專利名稱：：調(diào)節(jié)pna寡聚物/核酸復合物的穩(wěn)定性的組合物、試劑盒與方法調(diào)節(jié)PNA寡聚物/核酸復合物的穩(wěn)定性的組合物、試劑盒與方法相關申請的交叉引用本申請要求2005年6月30日提交的美國臨時申請60/695,796和2006年6月29日提交的申請?zhí)柹形唇o予的美國專利申請的優(yōu)先權。本文所用的章節(jié)標題只是為了說明目的，不應理解成以任何方式限制了所述主題。1.領域本發(fā)明涉及肽核酸領域。2.引言肽核酸(PNA)是一類合成的核堿基，包括能與核酸及其它多核堿基(polynucleobase)鏈發(fā)生序列特異性雜交的寡聚物。多核堿基鏈的核堿基之間的雜交通常依據(jù)已充分確定的氫鍵規(guī)則。對于Watson-Crick堿基配對，腺嘌呤(A)通常與胸腺嘧啶(T)堿基配對，而胞嘧啶(C)通常與鳥嘌呤(G)堿基配對。核酸領域熟知各種其它堿基-配對基序。已研究了含有核堿基8-氮雜-7-脫氮雜腺嘌呤(deazaadenine)(8-A-7-DAA)的核苷，發(fā)現(xiàn)其顯示通用核苷的特性(Seela等，Nucl.AcidsRes.，28(17):3224-3232(2000))。術語"通用核苷"指能與4種經(jīng)典DNA核堿基(即，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤)形成特異性氫鍵的核苷。已有人提出了適用于PNA寡聚物的幾種通用核堿基(Challa等，OrganicLetters,1(10):1639-1641(1999);Zhang等，Methods,23:132-140(2001))。通用核堿基在理論上能與4種經(jīng)典DNA核堿基中的任一種形成特異性氫鍵。可以連接以產(chǎn)生較長PNA寡聚物的短PNA寡聚物文庫是有助于快速制備大規(guī)?；蚪M分析項目所需探針的感興趣手段(參見，例如美國專利申請公布2003-0077608)。然而，(如果)不用費力地將許多短PNA寡聚物連接成許多較長的寡聚物就能獲得這種大規(guī)?；蚪M分析項目所需的所有探針，(那么)這種技術是有用的。此外，即使采用連接來制備PNA寡聚物，如果較短的探針可用于雜交試驗也是有利的。無論如何，制備全長PNA寡聚物文庫很困難，因為長度最短的探針一般是10-聚體，這是由于更短的探針(對于未修飾的PNA)的熱解鏈溫度(Tm)通常很低，從而不能在可靠雜交分析通常采用的條件下發(fā)生雜交。假定文庫的10-聚體探針含有4種天然產(chǎn)生的核堿基(A、C、G和T)，制備完整文庫組所需的探針總數(shù)將是1,048,576(41())種不同探針。由于完成該文庫組所需的探針數(shù)量巨大，簡言之，目前制備這種文庫在經(jīng)濟上不可行。然而，應用某些技術可能減少形成完整文庫組所需的不同探針數(shù)量，從而有助于產(chǎn)生有用的文庫。例如，一些位置可使用通用堿基。這可減少文庫的復雜性，因為各位置無需4種可能的不同堿基，而只需要一種堿基。例如，在IO-聚體中，如果IO個位置中的4個使用通用堿基，則使用總共4096(46)種不同探針即可完成文庫組。此外，如果可能以不依賴于序列的方式升高該文庫組中探針的Tm，甚至只需更少的探針即可完成文庫組。例如，如果可能以基本上不依賴于序列的方式將某文庫組中所有探針的平均解鏈溫度升高約10-15°C，可能使用8-聚體或9-聚體探針組。制備可以基本上不依賴于序列的方式調(diào)節(jié)(例如，升高)Tm的探針組是要描述的本發(fā)明實施方式的一種可能應用。3.附圖犮術乂貞應效遣7"述厥房i產(chǎn)為7說欲游^游。yW凰不;f要以/iW方式A皮煮y本發(fā)敏游纖。圖1A和1B說明了可摻入核酸、PNA寡聚物和PNA嵌合體中的一些核堿基。圖2說明了標出C-末端羰基碳和N-末端氨基的PNA寡聚物通用結(jié)構(gòu)。圖3A說明了PNA寡聚物的N-末端氨基與含羧酸基團的標記試劑縮合的縮合反應。圖3B說明了用含鹵原子的標記試劑單烷化或雙烷化N-末端氨基的烷化反應。圖3C說明了通過將PNA寡聚物裝配在包含氨基酸的合成支持物上來標記示范性PNA寡聚物C-末端的方法，所述氨基酸包含側(cè)鏈標記(例如，疏水基團)。圖3D說明了C-末端羰基與含氨基的疏水性標記試劑反應的縮合反應。圖3E說明了將含有C-末端疏水性基團的PNA寡聚物的N-末端氨基共價固定于固體支持物的縮合反應。圖4A是雙標記PNA寡聚物的一種實施方式。圖4B是各含有N-末端疏水性基團和可檢測部分的兩種PNA寡聚物的實施方式。圖4C是含有兩個疏水性基團、一個能量供體部分和一個能量接受體部分的PNA寡聚物的實施方式。圖4D是含有兩個疏水性基團、一個能量供體部分和一個能量接受體部分的PNA寡聚物的另一實施方式。圖4E是含有兩個疏水性基團、一個能量供體部分和一個能量接受體部分的PNA寡聚物當然還有另一實施方式。圖4F是含有兩個疏水性基團、兩個荷電氨基酸、一個能量供體部分和一個能量接受體部分的PNA寡聚物的實施方式。圖5圖示含有乙?；颦h(huán)己基丁基(cyclohexylbutryl)的兩種PNA寡聚物。圖6說明了可與PNA寡聚物的N-末端氨基或C-末端羰基碳相連的各種基團以及它們在1ogP。et量表上的相對疏水性。/iW力,夯^脫本伊淳歹/^游厥有文/#浙賴敘游#樣包存但不銜f專聘、專W伊諄、文享、齊蘑、殺效界齒特廚資專/7全文謝A本文伊為參考，新無論這鼓就f瞎/賄層形式。4.定義為^^釋本說努齊，菜^以7"定義i要合適，以卓教使厲游術語說包惠實教形式，反之#然。效菜7^/iW定乂與遂卓河玄/iW^"&文斧「包薪謝A本文《力參考游/iY^文/為力游^^^^，突，以7"述定乂為準。a.本文所用的"核堿基"指采用核酸技術或肽核酸技術制備能與核酸及其它多核堿基鏈序列特異性結(jié)合的多核堿基鏈的技術人員公知的天然存在和非天然存在的雜環(huán)部分。合適核堿基的非限制性例子包括腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫(thio)-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9-(7-脫氮雜(deaza)-鳥嘌呤)、N9-(7-脫氮雜-8-氮雜-鳥嘌呤)和N8-(8-氮雜-7-脫氮雜腺嘌呤)。合適核堿基的其它非限制性例子包括圖1A和1B(也參見US6,357,163的圖2A和2B)所示的那些核堿基。b.本文所用的"核堿基序列"指多核堿基鏈的任何區(qū)段或兩個或多個區(qū)段的聚集體(即，相連的聚合物)。合適的多核堿基鏈的非限制性例子包括寡聚脫氧核苷酸(例如，DNA)、寡聚核糖核苷酸(例如，RNA)、肽核酸(PNA)、PNA嵌合體、核酸類似物和/或核酸模擬物。c.本文所用的"靶序列"指待測定的多核堿基鏈的核堿基序列。d.本文所用的短語"含有核堿基的亞單位"指含有核堿基的多核堿基鏈的亞單位。對于寡核苷酸，含有核堿基的亞單位是核苷酸。參考寡核苷酸，本領域技術人員可以知道其它種類的多核堿基鏈相關的亞單位形式。e.本文所用的"多核堿基鏈"指包含兩個或多個含核堿基的亞單位的完整單鏈聚合物。f.本文所用的"核酸"指含有完全由核苷酸形成的骨架的多核堿基鏈或其類似物。優(yōu)選的核酸是DNA、RNA、L-DNA或鎖定核酸(LNA)。為避免任何疑問，PNA是核酸模擬物而不是核酸或核酸類似物。PNA不是核酸，因為其不是由核苷酸形成。為解釋本說明書，PNA嵌合體肽核酸/核酸嵌合體)不是核酸。g.本文所用的"肽核酸"或"PNA"指含有兩個或多個PNA亞單位的任何多核堿基鏈區(qū)段或多核堿基鏈，包括但不限于以下美國專利中所提到或要求保護的任何多核堿基鏈或多核堿基鏈區(qū)段5,539,082;5,527,675;5,623,049;5,714,331;5,718,262;5,736,336;5，773,571;5,766,855;5,786,461;5,837,459;5,891,625;5,972,610;5,986,053;6,107,470和6,357,163。為避免任何疑問，本文所用的"PNA寡聚物"包括PNA嵌合體。