專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，還涉及一種乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
病毒性乙型肝炎(HB，hePatitisB)是一種世界性的傳染性疾病，我國(guó)近3千萬(wàn)人的慢性乙型肝炎患者中，其所攜帶的HBV變異毒株大多數(shù)表現(xiàn)為在病毒基因組前C區(qū)核心基因啟動(dòng)子堿基變異，HBV BCP區(qū)變異在慢性乙型重型肝炎患者中發(fā)生率高，提示HBV BCP變異與乙型肝炎發(fā)病過(guò)程及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外用于檢測(cè)基因突變的方法有:(I)PCR直接測(cè)序:對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的直接序列分析，并與DNA序列片段進(jìn)行對(duì)比分析，檢出點(diǎn)突變部位堿基改變。(2)PCR產(chǎn)物限制性?xún)?nèi)切酶分析:主要用于檢測(cè)基因點(diǎn)突變發(fā)生時(shí)引起酶切位點(diǎn)改變的DNA片段，這一方法必須在突變點(diǎn)涉及到限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)改變時(shí)才能使用。(3)PCR—寡核苷酸探針雜交:該方法利用寡核苷酸片段作為探針，在嚴(yán)格控制雜交條件的前提下雜交，雜交溫度要求過(guò)于嚴(yán)格，很難推廣應(yīng)用。

(4)PCR—單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR SSCP):基于序列不同的DNA單鏈片段，其空間構(gòu)象亦有所不同，根據(jù)其電泳的位置變化，而表現(xiàn)出不同序列單鏈電泳遷移率的差異，從而判斷
有無(wú)突變存在。(5)使用合成的特定核苷酸引物和分子信標(biāo)探針，對(duì)1762和1764點(diǎn)的靶DNA片段，實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增，根據(jù)PCR的擴(kuò)增，分析并判斷標(biāo)本中乙型肝炎病毒DNA的A1762T-G1764A突變是否存在。(6)其他:如解鏈溫度(Tm)基因突變檢測(cè)，基因芯片技術(shù)等。本研究的方法是反義抑制PCR聯(lián)合熒光探針檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基變異方法及其所使用的引物。該方法的原理為:根據(jù)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基變異設(shè)計(jì)聚合酶鏈DNA引物，引物序列的3'端位在突變堿基，又根據(jù)未突變(野生型)的DNA引物3'端堿基序列，從序列3'端倒數(shù)第I位設(shè)計(jì)反向引物的互補(bǔ)序列。這樣，PCR擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)對(duì)野生型堿基序列的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，嚴(yán)重阻滯了野生株DNA的擴(kuò)增，存在PCR反應(yīng)液內(nèi)的熒光探針報(bào)告基團(tuán)分離也被阻滯，發(fā)射熒光程度顯著減弱，而對(duì)變異的堿基序列擴(kuò)增，幾乎不產(chǎn)生阻滯，存在PCR液內(nèi)的熒光探針報(bào)告基團(tuán)可正常分離而發(fā)熒光，因此在檢測(cè)同一標(biāo)本時(shí)，通過(guò)此檢測(cè)值差別的比較，可準(zhǔn)確地判斷基因變異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，該試劑盒檢測(cè)方便，結(jié)果穩(wěn)定。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供了一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的方法，該方法成本低、敏感性高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明的核心技術(shù)在于:根據(jù)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子目標(biāo)基因及其堿基變異設(shè)計(jì)聚合酶鏈DNA引物，弓I物序列的:T端位在突變堿基，又根據(jù)未突變(野生型)的DNA引物3'端堿基序列，從序列3'端倒數(shù)第I位反向設(shè)計(jì)引物互補(bǔ)序列，PCR擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)對(duì)野生型堿基序列的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而嚴(yán)重阻滯野生株DNA的擴(kuò)增，而幾乎對(duì)變異的堿基序列擴(kuò)增不產(chǎn)生阻滯。在檢測(cè)同一標(biāo)本時(shí)，設(shè)立不加此互補(bǔ)序列的PCR反應(yīng)液作對(duì)照，根據(jù)對(duì)同一標(biāo)本檢測(cè)的CT值差別比較，可準(zhǔn)確判斷乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子目標(biāo)基因堿基變異。本發(fā)明所述試劑盒是針對(duì)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子A1762T和G1764A位堿基變異。