3.9下，分別有大約41％和47％的乳酸或乳酸鹽以游離酸形態(tài)存在。在更高的pH下，游離乳酸的比率更低，pH4.5時(shí)是18％，pH5.0時(shí)是6.6％。在培養(yǎng)步驟中，發(fā)酵液的pH可以用許多不同的方式表達(dá)，例如用平均培養(yǎng)pH或最終培養(yǎng)pH表達(dá)。本發(fā)酵方法通常能夠在不高于大約4.3、優(yōu)選不高于大約4.2、以及更優(yōu)選不高于大約4.0的平均培養(yǎng)pH下生產(chǎn)高濃度的乳酸或乳酸鹽。另外，在培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的pH可以以最終培養(yǎng)pH的方式表達(dá)。本方法通常能夠在不高于大約4.2、優(yōu)選不高于大約4.0、以及更優(yōu)選不高于大約3.9的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)高濃度的乳酸或乳酸鹽。在不高于大約4.0的平均培養(yǎng)pH和/或不高于大約3.9的最終培養(yǎng)pH下，本發(fā)酵方法的特別有效的實(shí)施方案能夠生產(chǎn)至少大約80g/L的乳酸或乳酸鹽。本發(fā)酵方法可以以一種連續(xù)的方式操作，在這種方式中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的一部分被移走。該操作可以連續(xù)地或以定期的間隔進(jìn)行。通常將充足的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加入反應(yīng)器中以維持恒定的液體體積。在這種發(fā)酵條件下，當(dāng)初始的啟動(dòng)階段結(jié)束后，通常能夠達(dá)到穩(wěn)態(tài)條件(在pH、乳酸或乳酸鹽濃度和營(yíng)養(yǎng)物濃度方面)并保持下去。當(dāng)發(fā)酵以這種方式進(jìn)行時(shí)，發(fā)酵液的平均培養(yǎng)pH(初始階段的pH被忽略)和最終培養(yǎng)pH基本相同。在這種情況下，發(fā)酵通常在不高于大約4.2、優(yōu)選不高于大約4.0、以及更優(yōu)選不高于大約3.9的pH下進(jìn)行。盡管本培養(yǎng)方法可以在較低的溫度、例如大約30℃至大約38℃下進(jìn)行，通常還是在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中在至少大約43℃、更優(yōu)選大約45℃至大約52℃的溫度下培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌。最優(yōu)選地，發(fā)酵在大約47℃至大約50℃下進(jìn)行。發(fā)酵在這些溫度下操作有許多優(yōu)點(diǎn)。在該溫度范圍內(nèi)，由其它競(jìng)爭(zhēng)性微生物的生長(zhǎng)而導(dǎo)致的復(fù)雜化的可能性被減少。另外，在更高的溫度下，反應(yīng)通常以更快的速率進(jìn)行，從而能夠有效地利用處理設(shè)備。如果發(fā)酵在過高的溫度下進(jìn)行，通常在大約54℃或更高，純?nèi)樗峒?xì)菌的生長(zhǎng)和/或乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)就可以忽略不計(jì)。然而，使用標(biāo)準(zhǔn)的選擇技術(shù)來鑒別突變的純?nèi)樗峒?xì)菌菌株是可能的，這些菌株能夠在55℃和更高的溫度下生長(zhǎng)和生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。此處所描述的“營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基”是指一種水基的組合物，其中包括本發(fā)明的細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的礦物質(zhì)和它們的鹽。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常含有有效量的碳源、氮源、磷酸鹽源、硫酸鹽源、鈣和微量元素。術(shù)語(yǔ)“微量元素”是指以痕量濃度-例如百分之1的微小部分(1000ppm或更少)-存在的生長(zhǎng)所必需的元素。本發(fā)明的細(xì)菌通常能夠利用許多碳和能量源用于生長(zhǎng)和/或乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、和/或水蘇糖。一些細(xì)菌能夠使用全部或大部分的上述糖作為碳和能量源，而其它菌株則更為苛求并且只能在上述一種或兩種糖中生長(zhǎng)。在其它情況下，淀粉(例如玉米淀粉)或其水解產(chǎn)物可被用作主要的碳水化合物來源。此處所使用的“玉米浸漬液”是指獲自玉米浸漬罐的液體，或獲自具有基本相同營(yíng)養(yǎng)譜的由其衍生的其它溶液。例如，玉米漿(有時(shí)也被稱作“濃浸漬液”)是通過除去水和其它可揮發(fā)組分得到的玉米浸漬液的濃縮形式，通常在真空下進(jìn)行。玉米漿通常具有大約35wt.％至大約50wt.％的干固體含量。在本發(fā)明實(shí)施例中所描述的實(shí)驗(yàn)中所使用的玉米漿具有36wt.％的干固體含量，在此處被稱為“CSL”。在進(jìn)行濃縮以生產(chǎn)玉米漿之前，直接從玉米浸漬罐和/或與其相連的管道得到的玉米浸漬液通常的干固體含量范圍為大約10wt.％至大約15wt.％，此處被稱作“稀浸漬液”(“LSW”)。稀浸漬液通常含有不高于大約500ppm的SO2含量。在本方法中使用的用于補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的浸漬液優(yōu)選具有不高于大約300ppm、更優(yōu)選不高于大約200ppm的SO2含量。在本發(fā)明實(shí)施例所描述的實(shí)驗(yàn)中所使用的稀浸漬液具有12wt.％的干固體含量。當(dāng)從玉米浸漬液中分離的一種或多種純?nèi)樗峋陮⒂糜谏a(chǎn)乳酸或乳酸鹽時(shí)，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常含有與至少大約15g/L浸漬液干固體相當(dāng)?shù)挠衩捉n液。優(yōu)選地，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含與至少大約25g/L浸漬液干固體、更優(yōu)選至少大約30g/L浸漬液干固體相當(dāng)?shù)挠衩捉n液。用于本發(fā)酵方法的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例是MRS培養(yǎng)基(例如可從BectonDickinson&Co.購(gòu)得的MRS培養(yǎng)基)或同類的培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基一般補(bǔ)充有玉米浸漬液以提供氮源和一般的營(yíng)養(yǎng)源，還補(bǔ)充有附加的碳水化合物(例如葡萄糖或果糖)作為碳和能量源。適于本方法使用的典型的培養(yǎng)基還包括鎂鹽、錳鹽、磷酸鹽、鉀鹽和/或檸檬酸鹽。但是，向培養(yǎng)基中加入確定量的上述鹽類可能是沒有必要的。通常，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基還包括一種非離子表面活性劑，例如脫水山梨糖醇的聚氧乙烯衍生物的脂肪酸單酯(例如吐溫80(TweenR80)是聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)。培養(yǎng)基的制備可以使用單獨(dú)的鹽作為各種無機(jī)組分中的每一種的來源。另外，用于制備營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的一種單一的鹽可以充當(dāng)多于一種組分的的來源。例如，加入的磷酸氫鉀(K2HPO4)既可以作為鉀陽(yáng)離子的來源也可以作為磷酸根陰離子的來源?？梢哉J(rèn)識(shí)到，在制備營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的過程中，各種組分被溶解在水中之后，所存在的各種溶解的鹽之間的陽(yáng)離子和陰離子將發(fā)生交換。例如，如果在制備培養(yǎng)基的過程中硫酸鎂和檸檬酸銨被加入到水中，所得到的溶液除包含硫酸鎂和檸檬酸銨外，還將包含一些硫酸銨和檸檬酸鎂。一種特別適于本發(fā)酵方法使用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基類型含有補(bǔ)充有葡萄糖和/或果糖作為附加碳和能量源的玉米浸漬液。