術語"肽核酸"或"PNA"還適用于含有以下出版物中所述核酸模擬物的兩個或多個亞單位的多核堿基鏈區(qū)段或任何多核堿基鏈Lagriffoul等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,4:1081-1082(1994);Petersen等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,6:793-796(1996);Diderichsen等，Tett.Lett.37:475-478(1996);Fujii等，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637-627(1997);Jordan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687-690(1997);Krotz等，Tett.Lett.36:6941-6944(1995);Lagriffoul等，Bioorg.Med.Chem.Lett,4:1081-1082(1994);Diederichsen，U.，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,7:1743-1746(1997);Lowe等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,(1997)1:539-546;Lowe等，J,Chem,Soc.PerkinTrans.11:547-554(1997);Lowe等，J.Chem.Soc.PerkinTrans.11:555-560(1997);Howarth等，J.Org.Chem,62:5441-5450(1997);Altmann，K-H等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,7:1119-1122(1997);Diederichsen，U.，Bioorganic&Med.Chem.Lett,8:165-168(1998);Diederichsen等，Angew.Chem.Int.Ed.，37:302-305(1998);Cantin等，Tett.Lett,38:4211-4214(1997);Ciapetti等，Tetrahedron,53:1167-1176(1997);Lagriffoule等，Chem.Eur,J.，3:912-919(1997);Kumar等，OrganicLetters3(9):1269-1272(2001);和Shah等在WO96/04000中披露的基于肽核酸的模擬物(PENAM)。在一些實施方式中，"肽核酸"或"PNA"是含有兩個或多個下式所示共價連接的亞單位的多核堿基鏈區(qū)段或多核堿基鏈「個Qi(cj/;(。2)。、其中，各J相同或不同，其選自下組H、R'、OR'、SR'、NHR'、NR'2、F、Cl、Br禾BI。各K相同或不同，其選自下組O、S、NH和NR'。各R'相同或不同，可以是垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團。例如，R'可以是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異丁基、正戊基、正己基、甲氧基、乙氧基、芐基或苯基。各A是單鍵、式-(CJ2)s-所示基團或式-(CJ2)sC(0)-所示基團，其中J如上定義，各s是l-5的整數(shù)。各t是l或2，各u是l或2。各L相同或不同，獨立為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺啼啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假異胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9-(7-脫氮雜-鳥嘌呤)、N9-(7-脫氮雜-8-氮雜-鳥嘌呤)、N8-(8-氮雜-7-脫氮雜腺嘌呤)、其它天然存在的核堿基類似物或其它非天然存在的核堿基(例如，圖1A和1B)。在一些實施方式中，PNA亞單位可以是通過亞甲基羰基鍵與N-[2-(氨基乙基)]甘氨酸骨架的N-OC-甘氨酰氮相連的天然存在或非天然存在的核堿基；這是目前最常用的肽核酸亞單位形式。h.本文所用的"PNA嵌合體"表示含有兩個或多個PNA亞單位和一個或多個核酸亞單位(即，DNA或RNA)或它們的類似物的寡聚物或聚合物區(qū)段。PNA亞單位與核酸亞單位可通過共價鍵或接頭彼此相連。例如，PNA/DNA嵌合體可包含通過化學鍵與至少一個2，-脫氧核糖核酸亞單位共價相連的至少兩個PNA亞單位(PNA嵌合體制備相關的示范性方法和組合物參見美國專利6,063,569)。出于本發(fā)明的目的，PNA嵌合體包含不同類型核堿基亞單位(例如，PNA、DNA、RNA)的組合，但僅僅摻入氨基酸亞單位(例如甘氨酸)或一個或多個標記或接頭并不表示某寡聚物是PNA嵌合體。此外，為避免任何疑問，出于解釋本說明書的目的，核苷或核苷酸不是垸基、亞烷基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團。i.本文所用的"序列特異性"指通過氫鍵經(jīng)堿基配對進行雜交。標準堿基配對的非限制性例子包括腺嘌呤與胸腺啼啶或尿啼啶堿基配對，鳥嘌呤與胞啼啶堿基配對。堿基配對基序的其它非限制性例子包括但不限于腺嘌呤與以下任一種堿基配對5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶或2-硫胸腺嘧啶；鳥嘌呤與以下任一種堿基配對5-甲基胞嘧啶或假異胞啼啶；胞瞎啶與以下任一種堿基配對次黃嘌呤、N9-(7-脫氮雜-鳥嘌呤)或N9-(7-脫氮雜-8-氮雜-鳥嘌呤)；胸腺嘧啶或尿嘧啶與以下任一種堿基配對2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)或N9-(2,6-二氨基嘌呤)；和N8-(8-A-7-DAA)(—種通用堿基)，與任何其它核堿基堿基配對，例如腺嘌呤、胞啼啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假異胞啼啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黃嘌呤或N9-(7-脫氮雜-鳥嘌呤)。j.本文所用的術語"連接的聚合物"指含有通過接頭(linker)相連的兩個或多個聚合物區(qū)段的多核堿基鏈?？上噙B形成連接的聚合物的聚合物區(qū)段可以是寡聚脫氧核苷酸、寡聚核糖核苷酸、肽、聚酰胺、肽核酸(PNA)或PNA嵌合體。在一些實施方式中，PNA嵌合體可以是多核堿基鏈，其中該寡聚物的PNA部分通過接頭與該寡聚物的核酸(NA)部分相連。為避免任何疑問，連接的聚合物指包含一個C-末端和一個N-末端的聚合物。k.本文所用的術語"烷基"指可完全飽和的直鏈或支鏈C2-d5烴或環(huán)狀C3-C^烴(即，環(huán)烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)己基亞甲基)。用于本文時，術語"垸基"可以指取代或未取代的基團。用于本文時，"垸基"還指其中取代或未取代的亞甲基的一個或多個碳原子被硅原子(Si)替代的垸基。在一些實施方式中，烷基可以是可完全飽和的直鏈或支鏈C2-d2烴或環(huán)狀C3-Ci0經(jīng)。1.本文所用的術語"亞垸基"指在至少兩個連接點與至少兩個部分相連的直鏈或支鏈垸基鏈或環(huán)狀烷基，(例如，-罪2}-(亞甲基)、-{CH2CH2}-，(亞乙基)其中括號表明連接點。用于本文時，術語"亞垸基"可以指取代或未取代的基團。在一些實施方式中，亞烷基可以是CVd。烴。m.本文所用的術語"烯基"指具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈C2-C15烴或環(huán)狀Crd5烴。用于本文時，術語"烯基"可以指取代或未取代的基團。出于本說明書的目的，"烯基"還可指其中取代或未取代的亞甲基的一個或多個碳原子被硅原子(Si)替代的烯基。在一些實施方式中，烯基可以是具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈C2-C12烴或環(huán)狀C3-C1Q烴。n.本文所用的術語"炔基"指具有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈C2-d5烴或環(huán)狀CVd5烴。用于本文時，術語"炔基"可以指取代或未取代的基團。出于本說明書的目的，"炔基"還可指其中取代或未取代的亞甲基的一個或多個碳原子被硅原子(Si)替代的炔基。