確定檢測(cè)A1762T位和G1764A位堿基變異靶基因(GENE-BANK AB198078)為:gtttaaagactgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtctgttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcctccaagctgt gccttgggtg get。一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，包括以下成分:PCR試劑盒A組試劑:對(duì)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基的野生型和突變型都能順利進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括以下成分:PCR 反應(yīng)液 A:PC R 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP0.3 μ mol/LHBV-A1 上游引物 5' -gttta aagac tggga ggagt-31 0.3 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' ；0.2 μ mol/LPCR試劑盒B組試劑:對(duì)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子A1762T堿基的突變型能順利進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而對(duì)其野生型PCR擴(kuò)增受到嚴(yán)重阻滯，包括以下成分:PCR 反應(yīng)液 B:PCR 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP0.3 μ mol/L 以及HBV-Bl 上游引物 5' -tgggg gagga gatta ggtta at~3/ 0.3 μ mol/LHBV-B2 上游反義引物 5' -tttaa cctaa tctcc tcccc ca~3' 0.03 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' ；0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' ；0.2 μ mol/LPCR試劑盒C組試劑:對(duì)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子G1764A堿基的突變型能順利進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而對(duì)其野生型PCR擴(kuò)增受到嚴(yán)重阻滯，包括以下成分:PCR 反應(yīng)液 C:PCR 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 l_2u、dNTP0.3 μ mol/L 以及HBV-C1 上游引物 5' -ggagg agatt aggtt aaaga-3' 0.3 μ mol/LHBV-C2 上游反義引物 5' -ccttt aacct aatct cctcc-3' 0.03 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' 0.2 μ mol/LI)樣本DNA處理:取待測(cè)血清樣本30μ I加入等量DNA提取液60 μ I混勻，95-980C 8—9分鐘變性，放置冰箱(TC冷卻2_3分鐘，12000rpm離心5分鐘，取上清液離心備用。
2)PCR反應(yīng)液分裝:各取PCR反應(yīng)液A、B和C，各25 μ 1，取待測(cè)檢測(cè)提取HBV DNA上清液5 μ I加入各反應(yīng)管。3) PCR擴(kuò)增:取分裝好PCR反應(yīng)液的各反應(yīng)管，按以下PCR擴(kuò)增條件設(shè)置并擴(kuò)增:940C 3分鐘預(yù)變性，然后93 °C 40秒-55 °C 60秒循環(huán)40次。4)檢測(cè)結(jié)果與判斷:(I)應(yīng)用PCR試劑盒A組試劑檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子DNA的判斷:DNA檢測(cè)陰性:CT值彡38 ; DNA 檢測(cè)陽(yáng)性:CT 值〈36。DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，如結(jié)果>36判斷檢測(cè)陰性。試劑盒中乙肝 病毒核心基因啟動(dòng)子DNA的一組檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果陰性說(shuō)明檢測(cè)的樣品中無(wú)乙肝病毒DNA。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性說(shuō)明檢測(cè)的樣品中存在乙肝病毒DNA。(2)應(yīng)用PCR反應(yīng)液B組試劑檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子A1762T堿基變異的判斷:DNA檢測(cè)陰性:CT值彡38 ;DNA 檢測(cè)陽(yáng)性:CT 值〈36。DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，如結(jié)果>36判斷檢測(cè)陰性。結(jié)果說(shuō)明:在PCR試劑盒A組試劑檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，判斷樣品中存在乙肝病毒DNA前提條件下，實(shí)施例2檢測(cè)陰性結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)的樣品中雖然存在乙肝病毒DNA但無(wú)乙肝病毒DNA的A1762T突變。