用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例包括與大約30至大約45g/L浸漬液干固體相當(dāng)?shù)挠衩捉n液；大約80至大約120g/L的葡萄糖、果糖或它們的混合物；大約0至大約10g/L的酵母膏；大約0至大約1g/L的諸如吐溫80的非離子表面活性劑；大約0至大約2g/L的磷酸氫鉀(K2HPO4)；大約0至大約0.2g/L的硫酸鎂(MgSO4)；大約0至大約0.05g/L的硫酸錳(MnSO4)；大約0至大約2g/L的檸檬酸銨；以及可選地，大約10至大約50g/L的碳酸鈣(CaCO3)。由于上面所討論的原因，這些量是指用于形成培養(yǎng)基所加入的各種物質(zhì)的量，而不是指這些物質(zhì)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的真實(shí)濃度。在配制這種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的過程中，除了非離子表面活性劑和碳酸鈣外，所有成分通常都被溶于適量的水中并在高壓蒸汽滅菌器中滅菌。非離子表面活性劑通常被加入到經(jīng)高壓蒸汽滅菌、仍具有接近大約100℃溫度的培養(yǎng)基中。在碳酸鈣被隨后加入之前，通常使所得到的溶液冷卻至大約60℃或更低。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用于本方法的適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選含有至少大約50g/L的碳水化合物。更優(yōu)選地，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有至少大約70g/L、以及最優(yōu)選至少大約90g/L的碳水化合物。碳水化合物通常由葡萄糖、果糖、半乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖或它們的混合物組成。葡萄糖、果糖和蔗糖特別適用于在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中作為碳和能量的來源。在培養(yǎng)基中加入超過大約150g/L的碳水化合物通常是無益的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中含有一種堿可能是有益的，例如碳酸鈣(CaCO3)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化銨(NH4OH)和/或碳酸氫鈉(NaHCO3)。通常至少大約30g/L的碳酸鈣(或等當(dāng)量的其它堿)被加入到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。在本方法的一些實(shí)施方案中，例如，生產(chǎn)高濃度乳酸或乳酸鹽的實(shí)施方案中，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中含有至多大約40g/L的碳酸鈣將是優(yōu)選的。由于碳酸鈣鹽溶解度的限制以及保持較低發(fā)酵液pH的期望，盡管可以使用更高濃度的堿，但在培養(yǎng)基中加入超過大約100g/L的碳酸鈣通常是無益的。特別經(jīng)常地，所存在的碳酸鈣在開始時(shí)不會(huì)完全溶解在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，一些碳酸鈣會(huì)與正在形成的乳酸反應(yīng)以生成乳酸鈣。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，未溶解的碳酸鈣的另外部分就會(huì)被溶入溶液中?？傮w的效果是中和一部分正在形成的乳酸并防止發(fā)酵液的pH降至所希望的水平之下(例如，低于大約3.8-3.9)。為達(dá)到上述效果，并不一定要加入諸如碳酸鈣的堿?？梢约尤牒幸环N乳酸鹽(例如乳酸鈣、乳酸鈉或乳酸銨)的溶液以幫助緩沖發(fā)酵液的pH。這種情況可能發(fā)生的方法的一個(gè)實(shí)例包括，將發(fā)酵液的一部分與正在培養(yǎng)的細(xì)菌分離以及將該部分的一些或全部乳酸除去后再將該部分循環(huán)回發(fā)酵過程中。另外，乳酸鈣可以被從發(fā)酵液中分離(例如以固體形態(tài))并與加入到發(fā)酵過程中的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基相混合。通常，加入乳酸鹽作為緩沖鹽是有益的，因?yàn)樗辜尤氲桨l(fā)酵液中的中和堿的量減到最少，因而使轉(zhuǎn)化成鹽形態(tài)的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)品的量減到最少。含有至少大約70g/L葡萄糖和/或果糖以及至少大約20g/L碳酸鈣的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基特別適于在本方法中使用。根據(jù)本方法中所使用的細(xì)菌菌株，在該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入玉米浸漬液(例如以與至少大約25g/L玉米浸漬液干固體相當(dāng)?shù)牧?也可以是優(yōu)選的。特別有益的是，加入的玉米浸漬液中只含有與通過發(fā)酵過程所產(chǎn)生的乳酸或乳酸鹽的手性形式相同的乳酸或乳酸鹽。通常選擇純?nèi)樗峒?xì)菌的菌株和發(fā)酵條件，以使游離乳酸以至少大約0.5g/L/hr、優(yōu)選至少大約1.0g/L/hr、更優(yōu)選至少大約2.0g/L/hr、以及最優(yōu)選至少大約4.0g/L/hr的總速率生產(chǎn)。此處所使用的乳酸鹽或游離乳酸(或者乳酸或乳酸鹽)的總生產(chǎn)速率的計(jì)算是用所生產(chǎn)的游離乳酸(乳酸或乳酸鹽)的總量除以培養(yǎng)時(shí)間。對(duì)于產(chǎn)生限制性乳酸或乳酸鹽濃度的發(fā)酵而言，游離乳酸(乳酸或乳酸鹽)的總生產(chǎn)速率的計(jì)算以產(chǎn)生90％的限制性游離乳酸(乳酸或乳酸鹽)濃度所需要的時(shí)間為分母。本方法的生產(chǎn)能力還可以用乳酸或乳酸鹽的總生產(chǎn)速率來表示。本發(fā)酵方法通常在以至少大約1.0g/L/hr、優(yōu)選至少大約2.0g/L/hr、以及更優(yōu)選至少大約3.0g/L/hr的總速率生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽的條件下進(jìn)行。如上所述，優(yōu)選在上述速率下，在處于不高于大約4.1、更優(yōu)選不高于大約4.0的平衡培養(yǎng)pH下的發(fā)酵液中生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。用于本發(fā)酵方法的純?nèi)樗峒?xì)菌的適當(dāng)實(shí)例可以容易地從諸如來自商用玉米研磨設(shè)備的玉米浸漬液的樣品中分離出來。另外，從不同來源分離出的某些其它純?nèi)樗峒?xì)菌也可能具有所需的能力，該能力使高濃度游離乳酸的有效低pH生產(chǎn)成為可能。由于在玉米浸漬液中發(fā)現(xiàn)的純?nèi)樗峒?xì)菌通常需要含有用于生長(zhǎng)的玉米浸漬液的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，所以在用于鑒別和分離這種細(xì)菌的方法中，初始步驟通常包括將樣品涂布在含有浸漬液的培養(yǎng)基例如10vol.％的CSL-MRS瓊脂上，然后在大約45-50℃下對(duì)接種的培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。通過將細(xì)菌分離物轉(zhuǎn)入只在較低的相中含有浸漬液的雙相培養(yǎng)基中，由于雜乳酸的生產(chǎn)，細(xì)菌分離物可以被容易地探測(cè)到。然后監(jiān)測(cè)正在生長(zhǎng)的菌株在雙相試管底部氣體的產(chǎn)生。所分離的菌株可以方便地在低溫下(例如4℃或更低)貯藏或保存在浸漬液/蕃茄汁/MRS瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)備物(benchstock)。當(dāng)需要時(shí)，以這種方式從玉米浸漬液中分離的一種或多種耐酸菌株可以在乳酸發(fā)酵中作為接種物。使用這類方法，從美國(guó)的五種不同的玉米研磨設(shè)備以及位于土耳其、英格蘭和荷蘭的三種玉米研磨設(shè)備中得到的浸漬液樣品被用于檢測(cè)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物。所分離的微生物在開始時(shí)被檢定為雜乳酸(即除乳酸或乳酸鹽外還能生產(chǎn)其它的發(fā)酵產(chǎn)物)或純?nèi)樗嵘a(chǎn)者。