在一些實施方式中，炔基可以是具有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈C2-C12烴或環(huán)狀C3-C1D烴。o.本文所用的術語"雜垸基"指烷基鏈中的一個或多個亞甲基被-O-或-S-替代的垸基。用于本文時，術語"雜烷基"指可以取代或未取代的基團。p.本文所用的術語"雜烯基"指其中一個或多個亞甲基被-O-或-S-替代的烯基。用于本文時，術語"雜烯基"指可以取代或未取代的基團。q.本文所用的術語"雜炔基"指其中一個或多個亞甲基被-O-或-S-替代的炔基。用于本文時，術語"雜炔基"指可以取代或未取代的基團。r.本文所用的術語"雜環(huán)烴"指含有一個或多個氧和/或硫原子的非芳族烴環(huán)。本文所用的術語"雜環(huán)烴"指可以取代或未取代和/或飽和或不飽和的基團。本文所用的烷基、亞甲基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基、雜環(huán)烴基團不含芳族取代基。在此例外的情況下，垸基、亞甲基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜環(huán)烴基團可包含在本發(fā)明實施方式所用反應條件下穩(wěn)定的任何其它取代基。合適取代基的非限制性例子包括烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)己基等)、鹵代垸基(例如，三氟甲基、2,2,2-三氟乙基-)、垸氧基(例如，甲氧基、乙氧基等)、氰基或鹵素(例如，氟、氯、溴和碘)基團。s.本文所用的"氨基酸"指R"'-NH-CH(R"")-C(O)-R"'所表示的基團，其中各R"'獨立為氫、脂族基團、取代的脂族基團、芳族基團、另一種氨基酸、肽或取代的芳族基團。"天然存在的氨基酸"是在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和組氨酸。為解釋本說明書，"天然產(chǎn)生的氨基酸"包括用于將可檢測部分與PNA寡聚物間接相連的天然產(chǎn)生的氨基酸。在一些實施方式中，R""可以是氫或天然存在氨基酸的側(cè)鏈。天然存在的氨基酸側(cè)鏈的例子包括甲基(丙氨酸)、異丙基(纈氨酸)、仲丁基(異亮氨酸)、-CH2CH(-CH3)2(亮氨酸)、芐基(苯丙氨酸)、對羥基芐基(酪氨酸)、-CH2-OH(絲氨酸)、-CHOHCH3(蘇氨酸)、-012-3-吲哚基(色氨酸)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2CH2COOH(谷氨酸)、-CH2C(0)NH2(天冬酰胺)、-CH2CH2C(0)NH2(谷氨酰胺)、-(^2811(半胱氨酸)、-CH2CH2SCH3(甲硫氨酸)、-(CH2)4NH2(賴氨酸)、-(CH2)3NH2(鳥氨酸)、-{(CH)2}4NHC(=NH)NH2(精氨酸)和-CHr3-咪唑基(組氨酸)。包含含雜原子的官能團的氨基酸側(cè)鏈可能需要保護基團以促進本文所述的反應，所述含雜原子官能團例如是醇(絲氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸和蘇氨酸)、胺(賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸和精氨酸)。當修飾含雜原子的官能團以使之包含保護基團時，側(cè)鏈稱為氨基酸的"受保護側(cè)鏈"。保護基團在肽合成中很常用，并且普通技術人員知道并常用這些保護基團。例如，許多合適的保護基團和制備受保護氨基酸的方法可見Green等，ProtectingGroupsInOrganicSynthesis(《有機合成中的保護基團》)，第三版，約翰威利父子有限公司(JohnWiley&Sons,Inc.),紐約，1999。t.本文所用的術語"標記"指與PNA寡聚物相連的任何附加物。術語"標記"包括諸如"報道部分"或"可檢測部分"等術語。出于本說明書的目的，標記還可指與PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基直接或間接共價相連的垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團。u.本文所用的術語"報道部分"和"可檢測部分"可互換，其指可與多核堿基鏈相連從而能用某儀器或方法檢測該寡聚物的部分。例如，標記可以是任何標記(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記相互作用從而能修飾由第一或第二標記提供的可檢測信號；或(iii)賦予捕捉功能，即疏水性親和力、抗體/抗原、離子絡合作用。v.本文所用的"猝滅"指因猝滅劑部分相關的能量轉(zhuǎn)移導致熒光部分的熒光降低，而無論其機制。w.本文所用的"支持物結(jié)合"指固定在供固體支持物上或與之結(jié)合的PNA寡聚物。x.本文所用的"固體支持物"或"固體載體"表示在其上合成、結(jié)合、連接或以其它方式固定了PNA寡聚物的任何固相材料。固體支持物包括諸如"樹脂"、"固相""表面"和"支持物"等術語。固體支持物可包括有機聚合物，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧基(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及它們的共聚物和接枝物(graft)。固體支持物還可以是無機的，例如玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反向二氧化硅(reverse-phasesilica)。固體支持物的結(jié)構(gòu)可以是珠狀、球形、顆粒、凝膠或表面的形式。表面可以是平面、基本上平面或非平面。固體支持物可以是多孔或無孔的，還可居于膨脹特性或非膨脹特性?？蓪⒐腆w支持物構(gòu)建成孔、凹陷或其它容器、導管(vessel)、元件的形式或構(gòu)建在特定位置?？蓪⒍鄠€固體支持物構(gòu)建在陣列中對于試劑的機器人遞送可尋址的各種位置，或通過檢測裝置，包括用激光照射和共聚焦或偏轉(zhuǎn)光(deflectivelight)收集來掃描。y."陣列"或"微陣列"表示固體支持物上存在的寡聚物預定空間配置或?qū)Ч艿呐渲?。某些陣列形式稱為"芯片"或"生物芯片"(M.Schena編，《微陣列生物芯片技術》(MicroarrayBiochipTechnology),《生物技術叢書》(BioTechniqueBooks),伊頓出版公司(EatonPublishing),內(nèi)蒂克，馬薩諸塞州，(2000))。陣列可包含低密度數(shù)量的可尋址位置，例如2-約12處，中等密度，例如約100或更多處位置，或高密度數(shù)量，例如一千或更多處。陣列形式通常是能生產(chǎn)、處理、安置、堆放、試劑引入、檢測和保存的規(guī)則幾何形狀?？蓪㈥嚵袠?gòu)建成行列形式，各位置之間間隔規(guī)則。或者，可使各位置聚集(bundle)、混合或均勻摻合從而能均衡處理或取樣。對于高通量處理、機器人遞送、掩蔽或試劑取樣，或通過檢測裝置，包括用激光照射和共聚焦或偏轉(zhuǎn)光收集來掃描，可將陣列構(gòu)建成包含多個可尋址位置，從而各位置在空間上可尋址。i鵬/.縱應該知道以下"概述"章節(jié)中的討論屬于各種本發(fā)明實施方式的一些或全部。PNA合成已知化學組裝PNA的方法(參見，例如美國專利5,539,082;5,527,675;5,623,049;5,714,331;5,718,262;5,736,336;5,773,571;5,766,855;5,786,461;5,837,459;5,891,625;5,972,610;5,986,053禾B6,107,470)。PNA合成方法的通用參考文獻見Nielsen等，PeptideNucleicAcids;ProtocolsandApplications(《肽核酸方法與應用》)，地平線科學出版社(HorizonScientificPress),諾?？?，英格蘭，(1999)。用于肽核酸的支持物結(jié)合自動化學組裝(supportboundautomatedchemicalassembly)的化學試劑和儀器可以購得。