雞mmp-9基因啟動子區(qū)-1954突變位點的分子標(biāo)記方法及其在雞育種中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種雞MMP-9基因5′調(diào)控區(qū)-1954突變位點的分子標(biāo)記方法及其在雞育種中的應(yīng)用；本發(fā)明構(gòu)建的MMP-9基因啟動子-1954位點C+C+和C-C-兩種基因型熒光素酶報告載體，分別轉(zhuǎn)染雞的卵泡顆粒細(xì)胞后檢測發(fā)現(xiàn)C+C+基因型表達(dá)活性顯著高于C-C-型，說明可能是由于兩種基因型表達(dá)活性的差異，導(dǎo)致了產(chǎn)蛋性能的不同。本發(fā)明方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為標(biāo)記輔助育種工作提供有利的幫助。
【專利說明】雞圖P-9基因啟動子區(qū)-1954突變位點的分子標(biāo)記方法及其在雞育種中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及了一種雞MMP-9基因啟動子區(qū)-1954突變位點的分子標(biāo)記方法及其育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]動物的大多數(shù)器官在形成后，極少出現(xiàn)周期性的組織重建與再生。雌性動物的生殖系統(tǒng)，尤其是卵巢中的卵泡在不同階段經(jīng)歷著生長、成熟和萎縮等周期性變化，Nalbandov指出尤其是鳥類卵泡應(yīng)該是所有高等脊椎動物中生長速度最快的結(jié)構(gòu)，小卵泡在短短幾天內(nèi)可增長150-200倍發(fā)育成熟并排卵。這些動態(tài)組織的變更要求細(xì)胞外基質(zhì)的不斷的降解和重建。胞外基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的維持在很大程度上依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑制因子(IlMPs)的協(xié)調(diào)控制。
[0003]大量研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中MMPs對卵泡發(fā)育、閉鎖、排卵以及黃體退化過程中起了非常重要的作用。Imai等認(rèn)為，MMP-2的表達(dá)量是衡量牛卵母細(xì)胞是否發(fā)育正常的一個重要指標(biāo)。Brannstrom和Ogiwara研究發(fā)現(xiàn),在MMPs的抑制劑或者抗體作用下,小鼠排卵被完全抑制或者減少。而MMPs在鳥類卵巢發(fā)育中的研究卻很少，前期本課題組發(fā)現(xiàn)MMP-9隨雞卵巢成熟和卵泡增大中表達(dá)量顯著上升，分離培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，添加激素和TGF-β進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)ΜΜΡ-9基因表達(dá)只受到TGF-β調(diào)控，而其啟動子區(qū)-1700至-2400含有此基因表達(dá)的重要調(diào)控元件。
[0004]眾所周知，DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，是一種通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在生長發(fā)育的早期進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時識別難的問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。
[0005]基因啟動子區(qū)的堿基突變，通常會影響基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，本研究對不同產(chǎn)蛋率雞種間的ΜΜΡ-9基因啟動子區(qū)存在的SNPs進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)并找出了一個有意義的分子標(biāo)記，為方便快速地選育出早產(chǎn)、高產(chǎn)的品系/種提供了有利的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和實驗，具體涉及了一種雞ΜΜΡ-9基因5'調(diào)控區(qū)突變位點的分子標(biāo)記方法及其育種中的應(yīng)用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞ΜΜΡ-9 5'調(diào)控區(qū)上游-1954位點存有C堿基插入/缺失突變，并進(jìn)行了標(biāo)記分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新楊褐雞種中此位點純合缺失C_C_基因型與高產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)聯(lián)(P=0.024)。另外，該基因型對應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡(158d)，C+C+型對應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡(161d)，有使母雞提前開產(chǎn)的趨勢(P=0.19)。可見檢測這個與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，不僅方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為育種工作提供有利的幫助。
[0007]本發(fā)明的具體標(biāo)記方法是:
[0008]采用標(biāo)記弓丨物P-MMP-9，包括[0009]P-MMP-9-F,其序列如 Seq ID No:1 所示；
[0010]P-MMP-9-R，其序列如 Seq ID No:2 所示；
[0011]擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到的序列如Seq ID No: 5所示，發(fā)現(xiàn)MMP-9基因TSS上游-1954位點在新楊褐雞中存在C+C+、c+σ和σσ三種基因型。
[0012]在產(chǎn)蛋數(shù)低的群體中，選擇CX—基因型的個體，或者選C+C—基因型的公母雞，通過相互交配得到CT-基因型的后代，然后CX-基因型個體進(jìn)行繁育擴(kuò)群，可以得到全為c_c_型高產(chǎn)蛋數(shù)的群體。
[0013]通過這種標(biāo)記方法得到的CT-基因型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋性能低的地方品種中有目的地增加CT-基因型的頻率對提高產(chǎn)蛋量是一個有效措施；而對于開產(chǎn)較晚的群體，這樣的措施也會使其開產(chǎn)適當(dāng)提前，從而實現(xiàn)早期選種。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為P-MMP-9-F/R弓丨物PCR擴(kuò)增的片段電泳圖；
[0015]圖2為雞MMP-9 調(diào)控區(qū)-1954位點的多態(tài)性測序圖；
[0016]圖3為構(gòu)建定點突變PGL3-載體后序列比對結(jié)果；
[0017]圖4為分離培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細(xì)胞圖片，200 X倍鏡觀察；
[0018]圖5為C+C+和CX—兩種基因型熒光素酶報告基因啟動活性檢測示意圖；
(五)【具體實施方式】
[0019]實施例1雞MMP-9 5'調(diào)控區(qū)序列的克隆測序、序列比對及突變位點分析
[0020]1.試驗材料
[0021]新楊褐基因組(上海家禽育種有限公司，國家家禽工程技術(shù)研究中心)，文昌雞基因組(海南省文昌雞育種公司)，海蘭褐基因組(山東泰安海蘭褐育種公司)。
[0022]2.試驗方法
[0023]2.1引物設(shè)計
[0024]根據(jù)已發(fā)表紅色原雞序列(GenBank Accession NC_006107.3)設(shè)計引物P-MMP-9見表l(Seq ID No:1和2所示)，此引物是為研究雞MMP-9 5'調(diào)控區(qū)的突變而根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登錄的紅色原雞的序列特意設(shè)計的。
[0025]表1 MMP-9啟動子擴(kuò)增弓丨物
[0026]
【權(quán)利要求】
1.雞MMP-9基因5'調(diào)控區(qū)突變位點的分子標(biāo)記方法，其特征在于具體標(biāo)記方法是: 米用標(biāo)記引物P-MMP-9,包括 P-MMP-9-F，其序列如 Seq ID No:1 所示； P-MMP-9-R，其序列如Seq ID No: 2所示；擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到的序列如Seq ID No: 3所示，結(jié)果在MMP-9基因5'調(diào)控區(qū)-1954位點分別檢測到C+C+、C+C—和C_C_三種基因型。
2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法，其特征在于其在雞育種中的應(yīng)用方法是:在產(chǎn)蛋數(shù)低的群體中，選擇CX—基因型的個體，相互交配得到CX—基因型高產(chǎn)蛋數(shù)的群體后代?；蛘哌xC+C—基因型的公母雞，相互交配得到CX—基因型的后代，然后CX—基因型個體進(jìn)行繁育擴(kuò)群，可以得到全為CX—型高產(chǎn)蛋數(shù)的群`體。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773844SQ201310665567
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】姜運良, 朱桂玉, 康麗, 陳欣, 魏晴晴, 楊春紅, 崔新星, 陳玉霞, 袁振杰 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)