對(duì)其中的純?nèi)樗峋甑倪M(jìn)一步檢定，特別是根據(jù)總體的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量、所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽的旋光性、以及-在很多情況下-在發(fā)酵培養(yǎng)基中沒有加入堿(CaCO3)時(shí)的最終發(fā)酵pH?？偣卜蛛x了155種細(xì)菌菌株。在所檢定的109種菌株中，98種菌株(90％)生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽作為唯一的發(fā)酵產(chǎn)物(“純?nèi)樗帷本?。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“純?nèi)樗帷笔侵敢环N基本上只產(chǎn)生乳酸作為發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)菌菌株。剩余的11種菌株(11％)除乳酸或乳酸鹽外還產(chǎn)生其它發(fā)酵產(chǎn)物(“雜乳酸”菌株)。在98種純?nèi)樗峋曛校?2種是L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)者，18種是D-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)者，58種生產(chǎn)外消旋乳酸或乳酸鹽。本純?nèi)樗峒?xì)菌通常能夠生產(chǎn)至少大約25g/L的游離乳酸。更優(yōu)選地，該細(xì)菌是能夠生產(chǎn)至少大約30g/L的游離L-乳酸的純?nèi)樗峒?xì)菌。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，純?nèi)樗峒?xì)菌在不高于大約4.3的平均培養(yǎng)pH下能夠產(chǎn)生一種溶液，該溶液含有至少大約40g/L、優(yōu)選至少大約75g/L、以及優(yōu)選至少大約90g/L的乳酸或乳酸鹽。如同其它部分所討論的，本純?nèi)樗峒?xì)菌特別有效的菌株能夠在不高于大約4.0的平均培養(yǎng)pH和/或不高于大約3.9的最終培養(yǎng)pH下以上述水平生產(chǎn)L-乳酸或乳酸鹽(或D-乳酸或乳酸鹽)。本耐酸純?nèi)樗峒?xì)菌通常能夠在大約35℃至大約53℃之間的溫度下生長(zhǎng)和產(chǎn)生乳酸。盡管已經(jīng)顯示純?nèi)樗峒?xì)菌能夠在等于或接近室溫的溫度下生長(zhǎng)，但是生長(zhǎng)的最佳溫度范圍通常從大約43℃到大約52℃，優(yōu)選為大約47℃到大約50℃。當(dāng)溫度高于大約53℃或低于大約30℃時(shí)，通常發(fā)生的情況是細(xì)菌所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽可以忽略不計(jì)。發(fā)酵過程優(yōu)選在大約47℃至大約52℃下進(jìn)行，原因是酵母和雜乳酸乳桿菌較不耐熱，而且通常在這種溫度下即使生長(zhǎng)，也不能良好地生長(zhǎng)。這樣，除了促進(jìn)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)外，耐酸純?nèi)樗峒?xì)菌在高溫下的發(fā)酵能夠減小出現(xiàn)問題的可能性，所述問題與其它生物的污染有關(guān)。本純?nèi)樗峒?xì)菌通常能夠在至少大約3.7至大約6.5的pH范圍內(nèi)、以及優(yōu)選在從大約3.8至大約5.0的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)和產(chǎn)生乳酸或乳酸鹽。盡管該細(xì)菌可以在接近中性(例如6.0-6.5)的pH下生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽，但是應(yīng)用于本方法的細(xì)菌優(yōu)選能夠在一定的pH下生產(chǎn)高濃度的乳酸或乳酸鹽，在該pH下大部分的乳酸或乳酸鹽以其游離酸的形態(tài)存在。優(yōu)選的耐酸純?nèi)樗峒?xì)菌種類能夠在4.2或更低的pH下有效地生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽(例如，至少約50g/L)。在本發(fā)明中可以使用各種反應(yīng)器形式，包括填充床反應(yīng)器、連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式生物接觸反應(yīng)器、順序間歇式反應(yīng)器以及流化床反應(yīng)器。整個(gè)反應(yīng)可以在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)器中進(jìn)行，該反應(yīng)器具有適當(dāng)方式來控制發(fā)酵液的溫度，或者可選地，發(fā)酵可以在第一個(gè)容器中進(jìn)行，發(fā)酵液可以通過經(jīng)過一個(gè)熱交換器-例如板式換熱器-保持在所需的溫度并循環(huán)回發(fā)酵反應(yīng)中。后一種設(shè)備能夠使反應(yīng)混合物更快速地冷卻，而且在一些情況下，在使發(fā)酵液通過一個(gè)膜分離組件以除去發(fā)酵液的一部分的同時(shí)，該設(shè)備也能運(yùn)行(例如，熱交換器和膜組件被串聯(lián)時(shí))。一種通常使用的形式包括膜循環(huán)生物反應(yīng)器。該類型的反應(yīng)器通常包括兩個(gè)組件，即一個(gè)發(fā)酵容器10和一個(gè)膜組件15(參見圖1)。這兩個(gè)組件可以用一根管相連，或者分別是一個(gè)單獨(dú)設(shè)備的一部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以在發(fā)酵容器中的第一部分營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，以產(chǎn)生含有至少大約25g/L游離L-乳酸的第一種產(chǎn)物溶液?？梢詫⑺玫降陌l(fā)酵液分離以提供第一部分，該部分含有游離乳酸并基本上不含有細(xì)菌細(xì)胞。這可以通過用泵使發(fā)酵液的一部分通過一個(gè)細(xì)胞分離器(例如中空纖維細(xì)胞分離器)來完成。含有細(xì)胞的部分通常被循環(huán)回發(fā)酵容器中(例如參見圖1)，而含有乳酸的部分被分離出來以進(jìn)一步處理。通常加入附加的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以使發(fā)酵容器中的液體體積保持在一個(gè)恒定水平。當(dāng)發(fā)酵以上述方式進(jìn)行時(shí)，在初始的啟動(dòng)階段結(jié)束后，通常能夠達(dá)到穩(wěn)態(tài)條件(在pH、乳酸或乳酸鹽濃度和營(yíng)養(yǎng)物濃度方面)并保持下去。當(dāng)在這種模式下運(yùn)行時(shí)，本發(fā)酵過程通常在這樣的條件下操作，即發(fā)酵液的pH被保持在大約4.2或更低，優(yōu)選在大約3.7至4.0的范圍之間。被分離出來的含有乳酸的部分可以用許多已知的方法處理，以將游離酸從溶液的其它組分中分離出來。例如，可以使用一種含有叔胺的萃取劑把乳酸從溶液中萃取出來。適當(dāng)萃取劑的一個(gè)實(shí)例是溶在辛醇中的Alamine336的溶液。其它可以用于分離乳酸的方法包括使溶液與一種固體吸附劑-例如一種離子交換樹脂(例如一個(gè)聚乙烯吡啶柱)-相接觸，蒸餾出含乳酸的部分，或通過膜分離除去乳酸。上述任何類型的分離方法都可以被用于處理含有乳酸的部分以產(chǎn)生一種乳酸貧化的部分和一種乳酸分離部分。乳酸貧化部分可以含有一些乳酸鹽形態(tài)的乳酸，例如乳酸鈣?？梢允褂迷S多已知方法中的任何方法來進(jìn)一步處理乳酸或乳酸鹽分離部分，以產(chǎn)生游離乳酸的更為純凈的形態(tài)。還可以處理含有乳酸的部分以分離出固體或液體形態(tài)的乳酸鹽(例如乳酸鈣)，剩下富含游離乳酸的溶液?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)募夹g(shù)來分離乳酸鹽，例如萃取、結(jié)晶、膜分離以及在固體材料(例如陰離子交換樹脂)上的吸附?？梢允谷樗猁}返回發(fā)酵容器中，在其中它可以用來緩沖溶液的pH并防止發(fā)酵液的pH降至所希望的水平之下。例如，通過使作為緩沖劑的足夠量的乳酸鈣循環(huán)，發(fā)酵液的pH可以被保持為接近于乳酸的pKa的值。根據(jù)理論，在3.85的pH下，乳酸鹽可以緩沖等當(dāng)量的新的乳酸產(chǎn)生。在pH4.0下，每一當(dāng)量的乳酸鹽將緩沖0.7當(dāng)量的新的乳酸產(chǎn)生。能夠使用多種方法來處理涉及產(chǎn)生大量乳酸的乳酸鹽/乳酸溶液；例如，在pH不高于大約4.8(優(yōu)選不高于大約4.2或4.3)、來自發(fā)酵液的溶液中；以及，使用伴隨的乳酸鹽(通常為乳酸鈣、乳酸鉀、乳酸鈉和/或乳酸銨)分離(和循環(huán)，如果需要的話)過程。