專利名稱：一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測仙臺(tái)病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)還涉及SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的應(yīng)用，該SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對小鼠細(xì)胞制品進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行仙臺(tái)病毒的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
背景技術(shù)：
仙臺(tái)病毒(Sendai virus, SeV)屬副粘病毒科副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬病毒，呈多形性，主要為球形，直徑約200 μ m。SeV是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大小為15kb。SeV是引起嚙齒類動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，可影響幼鼠發(fā)育成長和降低成年鼠的繁殖率，且很難從鼠群中清除。SeV甚至可感染靈長類動(dòng)物及人類，它主要引起嬰幼兒下呼吸道嚴(yán)重疾病及較大兒童的上呼吸道感染，以發(fā)熱、咳嗽、氣喘或胸悶胸痛為主，甚至造成致死性感染。但對較大兒童和成人一般只引起普通感冒癥狀的上呼吸道感染，很少導(dǎo)致感染死亡。SeV廣泛分布于世界各地，其流行或散發(fā)常與流感病毒伴發(fā)流行。因此《中華人民共和國藥典》規(guī)定對鼠源性生物制品必須檢測仙臺(tái)病毒。診斷實(shí)驗(yàn)小鼠的仙臺(tái)病毒感染和控制其蔓延都具有積極意義。目前的檢測技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類I、血清學(xué)診斷技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，所以反應(yīng)時(shí)間長、材料多、準(zhǔn)備周期長，而且檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2、生物學(xué)試驗(yàn)包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本較高、檢測周期長，耗費(fèi)大量生物資源和人力物力。`3、分子生物學(xué)診斷技術(shù)，即應(yīng)用普通RT-PCR技術(shù)檢測仙臺(tái)病毒(YukiharuH, Kiyoka ke T，Michisato K，et al. Detection of nucleoprotein gene of Sendai virusin the lungs of rats by touchdown nested reverse transcription polymerasechain reaction [J]. Experimental Animals, 1997，46 (4)，307-310) 普通 RT-PCR 方法特異性好，檢測靈敏度較高，解決了血清學(xué)方法無法對無血清生物制品和免疫缺陷小鼠進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)。但是由于普通RT-PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以該方法無法定量起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。近年發(fā)展起來的熒光定量PCR(FluOTOgeneticQuantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)具有靈敏度高、速度快、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。在基因表達(dá)水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM, Dalagaard Mj et al. Quantification of AntiandrogenEffect Determined by Light Cycler Tec hnology[J] · Toxicology，2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhudevi Bj Weinstock D.Fluoro genic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea V irus [J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量檢測(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assa y[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1mprovedquantitative real-time R T-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res., 2002, Vol.30N 0.17e89.Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR Green I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所采用的基于SYBR GreenI熒光染料技術(shù)的熒光定量PCR檢測方法其引物設(shè)計(jì)、合成更加簡便，且具有良好的重復(fù)性和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測范圍廣。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(抗)仙臺(tái)病毒藥物研究中的應(yīng)用，可對小鼠、大鼠細(xì)胞制品進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行仙臺(tái)病毒引起的嬰幼兒下呼吸道嚴(yán)重疾病及較大兒童的上呼吸道感染的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:一種檢測仙臺(tái)病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a)RNA提取液、b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于:引物序列分別為正義引物:5，-ACCTATGGTCAACAAG AGTCCGCT-3，，反義引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3，，擴(kuò)增子大小為142bp，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入仙臺(tái)病毒保守的NP蛋白編碼區(qū)142bp的pTA2載體(購自Τ0Υ0Β0)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5 a為最常用于常規(guī)克隆應(yīng)用的大腸桿菌菌株。除支持藍(lán)/白篩選外，DH5 a的recAl和endAl突變可增強(qiáng)嵌入穩(wěn)定性并提高自minipreps制備的質(zhì)粒DNA質(zhì)量),增殖后提取質(zhì)粒,并于紫外分光光度計(jì)測A26tl定量并10倍梯度稀釋。所述的RNA提取液是由細(xì)胞裂解液(Trizol,購自Invitrogen)、氯仿、異丙醇、75%(質(zhì)量體積比，下同)乙醇、滅菌的雙蒸水組成。所述的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液是由2X iTaq SYBR GreenSupermix (with R0X) >10 μ M的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板核苷酸序列為:Acctatggtcaacaagagtccgcttttccaggggcaacgagatgctgcagaccctgatacgctccttcaaatctatgggtatccggcatgcctaggggcaattattgtccaggtctggattgtgctggtgaaggcaatcacgo在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，采用傳統(tǒng)的兩步法擴(kuò)增(Two-Step RT-PCR)，即第一步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA樣品定量檢測未知樣品。用DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，使得定量反應(yīng)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，并大大增加了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，減少誤差。