類似地，標記和未標記的PNA寡聚物可以購自定制PNA寡聚物(customPNAoligomer)的商業(yè)供應商?；瘜W組裝PNA類似于固相肽合成，其中在每輪組裝中，寡聚物具有反應活性的垸基氨基末端，該末端可與要加入增長中的聚合物的下一合成子縮合。由于采用標準肽化學方法，可以將天然和非天然氨基酸常規(guī)地摻入PNA寡聚物。因為PNA是聚酰胺，其具有C-末端(羧基末端)和N-末端(氨基末端)。根據(jù)所選擇的合成方法，所述C-末端可以是C-末端羧酸或C-末端酰胺(見圖2)。為了設計適合與靶序列反平行結(jié)合(優(yōu)選的取向)的雜交探針，PNA探針的檢測性核堿基序列的N-末端相當于等價DNA或RNA寡核苷酸的5'-羥基末端。然而，雜交的取向不是限制條件，因為已知PNA寡聚物還能以平行取向與核酸和其它PNA寡聚物結(jié)合。PNA標記-標記PNA的非限制性方法描述于美國專利6,110,676;6,355,421;6,361,942和6,485,901或是PNA合成領域已知的其它方法。標記PNA寡聚物的其它非限制性例子見Nielsen等，《肽核酸方法與應用》，地平線科學出版社，諾?？耍⒏裉m，(1999)。如美國專利6,197,513所述，還可用蛋白質(zhì)(例如，酶)和肽標記PNA寡聚物和寡核苷酸。因此，可制備或從商業(yè)供應商購得各種標記的PNA寡聚物。本文所用的"PNA標記"包括將至少一個垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團與PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連。標記PNA的各種方法描述于圖3A-3C。由于化學合成裝配物的方法基本上相同，用于標記肽的任何方法常適用于標記PNA寡聚物。通常可將聚合物的N-末端與具有羧酸基團或活化的羧酸基團的部分反應來標記(圖3A)?？扇芜x將間隔部分引入寡聚物的標記部分和含有亞單位的核堿基之間。通?？上葥饺腴g隔部分再進行標記反應。如果需要，可將間隔部分包埋在標記內(nèi)，從而能在標記反應期間摻入。還可通過垸化氨基來修飾N-末端。烷化反應是熟知的，可在堿性條件下用標記試劑的鹵化物(例如，乙基溴)處理胺來實現(xiàn)(圖3B)?？衫^續(xù)烷化從而能垸化胺兩次。因此，在一些實施方式中，胺垸化一次，在一些實施方式中，胺烷化兩次?？稍趯NA寡聚物裝配到支持物上后，首先縮合標記部分或功能基團部分與該支持物來標記聚合物的C-末端(例如，參見圖3C)。隨后可將PNA寡聚物的含第一核堿基的合成子與標記部分或官能團部分縮合?；蛘?，可將一個或多個間隔部分(例如，8-氨基-3,6-二嚼、辛酸；"O-接頭")引入標記部分或官能團部分和寡聚物的第一核堿基亞單位之間。一旦通過反復的單體加入、N-末端標記和/或修飾完成了分子制備，可采用標準方法將其從支持物上切割下來，脫保護并純化。在PNA寡聚物完全裝配并從支持物上切割下來后，還可采用另一種方法將標記與其相連。當標記與常規(guī)用于制備寡聚物的切割、脫保護或純化方案不相容時，可應用該方法。通常采可如圖3A-3C所示進行標記，除了標記反應在溶液中發(fā)生并且PNA寡聚物并未與支持物相結(jié)合。采用該方法可將聚合物上的官能團與標記上的官能團反應，從而能在溶液中標記PNA寡聚物。本領域普通技術人員知道偶聯(lián)溶液的組成應取決于寡聚物和標記，例如供體或接受體部分的性質(zhì)。溶液可包含有機溶劑、水或它們的任何組合。有機溶劑通常是極性非親核性溶劑。合適的有機溶劑的非限制性例子包括乙腈(ACN)、四氫呋喃、二嗯垸、甲基亞砜、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。待標記的聚合物上官能團可以是親核的(例如，氨基，如N-末端氨基)，標記上的官能團可以是親電的(例如，羧酸或活化的羧酸(S卩，C-末端羧酸))。然而，也考慮情況是相反的，聚合物上的官能團可以是親電的(例如，羧酸或活化的羧酸)，標記上的官能團可以是親核的(例如，氨基酸基團)?；罨聂人峁倌軋F的非限制性例子包括N-羥基琥珀酰亞胺酯。在水溶液中，可用水溶性碳二亞胺活化PNA或標記的羧酸基團(根據(jù)所選擇組分的性質(zhì))。試劑，l-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)是為水性酰胺形成縮合反應而專門出售的可購得試劑。當l-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)或1-羥基苯并三唑(HOBt)與EDC混合時，申請人:類似地觀察到這種縮合反應。在縮合反應期間可用緩沖液調(diào)節(jié)水溶液的pH。例如，縮合期間的pH可以是約4-約10。一般可通過加入非親核性有機堿來調(diào)節(jié)非水性反應的堿度。合適的堿的非限制性例子包括N-甲基嗎啉、三乙胺和N，N-二異丙基乙胺?；蛘撸捎蒙飳W緩沖液，例如(N-[2-羥乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)或4-嗎啉乙磺酸(MES)或無機緩沖液，例如碳酸氫鈉來調(diào)節(jié)pH。核酸合成與修飾多年來，核酸寡聚物(寡核苷酸和寡聚核糖核苷酸)合成是慣常的。核酸合成的詳述可參見Gait,M.J，OligonucleotideSynthesis:aPracticalApproach(《寡核苷酸合成實用方法》)，IRL出版社(IRLPress),牛津，英格蘭。本領域普通技術人員知道可方便地獲得標記和未標記的寡核苷酸(DNA、RNA及其合成類似物)?？衫檬惺鄣膬x器和試劑合成它們，或者可從定制生產(chǎn)寡核苷酸的商業(yè)供應商處購得。PNA嵌合體合成與修飾PNA嵌合體是核酸與肽核酸亞單位的組合體。合成、標記和修飾PNA嵌合體的合適參考可參見美國專利6,063,569。此外，?？刹捎蒙鲜鯬NA合成與標記的方法來修飾PNA嵌合體的PNA部分。另外，?？刹捎煤铣膳c標記核酸的已知方法來修飾PNA嵌合體的核酸部分。因此，合成、標記與修飾PNA嵌合體可利用本領域技術人員已知的方法以及上述方法或參考上述方法。標記物PNA寡聚物(包括PNA嵌合體)可含有至少一個可檢測部分?？捎糜跇擞浂嗪藟A基鏈(例如，PNA寡聚物)的可檢測部分的非限制性例子包括葡聚糖偶連物、支鏈核酸檢測系統(tǒng)、生色團、熒光團、自旋標記、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯或化學發(fā)光化合物。PNA、肽或核酸合成領域的普通技術人員已知其它合適的標記試劑和優(yōu)選的連接方法。半抗原的非限制性例子包括5(6)-羧基熒光素、2,4-二硝基苯基、異羥洋地黃毒苷配基(digoxigenin)和生物素。熒光染料(熒光團)的非限制性例子包括5(6)-羧基熒光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙?；?氨基)己酸(Cou)、5(和6)-羧基-X-羅丹明(Rox)、花青2(Cy2)染料、花青3(Cy3)染料、花青3.5(Cy3.5)染料、花青5(Cy5)染料、花青5.5(Cy5.5)染料、花青7(Cy7)染料、花青9(Cy9)染料、(花青染料2、3、3.5、5和5.5可以NHS酯的形式購自伊利諾斯州阿靈頓山莊的阿姆山姆公司(Amersham))或為艾歷克薩(Alexa)染料系列(分子探針公司(MolecularProbes),尤金市，俄勒岡州)。酶的非限制性例子包括聚合酶(例如，Taq聚合酶、KlenowDNA聚合酶、T7DNA聚合酶、測序酶(Sequenase)、DNA聚合酶1和phi29聚合酶)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)、大豆過氧化物酶(SBP))、核糖核酸酶和蛋白酶。間隔(spacer)/接頭部分PNA寡聚物(包括PNA嵌合體)可包含間隔和/或接頭部分。通?？捎瞄g隔部分最大程度地降低大量標記試劑可能對探針的雜交特性產(chǎn)生的不利作用。接頭通常能在多核堿基鏈中誘導柔韌性和無序性(randomness)，或者能連接多核堿基鏈的兩條或多條核堿基序列。本文所述多核堿基鏈的優(yōu)選間隔/接頭部分可包含一個或多個氨基烷基羧酸(例如，氨基己酸)、氨基酸的側(cè)鏈(例如，賴氨酸或鳥氨酸的側(cè)鏈)、天然氨基酸(例如，甘氨酸)、氨基氧基烷基酸(aminooxyalkylacid)(例如，8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)、烷基二酸(例如，琥珀酸)、垸氧基二酸(例如，二乙醇酸)或垸基二胺(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛垸)。