舉例來說，這些方法被描述于以JohnN.Starr、AharonM.Eyal、RikiCanari、BettyHazan以及RodFisher為發(fā)明人、被共同轉(zhuǎn)讓(給明尼蘇達(dá)州，Minnetonka的Cargill有限責(zé)任公司)、共同申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)中，其題目為乳酸處理；方法；設(shè)備；以及產(chǎn)品(以后被稱作Starr等人的申請(qǐng))。Starr等人的申請(qǐng)的提出日期與本申請(qǐng)相同(1997年10月14日)，其內(nèi)容被并入本文作參考。有利的整體處理方法將部分取決于對(duì)于各種方法的選擇，其中的一種方法在大規(guī)模實(shí)施時(shí)最有利于一種整體上合算的和有效的處理方案的進(jìn)行。在整體方法的選擇中，該原則涉及系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，以達(dá)到兩個(gè)目標(biāo)1.乳酸產(chǎn)品的分離，以進(jìn)行后續(xù)的加工，例如生產(chǎn)聚合物；以及2.乳酸鹽的分離，優(yōu)選以所希望的形態(tài)，以使其循環(huán)回發(fā)酵液。三種通常的方法涉及1.從溶液中分離出乳酸，留下乳酸鹽；如果需要的話，將分離后含有乳酸鹽的剩余溶液加入發(fā)酵罐中；2.將乳酸鹽從溶液中分離出來；如果需要的話，將乳酸鹽加入發(fā)酵罐中；以及在乳酸鹽分離后，從剩余溶液中后續(xù)分離乳酸產(chǎn)品；以及，3.同時(shí)將乳酸分離進(jìn)一股物流、乳酸鹽分離進(jìn)另一股物流，剩下剩余的混合物。Starr等人所描述的用以實(shí)現(xiàn)上述一個(gè)或兩個(gè)目標(biāo)的技術(shù)可以在各種乳酸或乳酸鹽物質(zhì)的溶液(即乳酸和溶解的乳酸鹽的溶液)中實(shí)施。這些溶液可以包括發(fā)酵液或被從發(fā)酵罐中除去并以某種方式改變-例如通過過濾或pH調(diào)節(jié)-的發(fā)酵液。實(shí)際上，該技術(shù)也能夠被用于以其它方式生產(chǎn)的溶液。然而，該技術(shù)以及其中的建議是特別開發(fā)的，其重點(diǎn)在于發(fā)酵液溶液-特別是比較酸性的溶液-的有效處理，其中不再需要通過加酸來調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選地此過程沒有發(fā)生。上述技術(shù)可以被應(yīng)用的典型組合物，在pH方面，將至少為0.86并低于6.0。也就是說，可以實(shí)施本技術(shù)的典型組合物將具有在上述范圍內(nèi)的pH。對(duì)于這種組合物，游離乳酸與解離的酸或溶解的乳酸鹽在25℃下的摩爾比在大約1,000∶1至0.007∶1的范圍內(nèi)。更優(yōu)選的處理方法將涉及具有大約1.98-5.00的pH的溶液(HLA∶LA的比值在大約75∶1至0.070∶1的范圍內(nèi))；而且，最優(yōu)選的處理方法將涉及具有大約3.0-4.5范圍內(nèi)的pH的溶液(HLA∶LA的比值在大約7.0∶1至0.23∶1的范圍內(nèi))。如上所示，通過本發(fā)酵方法很容易得到上述在最優(yōu)選的pH范圍內(nèi)的溶液，其中含有高濃度的乳酸或乳酸鹽物質(zhì)。另外，可以使用其它的發(fā)酵液，例如通過加酸進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，通常調(diào)節(jié)到所給定的最優(yōu)選的pH范圍內(nèi)。此處有時(shí)將涉及“優(yōu)先分離”從含有乳酸和乳酸鹽的組合物中分離出乳酸；或者，從含有乳酸和乳酸鹽的組合物中分離出乳酸鹽。在本文的上下文中，術(shù)語(yǔ)“優(yōu)先分離”或其變體的意思是指分離技術(shù)，與另一組分相比，該技術(shù)優(yōu)先地除去兩種組分中的一種(乳酸或乳酸鹽)。在根據(jù)本發(fā)明的典型的優(yōu)選處理方法中，乳酸和乳酸鹽的混合物被分成兩股“產(chǎn)品流”。在一股產(chǎn)品流中(即富含游離乳酸的物流)，所得到的優(yōu)選的游離乳酸與乳酸鹽的摩爾比為至少2/1，優(yōu)選至少3/1。利用此處所描述的某些技術(shù)，至少5/1的比率以及實(shí)際上10/1或更高的比率是很容易得到的。另一股產(chǎn)品流是富含乳酸鹽的物流。在該物流中，優(yōu)選的游離乳酸與乳酸鹽的摩爾比不高于0.5。利用此處所描述的典型的優(yōu)選處理方法，不高于0.3、優(yōu)選不高于0.2以及最優(yōu)選不高于0.1或更低的比率是很容易得到的。在上兩段所示的上下文中，所使用的術(shù)語(yǔ)“物流”的意思是指一種分離的相或產(chǎn)品部分，其中并不考慮該相或產(chǎn)品部分是溶液、固體或物質(zhì)的混合物。因此，“富含乳酸的物流”僅指與處理的初始混合物相比，富含乳酸(與乳酸鹽相對(duì))的一相或混合物；“富含乳酸鹽的物流”是與處理的初始混合物相比，富含乳酸鹽(與乳酸相對(duì))的物流。當(dāng)富含游離乳酸的產(chǎn)品物流是通過將游離乳酸從混合物中-例如從一種發(fā)酵液中-分離出來而得到時(shí)，在游離乳酸方面，游離乳酸被除去后的剩余的含水混合物有時(shí)將被稱作“貧化的”。相似地，當(dāng)富含乳酸鹽的物流是通過將乳酸鹽從含有游離乳酸和乳酸鹽的混合物中分離出來而得到時(shí)，在乳酸鹽方面，剩余的混合物有時(shí)將被稱作“貧化的”。優(yōu)選地，當(dāng)所處理的溶液是發(fā)酵液時(shí)，就提供或形成富含乳酸鹽的產(chǎn)品物流，這樣來自發(fā)酵罐的雜質(zhì)與乳酸鹽的重量比就比發(fā)酵液中的該比值低，優(yōu)選至少低5倍。如同通過使用各種純化技術(shù)-例如回洗或再結(jié)晶-一樣，通過此處所描述的技術(shù)可以對(duì)上述情況進(jìn)行控制，其中涉及對(duì)為乳酸鹽的分離而選擇的特別方法的控制。為了方便地循環(huán)回發(fā)酵系統(tǒng)，乳酸或乳酸鹽產(chǎn)品物流最終被優(yōu)選地分離成一種含水溶液或水相與固體相的混合物，目的是保持水的平衡。如果為了促進(jìn)水的平衡而使用了對(duì)含水溶液的濃縮，優(yōu)選使用相對(duì)低成本的濃縮技術(shù)，例如反滲透和蒸汽再壓縮。通過下述實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例顯示了本發(fā)明的范圍，但并不限于此。在本發(fā)明構(gòu)思內(nèi)的變化將是顯而易見的。實(shí)施例1-標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件除非另外指出，描述于下述實(shí)施例中的發(fā)酵反應(yīng)使用各種生長(zhǎng)培養(yǎng)基、根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行。將在40％蕃茄汁/40％LSW-MRS瓊脂下相/MRS上相雙相(TJ-SW-MRS雙相)中的細(xì)胞(250ul)從特定菌株的實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)備物轉(zhuǎn)入新鮮的TJ-SW-MRS雙相培養(yǎng)基中，并在47℃下靜態(tài)條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)。MRS培養(yǎng)基(pH＝6.2)10g/L胰消化的明膠8g/L牛肉膏4g/L酵母膏20/L葡萄糖2g/LK2HPO41g/L吐溫805g/L醋酸鈉5g/L檸檬酸銨0.2g/LMgSO40.05g/LMnSO4新鮮TJ-SW-MRS雙相培養(yǎng)基中的1.0ml等份的培養(yǎng)液被用于接種處于一個(gè)密封的血清瓶中、補(bǔ)充有10％CSL、葡萄糖(總濃度60g/L)和碳酸鈣(20g/L)的80ml培養(yǎng)基B，并在47℃下、在一個(gè)環(huán)境搖動(dòng)器中搖動(dòng)培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)基B(pH＝4.7)8-12vol.％玉米漿5g/L酵母膏50-100g/L葡萄糖2g/LK2HPO41g/L吐溫802g/L檸檬酸銨0.2g/LMgSO40.05g/LMnSO420-40g/LCaCO3將培養(yǎng)時(shí)間為18個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)基以10％(v/v)的量接種入裝有培養(yǎng)基B的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基B具有所需濃度的葡萄糖和碳酸鈣(例如90g/L的葡萄糖和33.4g/L的碳酸鈣)。