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液由反義引物(RT)、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、5Xbuffer溶液、IOmM dNTPs和無核酸酶的滅菌雙蒸水組成；突光定量PCR反應(yīng)液由2X iTaq SYBR Green Supermix (with R0X)、10iiM的正義引物和反義引物，以及滅菌的雙蒸水組成；在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液由5父131^€61'溶液5111、101111101/1的反義引物(RT) 2. 5 u LUOmM dNTPsl. 5 y L、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各Iii L、無核酸酶的滅菌雙蒸水9 ii L組成；熒光定量PCR反應(yīng)液由2 X iTaqSYBR Green Supermix (with ROX) 10 ii L、10 ii M的正義引物和反義引物各I ii L、滅菌的雙蒸水7 ii L組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由含有插入目的片段的pTA2 (購自T0Y0B0公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A26tl定量并10倍梯度稀釋。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過程為普通RT-PCR反應(yīng)后，取適量產(chǎn)物凝膠電泳檢測，若擴(kuò)增條帶單一，即可與10XA-attachment Mix混合,于60°C反應(yīng)30min ;再與PTA2載體連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂X-gal平板過夜培養(yǎng)，次日挑取白斑菌落。菌落PCR鑒定為陽性后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。次日提取質(zhì)粒，于紫外分光光度計(jì)測A26tl定量，并稀釋至梯度IO8-IO2拷貝/ U L，-80°C保存。一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有非特異性熒光染料SYBR Green I。SYBR Green I是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。沒有與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，其熒光信號(hào)很弱，當(dāng)其與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號(hào)大大增強(qiáng)并能夠被儀器檢測。利用SYBR Gre enI這種特點(diǎn)可以檢測PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物。SYBR Green I的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。SYBR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn)。它能夠與體系中所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此無需為不同的模板特殊定制。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)SYBR Green I染料相結(jié)合，因此靈敏度很高。對仙臺(tái)病毒的定量檢測可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)的常用對數(shù)呈線性關(guān)系(log (起始模板數(shù))=Ct值/斜率+X軸截距)，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣品的起始拷貝數(shù)。一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對仙臺(tái)病毒的基因組的靶片段堿基排列的特殊性，優(yōu)化反應(yīng)體系(引物濃度、擴(kuò)增程序等)，并將FQ-PCR技術(shù)和定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于各種來源的仙臺(tái)病毒樣品的定量檢測。通過優(yōu)化方案，建立了定量檢測仙臺(tái)病毒的方法，并研制出仙臺(tái)病毒定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出lOOcopies以下的病毒基因拷貝數(shù)，檢測范圍可以達(dá)到七個(gè)數(shù)量級(jí)。所述的仙臺(tái)病毒亦稱HVJ (Hemagglutinating virus of Jap — an 的縮寫)，乙型副流感病毒。屬副粘病毒屬。仙臺(tái)病毒是此屬中最早分離到的(M. Kuroya), (1953)。質(zhì)粒為多形態(tài)，直徑150— 600毫微。具包膜，其中含有分子量為6 — 7X10~6的RNA，但不是蛋白質(zhì)合成的模板。不耐熱，幾乎可凝集所有種類的紅血球，而且有溶血性。在雞胚、各種動(dòng)物腎臟培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中增殖。被感染的細(xì)胞株很易引起繼發(fā)感染。因?yàn)榫哂腥诤细鞣N細(xì)胞的能力，所以被廣泛地用來進(jìn)行細(xì)胞的異核體形成和培育雜種細(xì)胞。與新城疫病毒一起也多用于干擾素的誘導(dǎo)。此病毒常存在于小鼠和豬中，另外也從人體中分離到與仙臺(tái)病毒具有交換抗原的病毒(HA2等)。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種熒光定量PCR試劑盒在檢測(抗)仙臺(tái)病毒藥物研究中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程包括下列步驟:A.f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由插入目的片段的pTA2 (購自Τ0Υ0Β0公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI，增殖后提取質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)定量；B.用a) RNA提取液從待測標(biāo)本中提取RNA，然后加b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)反義引物；C.熒光定量PCR由e)引物、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物、g) SYBR Green I實(shí)時(shí)突光定量PCR反應(yīng)液或所提取的標(biāo)本DNA組成，已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測品的突光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機(jī)，用熒光定量檢測儀進(jìn)行FQ-PCR檢測；D.通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值，根據(jù)擬合所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的起始拷貝數(shù)，并以此判斷待測 樣品中是否含有鼠腺病毒。在本發(fā)明中提供的檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒可對各種來源的仙臺(tái)病毒樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，并可對小鼠制品和小鼠細(xì)胞進(jìn)行定量檢測和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行仙臺(tái)病毒引起的嬰幼兒下呼吸道嚴(yán)重疾病及較大兒童的上呼吸道感染的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高靈敏性、高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，直接對PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)施擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確的確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始RNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的核酸定量。2.本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I染料。該染料與雙鏈DNA非特異性結(jié)合，所以檢測靈敏度更高。通過融解曲線的分析可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等影響因素，使結(jié)果更加可靠。使用SYBR Green I染料也降低了引物合成的成本。3.檢測范圍廣，在108-102copies/reaction濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R=0.999)，檢測范圍可以達(dá)到七個(gè)數(shù)量級(jí)，其靈敏度可達(dá)lOOcopies以下。4.該實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主編，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；F.M.奧斯伯等主編，科學(xué)出版社，2005，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南；或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1:一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒組成及其反應(yīng)條件是:A)試劑盒組成如下:(10次反應(yīng)，檢測10份待測樣品)