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性說(shuō)明檢測(cè)的樣品中存在乙肝病毒A1762T突變。(3)應(yīng)用PCR反應(yīng)液C組試劑乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子G1764A堿基變異的判斷:DNA檢測(cè)陰性:CT值彡38 ; DNA 檢測(cè)陽(yáng)性:CT 值〈36。DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，如結(jié)果>36判斷檢測(cè)陰性。結(jié)果說(shuō)明:在PCR試劑盒A組試劑檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，判斷樣品中存在乙肝病毒DNA前提條件下，檢測(cè)陰性結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)的樣品中雖然存在乙肝病毒DNA，但無(wú)乙肝病毒DNA的G1764A突變。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性說(shuō)明檢測(cè)的樣品中存在乙肝病毒G1764A突變。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明方法所使用的引物，主要依靠乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子目標(biāo)基因及其堿基變異堿基設(shè)計(jì)引物，而且通過(guò)未突變(野生型)的的反向互補(bǔ)序列引物，在PCR擴(kuò)增時(shí)，對(duì)野生型堿基序列的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而嚴(yán)重阻滯野生株DNA的擴(kuò)增，準(zhǔn)確檢測(cè)基因變異。2、本發(fā)明方法和引物可用于制備乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子目標(biāo)基因及其堿基變異檢測(cè)試劑盒。3、根據(jù)PCR阻滯狀況，熒光強(qiáng)度測(cè)定，可相對(duì)測(cè)定乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子基因及其堿基變異程度和其它狀況，測(cè)定結(jié)果顯示基因突變(陽(yáng)性)和未突變(陰性)。4.本發(fā)明方法和引物設(shè)計(jì)，對(duì)于基因突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性很高，可在極大程度上克服現(xiàn)在常規(guī)方法(核苷酸序列測(cè)定、核苷酸序列雜交、PCR單鏈構(gòu)象法等)操作較繁瑣、耗時(shí)、準(zhǔn)確性較低的缺點(diǎn)，體現(xiàn)了技術(shù)先進(jìn)性、準(zhǔn)確性，并具有廣泛的實(shí)用性，能在臨床上推廣。另外由于本發(fā)明方法在PCR擴(kuò)增最有利的條件下進(jìn)行，提高了檢測(cè)基因突變方法的敏感性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用引物或核苷酸序列若無(wú)特別說(shuō)明，均由上海閃晶生物技術(shù)公司合成，所采用的技術(shù)方案若無(wú)特別說(shuō)明采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)。實(shí)施例1:試劑盒中乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子DNA的PCR A組檢測(cè)試劑，對(duì)應(yīng)用國(guó)家規(guī)定HB V標(biāo)準(zhǔn)品、人陰性HBV血清、陰性質(zhì)控品和不同稀釋濃度的陽(yáng)性質(zhì)控品，進(jìn)行陰性和陽(yáng)性臨界值測(cè)驗(yàn)，最低檢測(cè)濃度測(cè)驗(yàn)。對(duì)乙肝病毒堿基的野生型和突變型都能順利進(jìn)行PCR擴(kuò)增，包括以下成分:人陰性HBV血清:無(wú)乙肝病毒。陰性質(zhì)控品:無(wú)A1762T位和G1764A位堿基變異野生型基因克隆菌株和A1762T位和G1764A位堿基變異型基因克隆菌株，野生型基因克隆菌株(大腸桿菌DH5 α )質(zhì)粒DNA，核苷酸序列是:gtttaaagac tgggaggagt tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tactaggaggctgtaggcat aaattggtct gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgttcatgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg get。檢測(cè)試驗(yàn)用的陽(yáng)性質(zhì)控品:A1762T位和G1764A位堿基變異型基因克隆菌株(大腸桿菌DH5 α )質(zhì)粒DNA，，核苷酸序列是:gtttaaagac tgggaggagt tgggggagga gattaggtta atgatctttg tactaggaggctgtaggcat aaattggtct gttcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgttcatgtcctac tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg get。