發(fā)酵在47-49℃、攪拌轉(zhuǎn)速150rpm以及發(fā)酵罐的70-80％被充滿的條件下操作。在這種液體容積水平下操作保證了培養(yǎng)基不會(huì)變得高度好氧。實(shí)施例2-不經(jīng)pH控制的純?nèi)樗峋攴蛛x純?nèi)樗峒?xì)菌菌株是從八個(gè)不同的工業(yè)玉米研磨設(shè)備得到的玉米浸漬液樣品中分離的。這些設(shè)備位于內(nèi)布拉斯加州的Blair；愛荷華州的Edyville；愛荷華州的CedarRapids；俄亥俄州的Dayton；田納西州的Memphis；土耳其的Istanbul；英格蘭的Tillbury；以及荷蘭的BergenOpZoon。通過獲得來自商用玉米研磨設(shè)備的浸漬液樣品，對(duì)菌株進(jìn)行了分離。這些樣品被涂布在10％的CSL-MRS瓊脂平板上(pH5.0)并在47℃下厭氧培養(yǎng)。為了分離，將菌落在10％的CSL-MRS瓊脂平板上再劃線。為了保存，將分離物隨后轉(zhuǎn)入一種40％LSW-40％蕃茄汁-MRS下相/MRS上相的雙相培養(yǎng)基(pH6.0)中。通過雜乳酸的生產(chǎn)對(duì)所分離的菌株進(jìn)行篩選，方法是監(jiān)控試管底部氣體(CO2)的產(chǎn)生。隨后在補(bǔ)充有10vol.％CSL和30g/L葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中，通過乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量和所產(chǎn)生乳酸或乳酸鹽的光學(xué)純度對(duì)純?nèi)樗岱蛛x物進(jìn)行篩選。結(jié)果示如下面的表1中。所分離的細(xì)菌菌株被檢定為不是純?nèi)樗峄蛉樗猁}生產(chǎn)者(“純?nèi)樗峄蛉樗猁}的”)就是雜乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)者(“雜乳酸的”)?；谠谘a(bǔ)充有10vol.％玉米漿(“CSL”)的MRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵，所分離的純?nèi)樗峒?xì)菌菌株是以總體乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量、最終發(fā)酵pH以及所產(chǎn)生的L-乳酸或乳酸鹽的百分?jǐn)?shù)來檢定的(參見下面的表1)。由于所加入的玉米漿(“CSL”)中大約50％的乳酸或乳酸鹽通常是D-乳酸或乳酸鹽，生產(chǎn)至少大約70％L-乳酸或乳酸鹽的菌株就被認(rèn)為是L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株。上述假設(shè)通過隨后的實(shí)驗(yàn)得到了確認(rèn)，在該實(shí)驗(yàn)中，存在于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中、來自于浸漬液的產(chǎn)品中的D-乳酸或乳酸鹽雜質(zhì)水平是較低的(例如，較高的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)水平，或使用的玉米浸漬液具有高于80％的L-乳酸或乳酸鹽(作為全部乳酸或乳酸鹽的一部分))。發(fā)酵在48℃下、在實(shí)施例1中所描述的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。結(jié)果示于下面的表1中。實(shí)施例3-使用加入的堿來分離耐酸的純?nèi)樗峋暌唤M附加的純?nèi)樗峋瓯粡挠衩捉n液樣品中分離出來，這些樣品來自Edyville(愛荷華州)、CedarRapids(愛荷華州)以及Blair(內(nèi)布拉斯加州)的玉米研磨設(shè)備。采用的分離程序與實(shí)施例2中所述的相同。根據(jù)在補(bǔ)充有10vol.％CSL、90g/L葡萄糖和33g/LCaCO3的培養(yǎng)基B中進(jìn)行的發(fā)酵，對(duì)所分離的純?nèi)樗峋赀M(jìn)行檢定。測(cè)定了該組菌株的整體乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量和/或所產(chǎn)生的L-乳酸或乳酸鹽的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果示于下面的表2中。表2分離的純?nèi)樗峋?lt;/tables>實(shí)施例4-所加入的堿對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響對(duì)被確認(rèn)為L(zhǎng)-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)者的描述于實(shí)施例2中的許多菌株進(jìn)行篩選，以考察加入的堿(CaCO3)對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響。發(fā)酵在48℃下、在補(bǔ)充有10％CSL和30g/L葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行。在所加入的堿存在時(shí)所作的測(cè)定使用了補(bǔ)充有10％CSL、30g/L葡萄糖和20g/LCaCO3的MRS培養(yǎng)基。表3CaCO3對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響菌株#乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)(g/L)無堿20g/L碳酸鈣62142102032142337191733212649221934232847241846412448422749432342442439452137462147472137512437實(shí)施例5-L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)對(duì)描述于實(shí)施例2中的許多菌株的L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)水平進(jìn)行了檢定。發(fā)酵在48℃下、在補(bǔ)充有10％CSL、30g/L葡萄糖和20g/LCaCO3的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行。表4L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株#％L-乳酸或乳產(chǎn)生的乳酸或乳酸酸鹽鹽(g/L)1087％39.121479％21.112185％38.562385％35.692484％31.784186％38.104283％30.624380％25.174484％31.754686％36.12實(shí)施例6-用ATCC保藏的乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽考察了許多已知乳桿菌屬菌株的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)能力，這些菌株是從玉米浸漬液之外的其它來源中分離出來的。從美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTissueCultureCollection)(馬里蘭州的Rockville)得到十一種不同菌株的樣品，并基于在37℃下、在補(bǔ)充有75g/L葡萄糖和30g/L碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵，根據(jù)總?cè)樗岙a(chǎn)量和最終培養(yǎng)pH對(duì)菌株進(jìn)行篩選。結(jié)果示于下面的表5中。所有菌株的生長(zhǎng)在47℃下都很差，并且被營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中所存在的玉米浸漬液所抑制。盡管ATCC保藏菌株的營(yíng)養(yǎng)要求與分離自玉米浸漬液的菌株不同，幾個(gè)ATCC保藏的菌株似乎能夠生產(chǎn)較高濃度的游離乳酸。特別是瑞士乳桿菌(Lactobacillushelviticus)(ATCC#15009；在4.03的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)66g/L的乳酸或乳酸鹽)、類干酪乳桿菌堅(jiān)韌亞種(Lactobacillusparacaseitolerans)(ATCC#25599，在4.04的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)66g/L的乳酸或乳酸鹽)以及唾液乳桿菌唾液亞種(Lactobacillussalivariussalivarius)(ATCC#11741；在4.12的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)64g/L的乳酸或乳酸鹽)似乎能夠作為高產(chǎn)量游離乳酸的潛在生產(chǎn)者。