還可偶然或有意構(gòu)建間隔/接頭部分來提高多核堿基鏈的水溶性(例如，可參見Gildea等，Tett.Lett39:7255-7258(1998)和美國專利6,326,479和6,770,442)。例如，間隔/接頭部分可包含一個或多個相連的式-Q-(Om-(CM2))o-T-所示化合物?；鶊FQ可選自下組單鍵、-(CM2)p-、-C(0)(CM2)P-、-C(S)(CM2)P^P-S(02)(CM2)p-?；鶊FT可如式NH、NR""'、S、-SOr或O所示。各M可以獨立為H、R'""、-OR'""、F、Cl、Br或I;其中各R"'"可以獨立選自下組-CV3、-CV2CV3、-CV2CV2CV3、-CV2CV(CV3)2和-C(CV3)3，其中各V可以獨立為氫(H)、氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(1)。各m可以獨立為O或l。各n、o和p可以獨立為0-10的整數(shù)。在一些實施方式中，各n、o和p可以獨立為0-3的整數(shù)。能量轉(zhuǎn)移雜交分析中可采用能量轉(zhuǎn)移。對于用于測定雜交的能量轉(zhuǎn)移，應有包含至少一個能量轉(zhuǎn)移供體和至少一個能量轉(zhuǎn)移接受體部分的能量轉(zhuǎn)移組。例如，可如美國專利6,326,479;6,355,421或6,485,901所述標記自動指示(self-indicating)的PNA寡聚物。能量轉(zhuǎn)移組常包含一個能量供體部分和一個接受體部分，但不是限制性的。能量轉(zhuǎn)移組可包含多個供體部分和/或多個接受體部分。供體和接受體部分的操作應使得一個或多個接受體部分接受從一個或多個供體部分轉(zhuǎn)移的能量或者猝滅一個或多個供體部分的信號。因此，在一些實施方式中，一個或多個供體部分和一個或多個接受體部分是熒光團。雖然上述熒光團(具有合適的光譜特性)還可用作能量轉(zhuǎn)移接受體，但接受體部分還可以是猝滅劑部分，例如4-((-4-(二甲基氨基傳基)偶氮)苯甲酸(dabcyl)?？蓪⒛芰哭D(zhuǎn)移組的標記連接在寡聚物嵌段末端(blocktermini)或連接在PNA寡聚物內(nèi)某位點。在一個實施方式中，能量轉(zhuǎn)移組的兩標記可以各自連接在PNA寡聚物的最遠末端。含有供體和接受體部分的PNA寡聚物還可包含至少一個連接的氨基酸，該氨基酸含有在生理pH下荷電的基團。供體和接受體部分之間的能量轉(zhuǎn)移可經(jīng)由任何能量轉(zhuǎn)移過程發(fā)生，例如通過一個或多個能量轉(zhuǎn)移組的緊密相關部分的碰撞或經(jīng)由非輻射性過程，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。為發(fā)生FRET，能量轉(zhuǎn)移組的供體部分和接受體部分之間的能量轉(zhuǎn)移要求這些部分在空間上封閉，并且一個或多個供體的發(fā)射光譜基本上與一個或多個接受體的吸收光譜重疊(參見Yaron等，AnalyticalBiochemistry,95:228-235(1979)，具體是第232頁，巻1到第234頁，巻1)?；蛘撸诜浅＞o密相關的供體和接受體部分之間可發(fā)生碰撞介導的(非輻射的)能量轉(zhuǎn)移，而無論一個或多個供體部分的發(fā)射光譜是否基本上與一個或多個接受體部分的吸收光譜重疊(參見Yaron等，AnalyticalBiochemistry,95:228-235(1979)，具體是第229頁，巻l到第232頁，巻l)。該過程稱為分子內(nèi)碰撞，因為據(jù)信供體部分與接受體部分直接接觸導致猝滅(參見Yaron等)。應該知道本申請中述及的任何能量轉(zhuǎn)移包括這些機制不同的所有現(xiàn)象。還應知道能量轉(zhuǎn)移可以通過多種能量轉(zhuǎn)移過程同時發(fā)生，可檢測信號的變化可以是兩種或多種能量轉(zhuǎn)移過程活性的量度。應該知道能量轉(zhuǎn)移還可通過尚未描述的機制發(fā)生。因此，能量轉(zhuǎn)移的機制不限制本發(fā)明。檢測自動指示的PNA寡聚物中的能量轉(zhuǎn)移在一些實施方式中，PNA寡聚物是自動指示的。例如，可如美國專利6,326,479;6,355,421或6,485,901所述的方式標記自動指示的PNA寡聚物。自動指示的聚合物的各種例子可見圖4C-4F。從這些附圖可見，疏水基團、能量接受體部分和能量接受體部分可能有各種實施方式。在一些實施方式中，還可加入包含荷電基團的氨基酸(圖4F)。這些荷電基團能形成穩(wěn)定處于特定構(gòu)型的未雜交寡聚物的鹽橋。從各種附圖中可見，能量供體和能量接受體可以位于任一端，但通常處于PNA寡聚物的相反端?？赏ㄟ^檢測能量轉(zhuǎn)移組中至少一員的至少一種可檢測特性來監(jiān)測自動指示PNA寡聚物和多核堿基鏈之間的雜交體形成，與未雜交狀態(tài)的PNA寡聚物存在時相比，所述至少一種特性在PNA寡聚物/NA復合物形成時檢測有差異。我們將該現(xiàn)象稱為PNA寡聚物的自動指示特性?？蓹z測信號中的這種變化是因PNA寡聚物與核酸序列雜交導致供體和接受體部分之間能量轉(zhuǎn)移的效率產(chǎn)生變化所致。例如，檢測方法可包括測量能量轉(zhuǎn)移組的供體或接受體熒光團的熒光。例如，能量轉(zhuǎn)移組可包括至少一個供體熒光團和至少一個接受體(熒光或無熒光的)猝滅劑，從而能用供體熒光團的熒光測量值來檢測、鑒定和/或定量測定PNA寡聚物與核酸序列的雜交。在一些實施方式中，能量轉(zhuǎn)移組包括至少一個供體熒光團和至少一個接受體，從而能用至少一個供體部分或一個接受體部分，或二者的熒光測量值來檢測、鑒定和/或定量測定PNA寡聚物與核酸的雜交。可檢測和獨立可檢測的部分/多重分析一些實施方式進行了多重雜交試驗。多重試驗可同時或順序檢測感興趣的多種條件。多重分析取決于試驗期間或在試驗完成后分類樣品組分或與其相關的數(shù)據(jù)。進行多重試驗時，可用一種或多種獨立可檢測的不同部分標記試驗所用的兩種或多種不同PNA寡聚物。我們用"獨立可檢測"表示可能在其它可檢測部分存在的情況下和不用依賴于其它可檢測部分存在的情況下測定一種可檢測部分。能在各獨立可檢測的部分之間進行區(qū)分和/或能定量測定各獨立可檢測的部分為多重雜交試驗提供了一種手段，因為數(shù)據(jù)與各種不同的獨立標記的PNA寡聚物和樣品中要測定的具體靶序列的雜交情況相關聯(lián)。因此，例如可用多重試驗同時和/或順序檢測同一樣品中和同一試驗中兩種或多種耙序列的存在、不存在、數(shù)量、位置和/或身份。//.本發(fā)猶吝神微方式申請人發(fā)現(xiàn)將一個或多個垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基和/或雜環(huán)烴基團直接或間接共價連接于PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳能顯著提高PNA寡聚物/NA復合物的Tm。PNA寡聚物/核酸復合物(PNA寡聚物/NA復合物)的熱穩(wěn)定性(Tm)提高取決于所連接的一個或多個基團的性質(zhì)、數(shù)量和位置。因此，可根據(jù)與PNA寡聚物相連的基團的性質(zhì)、數(shù)量和位置調(diào)節(jié)復合物的Tm。Tm的升高看來基本上不取決于PNA寡聚物的序列。因此，將相同的取代基連接在長度相同的兩種或多種PNA寡聚物上的相同位置應將該PNA寡聚物與其互補的多核堿基鏈之間形成的復合物的Tm提高大致相同的攝氏度數(shù)值。因此，可制備各PNA寡聚物、PNA寡聚物組和/或PNA寡聚物文庫，從而能以基本上可預測的方式調(diào)節(jié)(例如，提高)PNA寡聚物與互補多核堿基鏈的Tm。在一些實施方式中，申請人觀察到與未修飾的PNA寡聚物/NA復合物相比，修飾的PNA寡聚物/NA復合物的Tm升高，即超出1(TC(參見，實施例2和表格)。因此，可能構(gòu)建包含或不包含通用核堿基的8-聚體和/或9-聚體文庫，這些文庫可用于大規(guī)模遺傳學分析項目以及用于其它探針試驗方式。