*粗體字示變異密碼子核苷酸序列?？寺【陿?gòu)建:采用合成A1762T位和G1764A位堿基變異的野生型DNA和突變型DNA與pUCm-T載體在連接酶的催化下，建成含有目的片斷的重組載體，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a大腸桿菌中，分離培養(yǎng)獲得。PCR 反應(yīng)液 A =PCR 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP0.3 μ mol/L,以及:HBV-A1 上游引物 5' -gttta aagac tggga ggagt-31 0.3 μ mol/LHBV-D 公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g-3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 突光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt-TAMARA-3' ；0.2 μ mol/L為了測(cè)算檢測(cè)陽(yáng)性與陰性的臨界值，以及檢測(cè)最低檢測(cè)濃度，使用國(guó)家規(guī)定的肝炎病毒(HBV)核酸定量標(biāo)準(zhǔn)品作參照:HBVDNA陰性參考品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)線性靈敏度參考品(L0 — L6)(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)具體實(shí)施步驟:I)樣本DNA處理:取陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品，使用無(wú)乙肝病毒的陰性人血清樣本稀釋到所需要的濃度，取30 μ I加入等量DNA提取液60 μ I混勻，95-98°C 8—9分鐘變性，放置冰箱0°C冷卻2-3分鐘，12000rpm離心5分鐘，取上清液離心備用。2)PCR反應(yīng)液分裝:各取PCR反應(yīng)液A和B，再按檢測(cè)I人份25 μ I分裝并加入各反應(yīng)管，各取待測(cè)檢測(cè)提取HBV DNA上清液5 μ I加入各反應(yīng)管，每份樣本需同時(shí)用PCR反應(yīng)液A和B兩支反應(yīng)管檢測(cè)。3) PCR擴(kuò)增:取分裝好PCR反應(yīng)液的各反應(yīng)管，按以下PCR擴(kuò)增條件設(shè)置并擴(kuò)增:94°C 3分鐘預(yù)變性，然后93 °C 40秒-55 °C 60秒循環(huán)40次。 檢測(cè)結(jié)果與判斷: DNA檢測(cè)陰性:CT值彡38 ;DNA 檢測(cè)陽(yáng)性:CT 值〈36。DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，如結(jié)果>36判斷檢測(cè)陰性。應(yīng)用國(guó)家規(guī)定HBV標(biāo)準(zhǔn)品、人陰性HBV血清和檢測(cè)試驗(yàn)用的陽(yáng)性質(zhì)控品，作不同稀
釋的濃度樣本，進(jìn)行陰性和陽(yáng)性臨界值測(cè)驗(yàn)，最低檢測(cè)濃度測(cè)驗(yàn)，結(jié)果如下表，說(shuō)明陰性和
陽(yáng)性測(cè)驗(yàn)臨界值在38，最低檢測(cè)濃度在5.lX103IU/ml, CT為37.52，該敏感度能滿足醫(yī)院
臨床檢驗(yàn)需要。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下成分: PCR試劑盒A組試劑: PCR反應(yīng)液A: PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、dNTP HBV-Al 上游引物5' - gttta aagac tggga ggagt - 3' HBV-D公用下游引物5' -agcca cccaa ggcac agctt g - 3r HBV-Y 焚光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3'； PCR試劑盒B組試劑: PCR反應(yīng)液B:PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、dNTP HBV-Bl 上游引物 5' - tgggg gagga gatta ggtta at - 3' HBV-B2 上游反義引物 5' - ttt aa cctaa tctcc tcccc ca~31 HBV-D公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g -3! HBV-Y 焚光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3'； PCR試劑盒C組試劑: PCR反應(yīng)液C:PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、dNTP HBV-Cl上游引物5 ^ -ggagg agatt aggtt aaaga- 3! HBV-C2 上游反義引物 5' - ccttt aacct aatct cctcc- 3' HBV-D公用下游引物 5' -agcca cccaa ggcac agctt g - 3r HBV-Y 焚光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，所述成分的濃度為: PCR 反應(yīng)液 A:PCR 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP 0.3 μ mo I/L: HBV-A1 