測(cè)定了許多菌株所生產(chǎn)的乳酸或乳酸鹽的光學(xué)純度。在能夠生產(chǎn)較高濃度游離乳酸的菌株中，沒有一種是L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株。表5ATCC乳桿菌屬菌株的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)實(shí)施例7-純?nèi)樗峄蛉樗猁}菌株#4l的SO2耐受力考察了不同的二氧化硫(SO2)濃度對(duì)純?nèi)樗峋?41的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)能力的影響。使用菌株#41，考察了不同的二氧化硫濃度對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響。通過描述于實(shí)施例1中的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵規(guī)程，發(fā)酵在補(bǔ)充有10vol.％CSL、30g/L葡萄糖和20g/LCaCO3的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行。下面表6中所示的結(jié)果表明，菌株#41能夠在高達(dá)至少大約600ppm的SO2濃度存在的條件下生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。當(dāng)存在800ppm的SO2時(shí)，在所進(jìn)行的類似的發(fā)酵中，菌株#41經(jīng)過一個(gè)144小時(shí)的休眠期后開始生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。表6純?nèi)樗峋?41的SO2耐受力SO2濃度乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)(g/L)24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)200ppm114866400ppm92755600ppm91143實(shí)施例8-溫度對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響在41℃至54℃之間的溫度范圍內(nèi)，測(cè)定了純?nèi)樗峋?41的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量。發(fā)酵在補(bǔ)充有10vol.％CSL、60g/L葡萄糖和20g/L碳酸鈣的培養(yǎng)基B中進(jìn)行。下面表7所示的結(jié)果證實(shí)，菌株#41生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽的最佳溫度范圍是從44℃到54℃。表7乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的溫度相關(guān)性溫度(℃)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)(g/L)24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)41°14516844°25556847°26506350°31525754°91923實(shí)施例9-浸漬液濃度對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響使用描述于實(shí)施例2中的許多L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵，以考察生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不同量的玉米漿對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響。發(fā)酵在48℃下、在補(bǔ)充有50g/L葡萄糖、20g/LCaCO3以及1％、5％或10％CSL的培養(yǎng)基A(見下文)中進(jìn)行。培養(yǎng)基A(pH＝5.0)10g/L酵母膏0.2％K2HPO41g/L吐溫80.2％檸檬酸銨0.005％MnSO44H2O0.02％MgSO47H2O加入的碳源/能量來源加入的氮源加入的用于調(diào)節(jié)pH的CaCO3表8浸漬液對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響菌株#乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)(g/L)1％CSL5％CSL10％CSL10119312311032241622411933451835實(shí)施例10-根據(jù)核糖型(ribotype)對(duì)純?nèi)樗峋甑臋z定根據(jù)核糖印跡模式分析(riboprintpatternanalysis)(參見，例如Jaquet等人，Zbl.Bakt.，276,356-365(1992))對(duì)分離自玉米浸漬液的許多L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)純?nèi)樗峒?xì)菌菌株進(jìn)行了分類。該技術(shù)的原理，是使用一種EciRI限制酶對(duì)來自所述菌株的一個(gè)單一菌落的DNA進(jìn)行消化，經(jīng)過在瓊脂糖凝膠上的粒析后，使該DNA與來自大腸桿菌(E.coli)的經(jīng)化學(xué)標(biāo)記的rRNA操縱子進(jìn)行雜交。所得到的模式是微生物之間遺傳關(guān)系的直接指標(biāo)，它已經(jīng)被用于鑒別四個(gè)屬的細(xì)菌(沙門氏菌(Samonella)、李斯忒氏菌(Listeria)、葡萄球菌(Staphylococcus)和大腸桿菌)以及用于對(duì)關(guān)系很近的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌株的分類學(xué)鑒別。分離自玉米浸漬液的七種乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株的核糖型結(jié)果示于圖2中。給予相同核糖組(RiboGroup)名稱的菌株可能被認(rèn)為為具有相同的分類學(xué)水平。示于圖2中的七種菌株所顯示的核糖型，與一種商用實(shí)驗(yàn)室計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中的30種不同乳酸細(xì)菌菌株中的任何一種的模式都不吻合。在數(shù)據(jù)庫(kù)的菌株中，不吻合的是嗜酸乳桿菌、動(dòng)物乳桿菌、德氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、食淀粉乳桿菌和唾液乳桿菌。示于圖2中的菌株的核糖型還與來自下述菌株的模式不吻合敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、融合乳桿菌(Lactobacillusconfusus)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacilluskefir)、鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、清酒乳桿菌(Lactobacillussake)以及豬雙臼乳桿菌(Lactobacillussuebicus)。示于圖2中的核糖型模式還與來自下述菌株的不吻合格氏乳球菌(Lactococcusgarviae)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、或者肉色明串珠菌(Leuconostoccarnosum)、檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、類腸膜明串珠菌(Leuconostocparamesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、糊精片球菌(Pediococcusdextrinicus)和戊糖片球菌(Pediococcuspentoxaceus)。示于圖2中的七種菌株的核糖型模式屬于三種核糖組。其中兩種菌株(#114和#119)具有相同的核糖型。這兩種菌株中的一種是雜乳酸菌株(#119)，而另一種是生產(chǎn)外消旋乳酸或乳酸鹽的純?nèi)樗峋?