a.組合物因此，在一些實施方式中，本發(fā)明涉及一種PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙酰基或末端連接的天然氨基酸的側(cè)鏈。在一些實施方式中，所述基團可包含取代或未取代的環(huán)狀烴。例如，各基團可包含取代或未取代的環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。為避免任何疑問，當我們述及相連的基團(無論直接或間接的)時，不表示是PNA寡聚物的一部分的基團(例如，PNA骨架結(jié)構(gòu)的組分或與PNA骨架的氮(除N-末端氨基以外灘連的配基)，例如包含環(huán)己基的PNA亞單位(例如，Lagriffoule等，Chem.Eur.J.3(6):912-919(1997))。一些實施方式還適用以下條件的一條或多條。在一些實施方式中，各基團不是類固醇。在一些實施方式中，各基團在生理pH下不帶電荷。在一些實施方式中，各基團在生理pH下不包含堿性氮。在一些實施方式中，各基團直接與N-末端氨基和/或C-末端羰基碳相連(例如，該基團不與連接的氨基酸殘基結(jié)合)。在一些實施方式中，該基團不是用于連接PNA寡聚物與固體支持物的接頭。在一些實施方式中，一個或多個基團間接連接于N-末端氨基和/或C-末端羰基碳(參見圖3A-4F)。例如，一個或多個連接的基團可以是非天然氨基酸，例如P-環(huán)己基丙氨酸的側(cè)鏈(例如，圖4A、4C、4D、4E和4F)。在該實施方式中，基團是環(huán)己基亞甲基。一些合適基團的非限制性例子如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>其中各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-80乂3或-00乂3，其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I。參考上述結(jié)構(gòu)，在一些實施方式中，基團中式C(J')2所示的一個或多個部分可任選用式C=0、C=S、S或O所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分可任選用下式所示部分取代:只要取代時該基團不是芳族的，并且該基團不是下式所示sh、ch3或^Sh3。在一些實施方式中，PNA寡聚物包含與N-末端氨基直接相連的一個或多個上述基團(例如，圖3B和4B(化合物I和II))?？梢酝ㄟ^直接烷化所述胺將這些基團直接連接于末端氨基。在一些實施方式中，直接或間接連接于N-末端氨基的基團可如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>其中各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-8〔乂3或-0〔乂3，其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I;其中W是O或S(例如，圖3A、4A、4B(化合物I)和4D)。參考上述結(jié)構(gòu)，在一些實施方式中，基團中式C(J')2所示的一個或多個部分可任選用式C=0、C=S、S或0所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>可任選用下式所示部分取代:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>只要取代時該基團不是芳族的。在一些實施方式中，PNA寡聚物包含C-末端羧酸基團。在一些實施方式中，如果需要，C-末端羧酸基團可以用于連接PNA寡聚物，從而形成寡聚物組合體(參見美國專利申請公布2003-0077608)，其可用于將PNA寡聚物固定于支持物上或者其可用于將標記(例如，基團)與PNA寡聚物相連(圖3D)。在一些實施方式中，PNA寡聚物包含與C-末端羰基碳直接相連的一個或多個基團(例如，圖3D、3E、4E和4F)。例如，與C-末端羰基碳直接相連的基團如下式所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>其中，K'是N、O或S，各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX3，其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I;其中如果K'是O或S，則w不存在(g卩，K'未共價連接有基團)，但如果K'是N，則w是氫或垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團。參考上述結(jié)構(gòu)，在一些實施方式中，基團中式C(J')2所示的一個或多個部分可任選用式C=0、C=S、S或0所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分只要取代時該基團不是芳族的。如上所述，在一些實施方式中，一個或多個基團連接于N-末端氨基，在一些實施方式中，一個或多個基團連接于C-末端羰基碳，在一些實施方式中，一個或多個基團連接于N-末端氨基和C-末端羰基碳。在一些實施方式中，兩個或多個相同或不同的基團連接于N-末端氨基。在一些實施方式中，兩個或多個相同或不同的基團連接于c-末端羰基碳。在一些實施方式中，兩個或多個相同或不同的基團各自連接于N-末端氨基和C-末端羰基碳。這些基團可以直接或間接連接。此外，這些基團可以連接于其它部分，例如一個或多個可檢測的部分。存在其它部分時，可將各種基團和部分連接于各種位置(例如，圖4A-4F)。在一些實施方式中，PNA寡聚物還可包含至少一種可檢測部分(例如，圖4B)。在一些實施方式中，PNA寡聚物還可包含至少一個能量供體和至少一個能量接受體部分(例如，圖4C-4F)。包含至少一個能量供體部分和至少一個能量接受體部分的探針可以是自我指示的，可用于實時和終點雜交分析和多重雜交分析(例如，參見美國專利6,355,421和6,485,901)。在一些實施方式中，PNA寡聚物還可包含至少一個天然氨基酸，所述氨基酸包含在生理pH下帶電荷的基團。例如，PNA寡聚物可包含一個或多個包含酸性側(cè)鏈(例如，羧酸基團)的氨基酸和/或一個或多個包含堿性側(cè)鏈(例如，氨基)的氨基酸(例如，圖4F)。在一些實施方式中，PNA寡聚物可包含至少一個通用核堿基(例如，圖1B)。在一些實施方式中，PNA寡聚物可包含至少一個二氨基嘌呤核堿基(例如，圖1B)。在一些實施方式中，PNA寡聚物是包含一個或多個連接的C-末端核苷或核苷酸的PNA嵌合體?？捎镁酆厦秆由彀粋€或多個連接的C-末端核苷或核苷酸的PNA嵌合體(參見美國專利6,316,230)。因此，可將它們用于各種類型的遺傳學可任選用下式所示部分取代:分析，例如DNA測序、DNA片段分析、逆轉(zhuǎn)錄、微測序(mini-sequencing)、染色體標記、擴增和單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測。在一些實施方式中，可制備兩種或多種PNA寡聚物的文庫。例如，可制備8-聚體或9-聚體文庫，其中PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。在一些實施方式中，文庫的PNA寡聚物可在雜交試驗中用作探針和/或引物。在一些實施方式中，可將文庫的PNA寡聚物用于連接反應，從而產(chǎn)生了可在雜交試驗中用作探針和/或引物的較長PNA寡聚物(參見，例如美國專利申請公布2003-0077608)。在一些實施方式中，可將本文所述的PNA寡聚物連接于固體支持物(例如，圖3E)。在一些實施方式中，可利用本文所述的一種或多種PNA寡聚物形成陣列。與支持物結(jié)合的PNA寡聚物在雜交試驗中可用作探針和/或引物。b.方法申請人觀察到PNA寡聚物/NA復合物的解鏈溫度(TJ的升高與N-末端連接的基團的疏水性有關系。這些基團既與C-末端又和N-末端相連進一步提高了Tm。Tm的升高基本上不依賴于參與的寡核苷酸序列，在很大程度上取決于通過l0gP。et(即，化合物在辛醇-水提取中的分配系數(shù))檢測的N-末端連接基團疏水性。圖6顯示了可與PNA寡聚物相連的各種可能基團，以及它們在logP。et量表上的關系。因此，Tm的升高取決于連接PNA寡聚物的基團的性質(zhì)、數(shù)量和位置。