上游引物5' - gttta aagac tggga ggagt - 3' 0.3 μ mol/L HBV-D公用下游引物 5' - agcca cccaa ggcac agctt g - 3' 0.3 μ mol/LHBV-Y 焚光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3' ;0.2μ mol/L ； PCR 反應(yīng)液 B:PCR 緩沖液(I X )、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP 0.3 μ mol/L HBV-Bl 上游引物 5' - tgggg gagga gatta ggtta at - 3' 0.3 μ mol/L HBV-B2 上游反義引物 5, - tttaa cctaa tctcc tcccc ca_3, 0.03 μ mol/L HBV-D 公用下游引物 5' - agcca cccaa ggcac agctt g ~3f ;0.3 μ mol/L HBV-Y 焚光探針:5' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3' ;0.2 μ mol/L ； PCR 反應(yīng)液 C:PCR 緩沖液(IX)、TaqDNA 聚合酶 1.5U、dNTP 0.3 μ mol/L HBV-C1 上游引物5' - ggagg agatt aggtt aaaga- 3' 0.3 μ mol/L HBV-C2 上游反義引物 5' - ccttt aacct aatct cctcc- 3' 0.03 μ mol/L HBV-D 公用下游引物 5' - agcca cccaa ggcac agctt g - 3' 0.3 μ mol/L HBV-Y 焚光探針:5 ' -FAM-tgtag gcata aattg gtctg tt - TAMARA-3 '0.2 μ mol/L。
3.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒，其檢測(cè)方法為: 1)樣本DNA處理:取待測(cè)血清樣本30μ I加入等量DNA提取液60 μ I混勻，95_98°C8-9分鐘變性，放置冰箱0°C冷卻2-3分鐘，12000rpm離心5分鐘，取上清液離心備用； 2)PCR反應(yīng)液分裝:各取PCR反應(yīng)液A、B和C各25μ 1，取待測(cè)檢測(cè)提取HBV DNA上清液5μ I加入各反應(yīng)管,每份樣本需同時(shí)用PCR反應(yīng)液A和B兩支反應(yīng)管檢測(cè)； 3)PCR擴(kuò)增:取分裝好PCR反應(yīng)液的各反應(yīng)管，按以下PCR擴(kuò)增條件設(shè)置并擴(kuò)增:94°C3分鐘預(yù)變性，然后93 °C 40秒-55°C 60秒循環(huán)40次； 4)檢測(cè)結(jié)果與判斷: (1)應(yīng)用PCR組試劑盒A組試劑檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子DNA的判斷: DNA檢測(cè)陰性:CT值彡38 ; DNA檢測(cè)陽(yáng)性:CT值〈36 ； DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，重做結(jié)果>36判斷檢測(cè)陰性； (2)應(yīng)用PCR試劑盒B組試劑檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子A1762T堿基變異的判斷: 突變檢測(cè)陰性:PCR反應(yīng)液B管檢測(cè)CT值> 38 突變檢測(cè)陽(yáng)性:PCR反應(yīng)液B管檢測(cè)CT值〈36; DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，重做結(jié)果>36判斷陰性； (3)應(yīng)用PCR試劑盒C組試劑檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子G1764A堿基變異的判斷: 突變檢測(cè)陰性:PCR反應(yīng)液C管檢測(cè)CT值> 38 ; 突變檢測(cè)陽(yáng)性:PCR反應(yīng)液C管檢測(cè)CT值〈36; DNA檢測(cè)灰區(qū):36〈CT值〈38，需重作一次，重做檢測(cè)結(jié)果>36判斷陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子堿基突變的試劑盒及檢測(cè)方法，該試劑盒包括PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B和PCR反應(yīng)液C，本發(fā)明方法所使用的引物，主要依靠乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子目標(biāo)基因及其堿基變異堿基設(shè)計(jì)引物，而且通過(guò)未突變(野生型)的反向互補(bǔ)序列引物,在PCR擴(kuò)增時(shí),對(duì)野生型堿基序列的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,而嚴(yán)重阻滯野生株DNA的擴(kuò)增,準(zhǔn)確檢測(cè)基因變異。該試劑盒檢測(cè)方便，結(jié)果穩(wěn)定，成本低、敏感性高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103233067SQ201310131610
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者夏曉兵, 糜克永, 劉靜, 占霖, 張易莎 申請(qǐng)人:武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)有限公司