#114)。其中的一種D-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株(#79)顯示了與其它六種菌株不同的核糖型模式。剩下的四種菌株(#90、127、132和140)被歸類于相同的核糖組中，而且可以被認(rèn)為可能具有相同的分類學(xué)水平，盡管事實(shí)上它們的核糖型模式是不同的。在具有MIL4-1132模式的四種菌株中，三種是L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株(#90、132和140)，而第四種(#127)生產(chǎn)外消旋乳酸或乳酸鹽。實(shí)施例11-加入的堿對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響考察了加入不同量的CaCO3對(duì)純?nèi)樗峋?41的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響。實(shí)驗(yàn)在47℃下、在補(bǔ)充有8vol.％CSL、200g/L葡萄糖和不同添加量的碳酸鈣(30-90g/L)的培養(yǎng)基A中進(jìn)行。結(jié)果示于下面的表9中。表9CaCO3對(duì)乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)的影響乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)(g/L)CaCO3濃度0小時(shí)24小時(shí)51小時(shí)120小時(shí)最終pH30g/L3.1748.175.575.73.9840g/L6.1253.481.387.04.4850g/L5.8449.483.488.14.7360g/L3.2150.275.477.24.7570g/L4.8548.975.373.84.880g/L3.4554.461.183.64.7790g/L5.3949.657.883.64.74實(shí)施例12-有12％CSL、90g/L葡萄糖和33.4g/LCaCO3時(shí)菌株#41的發(fā)酵側(cè)形圖3顯示了在一個(gè)典型的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過程中，與時(shí)間對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液中的pH和有機(jī)成分的側(cè)形。顯示于圖3中的側(cè)形基于通過在47℃下、在補(bǔ)充有10vol.％CSL、100g/L葡萄糖和33.4g/L碳酸鈣的培養(yǎng)基B中培養(yǎng)菌株#41而得到的結(jié)果。實(shí)施例13-有90g/L葡萄糖、33.4g/LCaCO3和12％CSL/36％LSW時(shí)菌株#41的發(fā)酵側(cè)形圖4顯示了在使用菌株#41的典型的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的過程中，與時(shí)間對(duì)應(yīng)的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量。該發(fā)酵使用描述于實(shí)施例1中的規(guī)程進(jìn)行。顯示于圖4中的側(cè)形基于通過在47℃下、在補(bǔ)充有90g/L葡萄糖、33.4g/L碳酸鈣和12vol.％CSL(36wt.％干固體)或36vol.％LSW(12wt.％干固體)的培養(yǎng)基C中培養(yǎng)菌株#41而得到的結(jié)果。總結(jié)于下面表10中的結(jié)果顯示，最終大約40g/L的游離乳酸濃度與兩種玉米浸漬液都無關(guān)。由于乳酸或乳酸鹽的生產(chǎn)是使用一種L-乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)菌株(#41)進(jìn)行的，在上述發(fā)酵過程結(jié)束時(shí)至少存在大約35g/L的游離L-乳酸(剩余物是存在于所加入的浸漬液中的游離D-乳酸或乳酸鹽)。表10使用菌株#41的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量玉米浸漬液來源12％CSL36％LSW乳酸或乳酸鹽(g/L)0小時(shí)10.38.416小時(shí)44.052.424小時(shí)80.592.244小時(shí)91.596.8最終pH3.923.98最終的游離乳酸或乳酸鹽4241(g/L)實(shí)施例14-有8-12％CSL、90g/L葡萄糖和36.6g/LCaCO3時(shí)菌株#41的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)圖5顯示了在使用菌株#41的典型的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)過程中，與時(shí)間對(duì)應(yīng)的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量。該發(fā)酵使用經(jīng)過修正的描述于實(shí)施例1中的規(guī)程進(jìn)行。使菌株#41的細(xì)胞在800ml的培養(yǎng)基中預(yù)生長(zhǎng)，然后將其從培養(yǎng)基中分離。然后使預(yù)生長(zhǎng)的細(xì)胞再懸浮于800ml的新鮮培養(yǎng)基中。顯示于圖5中的側(cè)形基于通過在47℃下、在補(bǔ)充有90g/L葡萄糖、36.6g/L碳酸鈣和8vol.％CSL(36wt.％干固體)、12vol.％CSL、24vol.％LSW(12wt.％干固體)或36vol.％LSW的培養(yǎng)基B中對(duì)預(yù)生長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)而得到的結(jié)果。表11使用菌株#41的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量玉米浸漬液來源最終pH乳酸或乳酸鹽游離乳酸8％CSL3.8393g/L47g/L24％LSW3.9094g/L44g/L12％CSL3.8097g/L52g/L36％LSW3.8199.5g/L53g/L實(shí)施例15-加入的葡萄糖對(duì)乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量的影響考察了加入不同量的碳水化合物源(葡萄糖)對(duì)純?nèi)樗峋?41的乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量的影響。使用描述于實(shí)施例1中的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵規(guī)程，發(fā)酵通過在48℃下、在補(bǔ)充有10vol.％CSL、20g/LCaCO3和規(guī)程中所示的葡萄糖濃度的培養(yǎng)基A中培養(yǎng)菌株#41來進(jìn)行。該培養(yǎng)基還含有附加的來自玉米漿的1-15g/L的發(fā)酵性糖(主要是葡萄糖和果糖)。結(jié)果示于下面的表12中。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，至少對(duì)于所加入的堿的濃度(20g/LCaCO3)而言，通過至少大約50g/L的諸如葡萄糖的碳水化合物源的加入，乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)能力可以被提高。表X1葡萄糖對(duì)乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量的影響乳酸或乳酸鹽產(chǎn)量(g/L)加入的葡萄糖24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)30g/L14394250g/L11515580g/L115067100g/L94765對(duì)本發(fā)明的描述參考了各種特定的和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)。但是，不能將本發(fā)明視為僅限于在本說明書中公開的特定的實(shí)施方案。應(yīng)理解的是，可以進(jìn)行許多變化和修改而仍保留在本發(fā)明的主旨和范圍之中。表1所分離的純?nèi)樗峋瓯?(續(xù))所分離的純?nèi)樗峄蛉樗猁}菌株權(quán)利要求1.一種用于生產(chǎn)乳酸的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物，以在不高于大約4.8的最終培養(yǎng)pH下產(chǎn)生含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的溶液，其中乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度。