此外，存在其它基團，例如熒光團和荷電的部分也能影響(5卩，升高或降低)PNA寡聚物和互補的多核堿基鏈所形成復合物的Tm，從而可能會限制(marginalizing)附加的疏水性基團的影響。本質(zhì)上，將垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團連接于PNA寡聚物類似于標記。可通過實施用于標記的標準合成方法(例如，參見上文標題為"PNA標記"的章節(jié))與適當修飾的基團將一個或多個基團共價連接于PNA寡聚物來產(chǎn)生上文標題為"組合物"的章節(jié)中所述的PNA寡聚物。例如，N-末端可以與氨基酸反應，垸化或與含活化羧酸的基團反應。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明還涉及形成一種PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。上述PNA寡聚物組合物在雜交試驗中可用作探針和/或引物。PNA探針/引物可與互補多核堿基鏈雜交，從而形成復合物。例如，PNA探針/引物可以與核酸雜交，從而形成PNA寡聚物/NA復合物。因此，本發(fā)明還涉及一種方法，該方法包括形成PNA寡聚物/NA復合物，其中該PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙酰基或末端連接的天然氨基酸的側(cè)鏈。如上所述，相比于從未修飾的PNA寡聚物形成的復合物，與PNA寡聚物相連的基團的性質(zhì)、數(shù)量和位置會影響多核堿基鏈所形成復合物的Tm。申請人觀察到對Tm調(diào)節(jié)的作用看來基本上不依賴于PNA寡聚物的核堿基序列。因此，只要獲得了各種基團是如何影響Tm的基本信息，通過明智地選擇要連接到PNA寡聚物上的一個或多個基團便能以可預測的方式調(diào)節(jié)PNA寡聚物的Tm?？赏ㄟ^常規(guī)實驗獲得這種信息。例如，可以制備各種形式的修飾PNA寡聚物并測定Tm。由于Tm的調(diào)節(jié)基本上不依賴于核堿基序列，可能用獲自對照實驗的信息來合理預測存在一個或多個基團對各種其它PNA寡聚物的Tm的影響，所述其它PNA寡聚物根據(jù)獲得實驗數(shù)據(jù)的那些(實驗)進行修飾。因此，本發(fā)明還涉及一種方法，該方法包括通過給含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或間接共價連接至少一個垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，所述基團連接于用于形成PNA寡聚物/NA復合物的PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳，前提是所述基團不是乙酰基或末端連接的天然氨基酸的側(cè)鏈，從而以基本上可預測的方式調(diào)節(jié)該PNA寡聚物/NA復合物的Tm。我們用"基本上可預測的"表示可預測在+Al-2。C以內(nèi)。C.試齊U盒在一些實施方式中，本發(fā)明還涉及一種裝有PNA寡聚物的試劑盒，該寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含直接或間接共價連接于該PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳的至少一個垸基、烯基、炔基、雜垸基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。所述試劑盒可以為特定雜交試驗設計。例如，該試劑盒可以為PCR分析設計。這種PCR試劑盒可裝有PNA寡聚物和選擇用于實施PCR試驗的其它試劑，混合物和/或組合物。例如，該試劑盒可裝有聚合酶和核苷酸三磷酸。如果該試劑盒要用于測序，可能還裝有二脫氧終止子(dideoxyterminator).^實施例借鑒以下實施例可進一步理解本發(fā)明的各方面，這些實施例不應理解為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。實施例1合成了兩種PNA來驗證調(diào)節(jié)Tm的構(gòu)思可應用于PNA寡聚物。一種PNA寡聚物經(jīng)乙酰化(化合物III，圖5),第二種經(jīng)環(huán)己基丁基化(化合物IV，圖5)。PNA寡聚物早已乙?；用保瑥亩鴮阴；脑揚NA寡聚物選為對照。與對照相比，檢測對Tra的調(diào)節(jié)來確定較長垸基相關的作用。利用快速PNA合成儀(ExpeditePNAsynthesizer),采用標準Fmoc方法合成PNA寡聚物。修飾N-末端(加入乙?；颦h(huán)己基丁基)，同時維持PNA寡聚物仍與支持物結(jié)合。在兩種情況中，PNA寡聚物與乙酸酑(產(chǎn)生化合物III)或環(huán)己基丁酸連同0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N,N,N，,N，-四甲基脲鏡六氟磷酸(HATU)(產(chǎn)生化合物IV)反應。采用C-18反相HPLC純化方法獲得高純度的PNA。這兩種PNA的解鏈溫度研究證明環(huán)己基丁基修飾的PNA的Tm比乙酰基化PNA的高7-8°C。實施例2在另一實驗中，制備了幾種PNA寡聚物并比較了它們的Tm。對于本實施例，PNA寡聚物是C-末端修飾、N-末端修飾或C-末端和N-末端同時修飾的。為實現(xiàn)該修飾，利用快速合成儀(Expeditesynthesizer)并將氨基酸Fmoc-p-環(huán)己基-Ala-OH(393.5g/mol，L#522434，BachemP/NB1975)用作單體。因此，可在PNA寡聚物裝配期間通過偶聯(lián)簡單地將氨基酸摻入C-末端、N-末端或同時摻入C-末端和N-末端(參見表格)。加入該氨基酸將環(huán)己基亞甲基基團引入PNA寡聚物的各種位置。表<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>參考表中的數(shù)據(jù)，可以看出Tm調(diào)節(jié)的差異基本上取決于基團連接于C-末端還是連接于N-末端(見條目l和3)。然而，如果兩末端均包含該基團，則具有累加效應，在該情況中，L的凈增加超過10°C。因此，由數(shù)據(jù)可以明顯看出根據(jù)加入PNA寡聚物的基團的性質(zhì)、數(shù)量和位置可能大大提高Tra。適當評估處于各種位置的各基團的Tm，應能通過給含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或間接共價連接至少一個垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，所述基團連接于用于形成PNA寡聚物/NA復合物的PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳，從而以基本上可預測的方式調(diào)節(jié)該PNA寡聚物/NA復合物的Tm，前提是該基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。雖然結(jié)合各種實施方式描述了本發(fā)明，但并未打算將本發(fā)明限制于這種實施方式。相反，本領域技術人員應知道本發(fā)明包括各種改變、改進和等價方式。L參考文獻1.Bleczinski等，JACS121:10889-10894(1999)2.Challa等，OrganicLetters,1(10):1639-1641(1999)3.Coull等，美國專利申請公布號2003-00776084.Garner等，Chembiochem，3:224-226(2001)5.Gryazpnov等，Nucl.Acids.Res.21:5909-5915(1993)6.Guckian等，JACS，122:2213-2222(2000)7.Kohler等，ChemBioChem，6:69-77(2005)8.Letsinger等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，86:6553-6556(1998)9.Lagriffoule等，Chem.Eur.J,，3(6):912-919(1997)10.Nielsen等，WO98/0354211.Petersheim等，Biochemistry,22:256-263(1983)12,Seela等，Nucl.AcidsRes.