RNA 提取液 A (4mL/管)RNA 提取液 B (800 μ L/管)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(90 μ L/管) 逆轉(zhuǎn)錄酶(10 μ L/管)RNA 酶抑制劑(400U/ 管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)PCR反應(yīng)管(無菌、無核酸酶)DEPC水(2mL/管)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品，即拷貝數(shù)為108c/r的標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板；

陰性標(biāo)準(zhǔn)品，即未感染鼠腺病毒的L929細(xì)胞(鼠腺病毒的宿主細(xì)胞)DNA ；臨界陽性標(biāo)準(zhǔn)品，即拷貝數(shù)為102c/r的標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板。SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)液(110 μ L/管)(g)SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，購自Bio-rad公司)B) SeV 病毒 RNA 提取:取病毒樣品加1 嫩裂解液40(^1^充分混勻，室溫(20-251:，以下相同)靜置101^11，加入80 μ L氯仿,室溫靜置5min,于4°C、12000rpm離心IOmin,上清液轉(zhuǎn)移到另一支離心管中，加入200 μ L異丙醇，室溫沉淀lOmin，再4°C、12000rpm離心lOmin，緩慢倒出上清，RNA沉淀在室溫下自然干燥，最后加入無RNA酶水30 μ L于60°C、IOmin溶解。C)取B)步所提取的RNA 5 μ L，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(反應(yīng)總體積為25 μ L):5 X buffer 溶液 5 μ L、10 μ mol/L 的反義引物(RT) 2.5 μ L、10mM dNTPs 1.5yL、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑各I μ L、無核酸酶的滅菌雙蒸水9 μ L。反應(yīng)條件如下:cDNA 合成:65°C，5min0°C, 2min37 °C, 50min70°C, IOminD)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物5μ L進(jìn)行凝膠電泳檢測，擴(kuò)增條帶單一，與10XA-attachment Mix混合,于60°C反應(yīng)30min ;再與pTA2載體連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板過夜培養(yǎng)。挑取白斑菌落PCR鑒定陽性后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。次日提取質(zhì)粒，于紫外分光光度計(jì)測A26tl定量，并稀釋至梯度IO8-1O2拷貝/yL，-80°C保存。E)熒光定量PCR試劑盒檢測仙臺(tái)病毒的靈敏度、檢測范圍及穩(wěn)定性取c)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板稀釋至108-102c/r，8個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，加SYBRG reen I 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 反應(yīng)液 2 X iTaq SYBR Green Supermix with R0X10 μ L,正義引物FP和反義引物RT各I μ L，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒模板I μ L，滅菌雙蒸水7 μ L0分別加入對應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測儀上平行做FQ-PCR檢測。反應(yīng)條件如下:FQ-PCR:95 °C，3min95°C, 15s60 °C, 45s40cycles
在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測，檢測波長為518nm。對仙臺(tái)病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的起始拷貝數(shù)。結(jié)果為
權(quán)利要求
1.一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a)RNA提取液、b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d) RNA酶抑制劑、e)引物、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于:引物序列分別為正義引物:5’ -ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反義引物:5’ -CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，擴(kuò)增子大小為142bp，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入仙臺(tái)病毒保守的NP蛋白編碼區(qū)142bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A26tl定量并10倍梯度稀釋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的RNA酶抑制劑提取液是由細(xì)胞裂解液、氯仿、異丙醇、75%質(zhì)量體積比乙醇、滅菌的雙蒸水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)液是由 2X iTaq SYBR Green Supermix UOyM的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板核苷酸序列為:Acctatggtcaacaagagtccgcttttccaggggcaacgagatgctgcagaccctgatacgctccttcaaatctatgggtatccggcatgcctaggggcaattattgtccaggtctggattgtgctggtgaaggcaatcacgo
5.權(quán)利要求1所述的 一種仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測仙臺(tái)病毒藥物中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測仙臺(tái)病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)RNA提取液、b)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液、c)逆轉(zhuǎn)錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物、f)標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板、g)SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于引物序列分別為正義引物5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反義引物5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，擴(kuò)增子大小為142bp，標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA模板由已插入仙臺(tái)病毒保守的NP蛋白編碼區(qū)142bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測A260定量并10倍梯度稀釋。結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測范圍廣。也可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103215381SQ20131013160
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者肖庚富, 張哲 , 鄭從義 申請人:武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)有限公司