2.權(quán)利要求1的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，以在不高于大約4.5的最終培養(yǎng)pH下產(chǎn)生含有至少大約40g/LL-乳酸或乳酸鹽或至少大約40g/LD-乳酸或乳酸鹽的溶液。3.權(quán)利要求2的方法，其中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有至少大約15g/L的玉米浸漬液干固體。4.權(quán)利要求2的方法，其中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有至少大約50g/L的碳水化合物，它包括葡萄糖、果糖、半乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖或它們的混合物。5.權(quán)利要求2的方法，它包括在大約35℃至大約53℃下培養(yǎng)細(xì)菌。6.權(quán)利要求2的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中以不高于大約4.5的平均培養(yǎng)pH培養(yǎng)細(xì)菌，以產(chǎn)生含有至少大約75g/LL-乳酸或乳酸鹽的溶液。7.權(quán)利要求1的方法，其中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有堿。8.權(quán)利要求7的方法，其中堿包括碳酸鈣、氫氧化鈉、氫氧化銨、碳酸氫鈉或它們的混合物。9.權(quán)利要求1的方法，其中營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有乳酸鹽。10.權(quán)利要求9的方法，其中乳酸鹽包括乳酸鈣、乳酸鈉、乳酸銨或它們的混合物。11.一種用于生產(chǎn)乳酸的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中、在不高于大約4.3的平均培養(yǎng)pH下培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，以產(chǎn)生含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的溶液，其中乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度。12.權(quán)利要求11的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，以產(chǎn)生具有至少大約80％光學(xué)純度的L-乳酸或乳酸鹽。13.權(quán)利要求11的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌，從而以至少大約2.0g/L/hr的總速率生產(chǎn)乳酸或乳酸鹽。14.權(quán)利要求11的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，以在不高于大約4.0的最終培養(yǎng)pH下產(chǎn)生含有至少大約40g/LL-乳酸或乳酸鹽或至少大約40g/LD-乳酸或乳酸鹽的溶液。15.一種用于生產(chǎn)乳酸的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，以生產(chǎn)含有至少大約25g/L游離L-乳酸或至少大約25g/L游離D-乳酸的溶液。16.權(quán)利要求15的方法，它包括在具有不高于大約4.2的平均培養(yǎng)pH的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌。17.耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，該細(xì)菌能夠在不高于大約4.8的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的溶液，其中乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度。18.權(quán)利要求17的純?nèi)樗峒?xì)菌，其中所述細(xì)菌能夠被在具有不高于大約4.3的平均培養(yǎng)pH的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以生產(chǎn)含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的溶液，其中乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度。19.權(quán)利要求17的純?nèi)樗峒?xì)菌，其中所述細(xì)菌是棒狀的、革蘭氏陽(yáng)性的、空氣惰性的細(xì)菌。20.權(quán)利要求17的純?nèi)樗峒?xì)菌，其中所述細(xì)菌能夠生產(chǎn)具有至少大約80％光學(xué)純度的乳酸或乳酸鹽。21.權(quán)利要求17的純?nèi)樗峒?xì)菌，其中所述細(xì)菌能夠在至少大約47℃的溫度以及不高于大約4.2的平均培養(yǎng)pH下生產(chǎn)至少大約80g/L的L-乳酸或乳酸鹽。22.權(quán)利要求17的純?nèi)樗峒?xì)菌，其中當(dāng)在含有至少大約15g/L玉米浸漬液干固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述細(xì)菌能夠生產(chǎn)至少大約40g/L的乳酸或乳酸鹽。23.耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌，所述細(xì)菌能夠生產(chǎn)含有至少大約25g/L游離L-乳酸或至少大約25g/L游離D-乳酸的溶液。24.一種用于生產(chǎn)乳酸的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的第一部分中培養(yǎng)耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物，以在不高于大約4.8的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的第一種產(chǎn)物溶液，其中在第一種產(chǎn)物溶液中的乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度；分離第一種產(chǎn)物溶液以生產(chǎn)(i)一種含有乳酸或乳酸鹽并基本上不含微生物的第一部分，以及(ii)含有微生物的第二部分；以及處理第一部分以產(chǎn)生乳酸貧化的第三部分以及乳酸富集的第四部分。25.權(quán)利要求24的方法，它還包括形成一種混合物，該混合物含有(i)第三部分的至少一部分；(ii)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的第二部分；以及(iii)微生物；以及培養(yǎng)該混合物，以在不高于大約4.8的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的第二種產(chǎn)物溶液，其中第二種產(chǎn)物溶液中的乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度。26.權(quán)利要求24的方法，其中乳酸貧化的第三部分含有乳酸鹽。27.一種用于生產(chǎn)乳酸的方法，它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的第一部分中培養(yǎng)耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物，以在不高于大約4.8的最終培養(yǎng)pH下生產(chǎn)含有至少大約40g/L乳酸或乳酸鹽的第一種產(chǎn)物溶液，其中在第一種產(chǎn)物溶液中的乳酸或乳酸鹽具有至少大約50％的光學(xué)純度；以及處理第一種產(chǎn)物溶液以產(chǎn)生乳酸貧化的第三部分以及乳酸富集的第四部分。全文摘要提供了一種用于生產(chǎn)乳酸的方法,它包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)耐酸的乳酸或乳酸鹽生產(chǎn)微生物,例如耐酸的純?nèi)樗峒?xì)菌,以生產(chǎn)含有高濃度游離乳酸的發(fā)酵液。還提供了能夠生產(chǎn)高濃度游離乳酸的分離的耐酸純?nèi)樗峒?xì)菌。文檔編號(hào)C12P7/56GK1276016SQ98810123公開日2000年12月6日申請(qǐng)日期1998年10月13日優(yōu)先權(quán)日1997年10月14日發(fā)明者T·L·卡爾森,E·M·小彼得斯申請(qǐng)人:卡吉爾公司