，28(17):3224-3232(2000)13.Senior等，Biochemistry,27:3879-3885(1988)14.Zhang等，Methods,23:132-140(2001)權利要求1.一種PNA寡聚物，其包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。2.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團在生理pH下不帶電荷。3.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團包含取代或未取代的環(huán)狀烴基團。4.如權利要求3所述的PNA寡聚物，其特征在于，各環(huán)狀烴基團是取代或未取代的環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。5.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團在生理pH下不包含堿性氮。6.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團與N-末端氨基和/或C-末端羰基碳間接相連。7.如權利要求6所述的PNA寡聚物，其特征在于，各間接相連的基團是非天然產(chǎn)生的氨基酸的側(cè)鏈。8.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團與N-末端氨基說接相連。9.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團與C-末端羰基碳直接相連。10.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，不同的基團各自連接于C-末端和N-末端。11.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，相同的基團各自連接」'-c-末端禾nN-末端612.如權利要求7或8中任一項所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團獨立如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX3，其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I。13.如權利要求12所述的PNA寡聚物，其特征在于，基團中一個或多個式C(J')2所示部分任選用式OO、OS、S或0所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分任選用下式所示部分取代:J，只要取代時該基團不是芳性的，并且該基團不是下式所示^^S、CH3或ZcH3。14.如權利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團獨立如下式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-SCX3或-OCX其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I;禾口W是O或S。15.如權利要求14所述的PNA寡聚物，其特征在于，基團中一個或多個式C(J')2所示部分任選用式C=0、OS、S或O所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>任選用下式所示部分取代<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>只要取代時該基團不是芳性的。16.如權利要求9所述的PNA寡聚物，其特征在于，各基團獨立如下式所示6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，K'是N、O或S;各J'獨立為H、F、Cl、Br、I、-OH、-SH、-CX3、-8。乂3或-00乂3，其中各X獨立為H、F、Cl、Br或I;禾口如果K'是O或S，則R'不存在，但如果K'是N，則R'是氫或垸基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團。17.如權利要求16所述的PNA寡聚物，其特征在于，基團中一個或多個式C(J')2所示部分任選用式C=0、C=S、S或O所示部分取代和/或基團中一個或多個下式所示部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>任選用下式所示部分取代:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>只要取代時該基團不是芳性的。18.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，還包含至少一個可檢測部分。19.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，還包含至少一個在生理pH下包含荷電基團的氨基酸。20.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，還包含至少一個通用核堿基。21.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，還包含至少一個二氨基嘌呤核堿基。22.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物還包含至少一個能量供體部分和至少一個能量接受體部分。23.如權利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物包含C-末端羧酸基團。24.如權利要求8所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物是包含一個或多個連接的C-末端核苷的PNA嵌合體。25.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物與支持物結(jié)合。26.如權利要求1所述的PNA寡聚物，其特征在于，所述PNA寡聚物與陣列結(jié)合。27.—種方法，該方法包括形成PNA寡聚物，其中該PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。28.—種方法，該方法包括形成PNA寡聚物/NA復合物，其中該PNA寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰基碳，還包含與該N-末端氨基和/或C-末端羰基碳直接或間接共價相連的至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。29.—種方法，該方法包括以基本上可預測的方式調(diào)節(jié)PNA寡聚物/NA復合物的Tm，所述調(diào)節(jié)是通過給含有N-末端氨基和C-末端羰基碳的PNA寡聚物直接或間接共價連接至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，所述基團連接于用于形成該PNA寡聚物/NA復合物的PNA寡聚物的N-末端拔基和/或C-末端羰基碳，前提是所述基團不是乙酰基或末端連接的天然氨基酸的側(cè)鏈。30.—種裝有PNA寡聚物的試劑盒，該寡聚物包含N-末端氨基和C-末端羰棊碳，還包含直接或間接共價連接于該PNA寡聚物的N-末端氨基和/或C-末端羰基碳的至少一個烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基或雜環(huán)烴基團，前提是所述基團不是乙?；蚰┒诉B接的天然氨基酸的側(cè)鏈。全文摘要本發(fā)明涉及屬于調(diào)節(jié)PNA寡聚物/核酸復合物穩(wěn)定性的方法、試劑盒和組合物。文檔編號C07H21/00GK101253191SQ200680031643公開日2008年8月27日申請日期2006年6月30日優(yōu)先權日2005年6月30日發(fā)明者E·G·安德森,S·迪申請人:阿普里拉股份有限公司